Name: Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Leer een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit zaden met hoge zuiverheid voor transcriptoomanalyse. Deze spin-column techniek overwint belemmeringen door oliën, eiwitten en polyphenolen in plantaardig materiaal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken het personeel van Functional Genomics Facility en spectrografie en Bio-imaging Facility, Nibb Core Onderzoeksfaciliteiten en Model Plant Research Facility, Nibb Bioresource Center.

1. Extractie van Totaal RNA van Plant Seeds <ol><li> Bereid buffer sets, spinkolommen, 1,5 en 2,0 ml polypropyleen buizen en nuclease-vrij 1,5 ml polypropyleen buizen. </li><li> Voeg 1% (w / v) moleculaire biologie graad polyvinylpyrrolidon (hierna PVP) met lysisbuffer cel voor RNA-extractie en vortex krachtig. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 ° C tot volledig oplossen. Na 20 min incubatie meng de buffer voorzichtig door de buis ondersteboven om de vorming van bellen te voorkomen. Bewaren bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor gebruik. </li><li> Oogst fruit uit Arabidopsis thaliana planten en plaats in 1,5 ml polypropyleen buizen op ijs. Plaats vruchten op aluminium platen bewaard bij 4 ° C en isoleren zaden uit de vruchten onder een stereomicroscoop. <ol><li> Plaats de zaden geïsoleerd (ongeveer 200 zaden) in 1,5 ml polypropyleen buizen die zijn opgeslagen in een aluminium rek op ijs en onmiddellijk in zijn buizen in vloeibare nitrogen. </li></ol></li><li> Verwijder de buizen uit de vloeibare stikstof en terug te geven aan de aluminium rek op ijs. Voeg 100 pi van de buffer die 1% PVP en centrifugeer gedurende 1 min bij 1000 xg bij 4 ° C. </li><li> Homogeniseren van het monster met een roestvrijstalen stamper met een motor-slijper voor 60 s terwijl de buis in de aluminium rek op ijs. </li><li> Voeg 550 pi van de buffer die 1% PVP, meng de buffer voorzichtig door de buis ondersteboven en incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8000 xg bij 25 ° C en overdracht 550 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml polypropyleen buis. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10.000 xg bij 25 ° C en overdracht 450 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml polypropyleen buis. </li><li> Gebruik het supernatant als het cellysaat voor RNA-extractie. Hierna volgt u de aanwijzingen van de fabrikant beschreven in de handel verkrijgbare kit. </li><li> Elueer deRNA met behulp van een minimaal volume van de elutiebuffer om een ​​voldoende hoge concentratie van RNA te zorgen voor de bewaking van de expressie patronen van de lage niveau transcripten. Bewaar het RNA in een vrieskast tot gebruik. </li></ol> 2. Verificatie van RNA Quality <ol><li> Ontdooi de totale RNA, meng door zachtjes te tikken, en plaats de buis in een aluminium rack op ijs. </li><li> Meet de RNA-concentratie, A260 / A280-verhouding, en A260 / A230-verhouding met behulp van een microvolume spectrofotometer. </li><li> Verdun het totale RNA in RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 70 ng / ul. </li></ol> 3. Reverse transcriptie van totaal RNA van zaden <ol><li> Ontdooi de totale RNA en buffer sets van het commerciële kit. Houd de enzymen uit de kit op ijs na zachtjes te tikken. Bereid nuclease-vrij 0,2 ml polypropyleen buizen. </li><li> Voeg 5 ul totaal RNA, 1 pl Oligo dT primer (50 uM), en 1 pM van willekeurige 6-mer (50 uM) aan de 0,2 ml polypropeenlene buis op ijs. </li><li> Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C en plaats op ijs. </li><li> Hierna volgt u de aanwijzingen van de fabrikant beschreven in de reverse transcriptie-PCR kit. </li><li> Plaats de reverse transcriptie producten op ijs voor gebruik. </li></ol> 4. Kwantitatieve real-time PCR-analyse <ol><li> Construct plasmiden die het doelgen sequenties behulp protocol van de fabrikant. </li><li> Stel de concentraties 100-500,000 kopieën / ul voor DNA-matrijzen voor de standaard curves. </li><li> Verdun de cDNA oplossing (1: 100) met gedestilleerd water. </li><li> Voeg 2 pi van de verdunde oplossingen cDNA en de plasmiden voor de standaard curves de master mix van de kwantitatieve real-time PCR kit. </li><li> Opgericht real-time PCR met de volgende cyclingcondities: 95 ° C gedurende 30 s en vervolgens 40 cycli bij 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 35 s. </li><li> Analyseer de kopie nummers volgens de manbrikant van instructies voor de real-time PCR systeem. </li></ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Genexpressieprofielen bijdragen aan ons begrip van plantenfysiologie; Daarom zijn specifieke RNA isolatiemethoden ontwikkeld voor elk monster staat 9-12. Onderzochten we de processen die tijdens de RNA-isolatie werden geremd uit zaden en vond dat RNA binding aan silica membranen was ernstig geremd. Grote hoeveelheden olie, eiwitten en polyfenolen remmen RNA-isolatie. We pasten de RNA-extractiewerkwijze om deze verbindingen te verwijderen met een lysisoplossing voor het proces van RNA binding aan silica membra...

