Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Het algemene doel van deze procedure is om RNA met hoge zuiverheid uit plantenzaden te extraheren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van graanbiologie, zoals het begrijpen van genprofielen en het bevatten van de originele transcripten in zaden. Het grote voordeel van deze techniek is dat onderzoekers in staat zijn om hoog-gezuiverde RNA te bereiden met een lichte wijziging van de spinkolom-gebaseerde methode.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de hoge hoeveelheid oliën, eiwitten, koolhydraten en polyfenolen in het voorzeef het moeilijk maken om hoog-gezuiverde RNA te isoleren; de procedure zal worden gedemonstreerd door Kazumi Hikino, een technicus uit ons laboratorium. Om het experiment te beginnen, voeg je één procent gewicht per volume moleculaire biologie graad PVP toe aan de cellyse buffer voor RNA extractie, en schudden de mix krachtig. Laat de PVP 20 minuten incuberen bij 25 graden Celsius om het volledig op te lossen.

Na 20 minuten incubatie, meng de buffer voorzichtig door de buis om te draaien om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Oogst vruchten van Arabidopsis thaliana planten en plaats ze in twee 1,5 millimeter polypropyleen buizen op ijs, plaats vervolgens de vruchten op aluminium platen die op vier graden Celsius worden bewaard en isoleer de zaden van de vruchten onder een stereomicroscoop. Plaats vervolgens ongeveer 200 geïsoleerde zaden in 1,5 milliliter polypropyleen buizen die eerder in een aluminium rek op ijs zijn bewaard, en plaats de buizen onmiddellijk in vloeibare stikstof.

Verwijder de buizen uit de vloeibare stikstof en plaats ze terug in het aluminium rek op ijs. Voeg 100 microliter van de één procent PVP buffer toe aan elke buis en centrifugeer de buizen gedurende één minuut bij 1000 keer G, bij vier graden Celsius. Na centrifugatie, homogeniseer het monster met een roestvrijstalen stamper met behulp van een motormolen gedurende 60 seconden terwijl de buis in het aluminium rek op ijs blijft; voeg vervolgens 550 microliter van de 100%PVP buffer toe en draai de buis voorzichtig ondersteboven om te mengen en incubeer de buis.

Na incubatie, centrifugeer de oplossing en breng vervolgens 550 microliter van de supernatant over naar een nieuwe 1,5 millimeter polypropyleen buis en centrifugeer het supernatant. Breng 450 microliter van het supernatant over naar een nieuwe 1,5 millimeter polypropyleen buis. Gebruik het supernatant als de cel lysaat voor RNA extractie met behulp van een commercieel verkrijgbaar kit.

Bereid een aluminium rek op ijs voor en ontdooi de totale RNA mix door zachtjes te tikken, plaats vervolgens de buis op het rek. Meet de RNA concentratie met behulp van een microvolume spectrofotometer. Verdun vervolgens de totale RNA in RNase-vrij water.

Ontdooi de totale RNA en buffer sets van de commerciële kit, bewaar de enzymen uit de kit op ijs na zachtjes te hebben getikt. Bereid gesteriliseerde nuclease vrije 0,2 milliliter polypropyleen buizen voor voor verdere analyse. Op ijs, combineer vijf microliter totale RNA, één microliter of 50 micromolar oligo DT primer en één microliter, of 50 micromolar willekeurige zes-mer in de 0,2 milliliter polypropyleen buis.

Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius, plaats vervolgens de buis op ijs. Pas de plasmide concentraties aan voor DNA templates voor de standaardcurves. Verdun vervolgens de CDNA oplossingen bij één tot 100 met gedistilleerd water, voeg vervolgens twee microliter van de verdunde CDNA oplossingen en de eerder bereide plasmiden voor de standaardcurves toe aan de master mix van de kwantitatieve realtime PCR kit.

Stel ten slotte de realtime PCR in en plaats de monsters. Totale RNA werd geïsoleerd uit ongeveer 1.000 zaden met behulp van verschillende concentraties cellyse buffer, PVP. De hoeveelheden en zuiverheid van de geïsoleerde RNA's tonen aan dat 1,0%PVP de meest effectieve concentratie is om grote hoeveelheden gezuiverde RNA uit zaden te isoleren.

De concentraties, A260 en A280 verhoudingen, en A260 A230 verhoudingen van RNA geïsoleerd uit 200 zaden toonden aan dat deze methode het beste was om hoog-gezuiverde RNA te isoleren uit acht en 12 dagen na bloei, of DAF zaden. Hoewel de hoeveelheden van geplooide één en suikerafhankelijke één transcripten relatief laag zijn in ontwikkelende zaden, was het mogelijk om expressieveranderingen tussen zaden in verschillende ontwikkelingsstadia via realtime PCR te detecteren; deze methode is ook geschikt voor andere olie zaden, zoals aangetoond in deze tabel. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van plantenbiologie om genexpressieprofielen in hoge concentraties van opgeslagen reserves, zoals zaden en vruchten, te verkennen.