CyVerse Resources gebruiken voor De Novo Vergelijkende transcriptomics van onderverdiende (niet-model) organismen
9 mei 2017
Dit protocol schetst een vergelijkende de novo transcriptoomsamenstelling en annotatiestroom voor beginnende bioinformatici. De workflow is volledig gratis beschikbaar via CyVerse en verbonden door de Data Store. Er worden opdrachtregel- en grafische gebruikersinterfaces gebruikt, maar alle benodigde code is beschikbaar om te kopiëren en te plakken.
Het algemene doel van deze procedure is om differentiële genexpressie te beoordelen, te verzamelen, te annoteren en te vergelijken door middel van De Novo transcriptomics, beginnend vanaf ruwe FASTQ-bestanden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in vergelijkende en moleculaire biologie, inclusief welke transcripten zich in een organisme bevinden, wat die transcripten doen in die organismen, en wat de verschillen zijn tussen experimentele omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een interactieve omgeving biedt.
Het biedt op aanvraag computationele bronnen en het stelt onderzoekers in staat om onmiddellijk hun RNA-Seq-gegevens te analyseren. Deze methode is vooral nuttig voor onderzoekers die experimenten vergelijken binnen een enkel organisme dat meerdere weefsels, omstandigheden, tijdstippen omvat om te begrijpen hoe biologische systemen veranderen. Deze methode is gericht op niet-modelorganismen zonder genomen, maar kan ook worden toegepast op organismen met beschikbare genoomassemblages, zelfs die met tienduizenden of honderdduizenden van scaffols in hun assemblage.
Om te beginnen, krijg toegang tot Atmosphere in de Discovery Environment. Vraag een gratis CyVerse-account aan door naar de registratiepagina te gaan. Gebruik een institutioneel e-mailadres om u voor het account te registreren.
Ga vervolgens naar het tabblad apps en services en vraag toegang tot Atmosphere aan. Toegang tot de Discovery Environment wordt automatisch verleend. Meld u aan bij de Discovery Environment, afgekort als DE. Selecteer vervolgens het tabblad Gegevens om een menu te openen met alle mappen in de gegevensopslag.
Maak een hoofdprojectmap die alle gegevens geassocieerd met het project zal huisvesten. Zoek de werkbalk bovenaan het gegevensvenster en selecteer Bestand, Nieuwe map. Gebruik geen spaties of speciale tekens in de mappennamen of namen van invoer-uitvoerbestanden.
Gebruik in plaats daarvan underscores of streepjes waar dat gepast is. Upload ruwe FASTQ-sequentiebestanden en de map, 1_Raw_Sequence, in een submap getiteld Folder A_Raw_Reads. Voor bestanden onder twee gigabits, gebruik de eenvoudige uploadfunctie van de gegevensopslag om naar de werkbalk van het gegevensvenster te navigeren door op de knop Gegevens in het hoofd-DE-bureaublad te klikken.
Selecteer Upload, Eenvoudige upload vanaf bureaublad. Selecteer vervolgens de knop Bladeren om naar de ruwe FASTQ-sequencingbestanden op de lokale computer te navigeren. Beoordeel geüploade ruwe sequencing reads met behulp van de FastQC-app in de DE. Selecteer de knop Apps op het hoofd-DE-bureaublad om een venster te openen met alle analyse-apps die beschikbaar zijn in de DE. Zoek in het venster naar de FastQC-tool in de zoekbalk bovenaan het venster.
Open de multi-bestandsversie als er meer dan één FASTQ-bestand is. Selecteer Bestand en maak een nieuwe map, selecteer vervolgens deze map als de uitvoermap. Laad de FASTQ-leesbestanden in het toolvenster genaamd Selecteer invoergegevens en selecteer Lanceren analyse.
Zoek naar de programmeerbare Trimmomatic-app in de DE en open deze. Upload de map met ruwe FASTQ-leesbestanden in de instellingensectie. Selecteer of de sequencingbestanden enkel of gepaard zijn.