Planten produceren zaden, die aanleiding geven tot de volgende generatie te geven. Zaden accumuleren van grote hoeveelheden opslagreserves, zoals oliën, koolhydraten en eiwitten, na kiemkracht groei. Mensen maken gebruik van zaad opslag reserves als bron van levensmiddelen en diervoeders, en dus plantenzaden zijn een van de belangrijkste leveranciers van eetbare organische stof wereldwijd. Het verhogen van zaad opbrengst is een belangrijke uitdaging in de plantkunde. Sinds zaad opslag reserves zijn in de handel waardevolle bronnen van voedsel en industriële materialen, hebben de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van het metabolisme van deze reserves op grote schaal onderzocht 1-6. Verder ophelderen van deze mechanismen nuttig zijn voor het verhogen van zaadopbrengst in gewassen. Zaden ontwikkelen fabriek eierstokken na de bevruchting, en ze volwassen worden door middel van een reeks van ontwikkelingsstadia 1,6,7. Verder inzicht in de moleculaire mechanisme onderliggende zaad ontwikkeling vereist gedetailleerdeNauwkeurige genexpressieprofielen van een aantal ontwikkelende zaden te produceren. De grote hoeveelheden van oliën, eiwitten, koolhydraten en polyfenolen in plantenzaden bemoeilijken sterk gezuiverd RNA, dat nauwkeurige profilering van genexpressie uitsluit isoleren. Hier introduceren we een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit oliezaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen. Bij deze methode zal onderzoekers kunnen sterk gezuiverde RNA te bereiden. Dergelijke RNA zal nuttig zijn voor het bewaken van transcriptionele veranderingen in de belangrijkste genen regelen van de metabole regulatie van het zaad opslag reserves in het ontwikkelen en volwassen oliehoudende zaden zijn.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENIZER S-303</td><td>AS ONE</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast qPCR kit</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde rna uit zaden voor gebruik in quantitative analysis transcriptome

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plantenzaden accumuleren grote hoeveelheden opslagreserves die bestaan uit biologisch afbreekbare organische stof. Mensen zijn afhankelijk van de opslagreserves van zaden voor voedsel en als industriële materialen. Genexpressieprofielen zijn krachtige hulpmiddelen voor het onderzoeken van metabole regulatie in plantencellen. Daarom zijn gedetailleerde, nauwkeurige genexpressieprofielen tijdens de ontwikkeling van zaden noodzakelijk voor gewasveredeling. Het verkrijgen van hoog gezuiverde RNA is essentieel voor het produceren van deze profielen. Efficiënte methoden zijn nodig om hoog gezuiverd RNA uit zaden te isoleren. Hier beschrijven we een methode voor het isoleren van RNA uit zaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op de isolatie van hoog-zuiverheid RNA. Onze methode maakt het mogelijk om hoog gezuiverd RNA uit zaden te verkrijgen zonder het gebruik van fenol, chloroform of aanvullende processen voor RNA-zuivering. Deze methode is toepasbaar op Arabidopsis-, koolzaad- en sojazaden. Onze methode zal nuttig zijn voor het monitoren van de expressiepatronen van laagwaardige transcripten in ontwikkelende en volwassen zaden.

We hebben eerst onderzoek gedaan naar de optimale concentratie van PVP gebruik van Arabidopsis rijpe zaden. Totaal RNA werd geïsoleerd uit ongeveer 1000 zaden volgens bovenstaande behulp cellysis buffer die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% of 2,0% PVP beschreven protocol. Na homogenisatie en centrifugatie werd het supernatant verzameld met vermijding van de olielaag en zaden afval (Figuur 1A). <img alt="Figuur 1"...

We zijn erin geslaagd een methode te ontwikkelen voor RNA-isolatie uit plantenzaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op RNA-isolatie met hoge zuiverheid. Onze methode is geschikt voor het monitoren van de expressie van genen met transcripten op laag niveau in zaden.

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA met hoge zuiverheid uit plantenzaden te extraheren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van graanbiologie, zoals het begrijpen van genprofielen en het bevatten van de originele transcripten in zaden. Het grote voordeel van deze techniek is dat onderzoekers in staat zijn om hoog-gezuiverde RNA te bereiden met een lichte wijziging van de spinkolom-gebaseerde methode.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de hoge hoeveelheid oliën, eiwitten, koolhydraten en polyfenolen in het voorzeef het moeilijk maken om hoog-gezuiverde RNA te isoleren; de procedure zal worden gedemonstreerd door Kazumi Hikino, een technicus uit ons laboratorium. Om het experiment te beginnen, voeg je één procent gewicht per volume moleculaire biologie graad PVP toe aan de cellyse buffer voor RNA extractie, en schudden de mix krachtig. Laat de PVP 20 minuten incuberen bij 25 graden Celsius om het volledig op te lossen.Na 20 minuten incubatie, meng de buffer voorzichtig door de buis om te draaien om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Oogst vruchten van Arabidopsis thaliana p

an-efficient-method-for-isolation-highly-purified-rna-from-seeds-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Een methode voor transcriptome profilering van granen wordt gepresenteerd. De op microarray gebaseerde genexpressieprofilering begint met de isolatie van hoogwaardig totaal RNA uit granen en gaat verder met de generatie van cDNA. Na cRNA-etikettering en microarray hybridisatie worden aanbevelingen gedaan voor signaaldetectie en kwaliteitscontrole.

Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering

Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Dit protocol beschrijft een methode voor eukaryote polysoomzuivering van intacte sojabonenknobbels. Na sequencing kunnen standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te identificeren.

Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

We beschrijven een eenvoudige maar zeer reproduceerbare methode om extracellulair RNA te isoleren van het bladoppervlak en de apoplast van Arabidopsis-planten.

Een stapsgewijze handleiding voor de isolatie en analyse van bladoppervlak en apoplastisch RNA met behulp van Arabidopsis-rozetten

Dit protocol maakt een eerste kwaliteitscontrole mogelijk voor RNA-seq-experimenten voor wet-lab biologen met beperkte bio-informatica-ervaring.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Kwaliteitscontrole voor bulk RNA-seq-experimenten in eukaryoten

Leer een efficiënte methode voor RNA-isolatie uit zaden met hoge zuiverheid voor transcriptoomanalyse. Deze spin-column techniek overwint belemmeringen door oliën, eiwitten en polyphenolen in plantaardig materiaal.

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Meer video's verkennen