Gebruik het standaard controlebestand door de knop Bladeren te selecteren en het bestandspad in het weergavevak te plakken. Selecteer het Trimmomatic-controlebestand en start de analyse. Voor kwaliteitstrimmen van sequentieleeswaarden, zoek en open de Sickle-app in de DE. Selecteer de bijgesneden FASTQ-leeswaarden als invoerwaarden en hernoem uitvoerbestanden.
Neem kwaliteitsinstellingen op in de opties. Open de meest recente versie van de Atmosphere-instantie door naar de wiki-pagina te navigeren. Selecteer de link voor de meest recente versie van de Trinity en Trinotate-afbeelding.
Selecteer de knop Aanmelden om te lanceren en geef vervolgens de naam van de Atmosphere-instantie op. Selecteer een instantiegrootte van medium3 of large3. Start de instantie en wacht tot deze is gebouwd.
Als een Atmosphere-afbeelding niet kan worden gestart, kunt u proberen een kleinere instantie aan te vragen of u kunt een aanvraag indienen bij Jetstream voor een grotere toewijzing. Alle details staan op de begeleidende wiki. Verplaats de Trinity-uitvoerbestanden naar de map, 3_Assembly, in de DE en label de map, A_Trinity_de_novo_assembly.
Het uitvoeren van Trinity vereist kennis van de opdrachtregel en kan enkele dagen of mogelijk weken duren om grote analyses te voltooien. Er zijn gratis bronnen beschikbaar die op de wiki zijn gelinkt om de opdrachtregel te begrijpen. Geef elk geassembleerd transcriptome een submap binnen de A_Trinity_de_novo_assembly-map.
Gebruik unieke namen inclusief de wetenschappelijke namen van organismen en behandelingen geassocieerd met elk transcriptome, maak vervolgens een andere submap genaamd Folder B_rnaQUAT_Output in de 3_Assembly-map. Open de app genaamd De Novo rnaQUAST. Noem de analyse en selecteer Folder B_rnaQUAST_Output als de uitvoermap.
Zoek naar transcript decoder en voer transdecoder uit op het De Novo Trinity Assembly-uitvoerfasta-bestand in de Discovery Environment. Open de deseq2-app in de DE. Noem de analyse en selecteer de uitvoermap als 4_Differential_Expresssion. Selecteer in het gedeelte Invoer het tellenstabellenbestand van de Trinity Assembly-run.
Selecteer ook de kolom waar de contig-namen te vinden zijn. Voer de kolomkoppen in van het tellingsgegevenstabelbestand om te bepalen welke kolommen worden vergeleken. Gebruik komma's tussen elk van de voorwaarden.
Sluit de eerste kolomkop die de contig-namen bevat niet in. Voor replica's, herhaal dezelfde naam. Geef in de tweede regel de namen van de twee voorwaarden op die moeten worden vergeleken.
Match de kolomkopnamen die in de eerste regel zijn opgegeven. Hier is een systematische vergelijking van sequencing reads na elke voorverwerkingsstap weergegeven. Na het trimmen zou de read minder scheve GC-inhoud en sequentie-inhoud moeten hebben en een groter aandeel moeten hebben van reads met een hoge kwaliteitsscore.
Hoge kwaliteit reads zijn noodzakelijk om De Novo transcriptomes samen te stellen. Resultaten van fast QC zijn afhankelijk van de organismen en monsters die worden gesequenced. Door uniformiteit over alle monsters die downstream zullen worden vergeleken, is het primaire doel van het voorverwerken van reads.
rnaQUAST gebruikt boost-code om samenvattende
Overzicht
Dit protocol beschrijft een workflow voor de novo transcriptoomassemblage en annotatie, ontworpen voor beginnende bio-informatici. Het biedt een interactieve omgeving voor het analyseren van RNA-Seq-data, toegankelijk via CyVerse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Bioinformatica
- Vergelijkende biologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Focus op niet-modelorganismen zonder genomen.
- Toepasbaar op organismen met beschikbare genoomassemblages.
- Biedt een oplossing voor de analyse van differentiële genexpressie.
- Maakt gebruik van opdrachtregels en grafische interfaces.
Doel van de studie
- Om genexpressie te beoordelen en te vergelijken via transcriptomica.
- Om biologische systemen onder verschillende condities te begrijpen.
- Om een gestructureerde aanpak te bieden voor beginnende onderzoekers.
Gebruikte methoden
- Toegang tot CyVerse en de Discovery Environment.
- Uploaden en verwerken van ruwe FASTQ-bestanden.
- Gebruiken van tools zoals FastQC, Trimmomatic en DESeq2.
- Uitvoeren van assemblage met Trinity en rnaQUAST.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde kwaliteit van sequencing-reads na post-processing.
- Gestructureerde output voor differentiële expressieanalyse.
- Interactieve omgeving die onmiddellijke data-analyse faciliteert.
Conclusies
- Biedt een uitgebreide workflow voor transcriptoomanalyse.
- Verbetert het begrip van genexpressie onder verschillende condities.
- Toegankelijke bronnen voor beginnende bio-informatici.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze workflow stelt biofarmaceutische R&D-teams in staat om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te genereren uit niet-modelorganismen, wat doelwitvalidatie in onvoldoende onderzochte biologische systemen ondersteunt. Door een interactieve, cloudgebaseerde omgeving te bieden voor de novo assemblage en differentiële expressieanalyse, worden de barrières voor mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase verlaagd. De benadering vergroot het voorspellend vertrouwen bij het bestuderen van organisme-specifieke reacties op experimentele perturbaties, wat bijdraagt aan de prioritering van de portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in niet-modelorganismen die geen referentiegenomenen hebben.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets via annotatie van differentieel tot expressie gebrachte genen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biologisch risicobeheer door genetische reacties op experimentele condities te verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde transcriptoomassemblages voor betrouwbare downstream functionele analyse.
- Operationele waarde: Genereert kwantitatieve telgegevens die geschikt zijn voor de reproduceerbaarheid van assays en vergelijkingen tussen verschillende condities.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van cloudbronnen om grote RNA-Seq-datasets te verwerken zonder belasting van de lokale infrastructuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt transcriptomische inzichten uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via functionele annotatie.
- Afstemming van Biomarkers: Maakt de identificatie mogelijk van conditiespecifieke genen met potentieel als translationele biomarkers.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door geconserveerde of divergente padactivaties bloot te leggen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces en ondersteunt het testen van hypothesen en het verduidelijken van signaalpaden voordat er wordt gestart met de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing mogelijk door paarsgewijze vergelijking van transcriptomische toestanden over verschillende experimentele condities.
- Screening: Levert assay-klare transcriptoomassemblages met gekwantificeerde expressieniveaus voor de gereedheid van compound-screening.
- Analytiek: Biedt outputs van differentiële expressie en functionele annotaties waarmee teams biologische responsen kunnen vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door expressieveranderingen te koppelen aan geannoteerde genfuncties en signaalpaden.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbare cloudgebaseerde functionaliteit voor transcriptomische analyse over meerdere projecten en organismen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in niet-modelorganismen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gestructureerde, versiebeheerde workflows op CyVerse.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle, kosteloze toegang tot geavanceerde computationele middelen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door het leveren van bruikbare inzichten in organisme-specifieke biologische responsen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basiskennis van command-line interfaces en de verwerking van RNA-Seq-gegevens.
- Is afhankelijk van toegang tot de CyVerse Discovery Environment en Atmosphere voor computationele uitvoering.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft bestandsnamen, mappenorganisatie en versiebeheer.
- Omvat aanpassingen voor diverse niet-modelorganismen met variërende genoomcomplexiteit en beschikbaarheid van annotaties.
- Beperkt tot paarsgewijze vergelijkingen; niet geschikt voor multifactoriële experimentele ontwerpen zonder aanpassing van de workflow.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Set Up the Project, Upload Raw Sequencing Reads, and Assess Reads Using FastQC
3:31
Trim and Quality Filter Raw Reads to Yield High Quality Sequence
4:32
De Novo Transcriptome Assembly Using Trinity in Atmosphere
6:42
Pairwise Differential Expression Using DESeq2 in the DE
7:38
Results: FastQC and rnaQUAST Reports
9:24
Conclusion
