Name: Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Leer hoe je metabolisme meet in gesorteerde subpopulaties van complexe celgemeenschappen met stabiele isotopen en massaspectrometrie. Deze methode onthult metabole verschillen en samenwerking tussen celtypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Anas Kamleh bedanken voor de waardevolle hulp bij het optimaliseren van massaspectrometrie methoden, en Annika von Vollenhoven voor hulp bij celsortering. Dit onderzoek werd ondersteund door de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek (subsidie nr. FFL12-0220) en het Strategisch Programma voor Kankeronderzoek (IR, RN); de Zweedse Hart-Long Stichting (CEW, HG); en de Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. Metabolite Extraction <ol><li> Extractie uit schotel <ol><li> Kweekcellen in een 6-wells plaat in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen (serum of andere groeisupplementen) tot cellen 75% confluent. OPMERKING: Hier kweek HeLa cellen gedurende 48 uur in RPMI dat 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine en 5% gedialyseerd FBS (foetaal runderserum). Gedialyseerd FBS wordt gebruikt om zich te ontdoen van de kleine moleculair gewicht metabolieten die de gelabelde media kunnen besmetten. Het kweken van cellen in aanvulling gedialyseerd voorafgaand aan de werkelijke experiment wordt aanbevolen om te verzekeren cellen worden normaal groeien in het medium. Supplementen worden gedialyseerd in 0,15 M NaCl-oplossing &#39;s nachts met behulp van snake skin dialyse tubing. </li><li> Op de dag van de winning teruggooi cultuur media, spoel putten tweemaal met 500 pi koude HBSS en dan gooi hem weg. LET OP: Hier gebruiken HBSS met 40% U-13 C-glucose omdat het ook in het kweekmedium. </li><li> Voeg 600 ul 100% methanol voorgekoeld op droog ijs. </li><li> Breng het gerecht om ijs te drogen en verwijder celmateriaal met een cel schraper. </li><li> pipet voorzichtig de celextracten aan een microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C tot massaspectrometrie analyse. </li></ol></li><li> Extractie van mock gesorteerde cellen <ol><li> Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in stabiele isotoop gelabelde kweekmedia + gedialyseerd supplementen. OPMERKING: Hier kweek HeLa cellen gedurende 48 h in 100 mm schaal omdat een groot aantal cellen (4 x 10 ~ 6) nodig zijn gesorteerd 500.000 cellen te verkrijgen. Dit aantal HeLa-cellen extract gehouden is de meting van metabolieten te verkrijgen. De gebruikte kweekmedia was RPMI dat 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-glutamine en 5% gedialyseerd FBS. </li><li> Op de dag van de winning, de teruggooi cultuur media, spoel putten wide 1,5 ml warm HBSS en dan gooi hem weg. </li><li> Los cellen door toevoeging van 1,5 ml trypsine / EDTA gedurende 4 min bij 37 ° C. De volgende stappen van 4 ° C of op ijs. </li><li> Deactiveren trypsine door het toevoegen van 3 ml ijskoude HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution) + gedialyseerd supplement. </li><li> Verzamel cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 750 xg gedurende 3 min. </li><li> Resuspendeer de pellet in HBSS + gedialyseerd supplement + 1 mM EDTA bij een concentratie van 1-2 x 10 6 cellen / ml, passeren 40 urn cel zeven tot enkele cellen te verkrijgen en over te dragen aan een 5 ml buis. </li><li> Soort cellen door celsortering gating alleen singlets en centrifugeer gesorteerd cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C. LET OP: Hier soort HeLa-cellen met een snelheid 1.000 evenementen / s, met een instrument druk 27 psi, en met behulp van een 100 urn mondstuk. HeLa-cellen zijn groot, dus ze moeten worden gesorteerd in een traag tempo evenement en grote sproeier zo intact pellet mogelijk te krijgen. Houd de cellen in koud blokken throughout sorteren om het metabolisme te verminderen. Een grondige beschrijving van het sorteren procedure is eerder 12 beschreven. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoud dH 2 O tot een homogeen pellet te verkrijgen voor het toevoegen van methanol. Toevoeging van koude methanol rechtstreeks pellet vormt een stevige pellet die moeilijk te mengen. </li><li> Extract metabolieten door de toevoeging van 540 ul methanol in droog ijs gehouden en houden extracten bij -80 ° C tot vloeistofchromatografie - hoge resolutie massaspectrometrie (LC-HRMS) analyse. </li></ol></li><li> Extractie van de celcyclus gesorteerde cellen <ol><li> Kweekcellen in een 100 mm schaal in drievoud in kweekmedium + gedialyseerd supplementen. LET OP: Hier kweek HeLa-cellen die Geminin Fucci Green (MAG1-hGem) sonde 13 die het mogelijk maakt voor het sorteren van de G1 (negatief) en SG2M (positief) cellen. Cellen kunnen worden gekweekt in stabiele isotoop opsporen media voor eens lang als nodig. Hier hebben we ze gekweekt gedurende 46 uur in ongelabelde media, dan hebben we naar RPMI dat 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamine 2 uur voor het begin sortering. Dit werd gedaan om te kunnen de celcyclus fasen korte puls labeling vereist bestuderen. </li><li> Op de dag van de winning, de teruggooi cultuur media, spoel putten met 1,5 ml warm HBSS en dan gooi hem weg. </li><li> Los cellen door toevoeging van 1,5 ml trypsine / EDTA gedurende 4 min bij 37 ° C. De volgende stappen van 4 ° C of op ijs. </li><li> Deactiveren trypsine door het toevoegen van 3 ml ijskoude HBSS + gedialyseerd supplement. </li><li> Verzamel cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 750 xg gedurende 3 min. </li><li> Resuspendeer de pellet in HBSS + gedialyseerd supplement + 1 mM EDTA bij een concentratie van 1-2 x 10 6 cellen / ml, passeren 40 urn cel zeven tot enkele cellen te verkrijgen en over te dragen aan een 5 ml buis. </li><li> Sorteren cellen door de cel sorter gAting puin en wambuizen, dan gating voor de cel merker van interesse, en centrifugeer gesorteerd cellen bij 750 g gedurende 3 min bij 4 ° C. LET OP: Hier soort HeLa-cellen met een snelheid 1.000 evenementen / s, met een instrument druk 27 psi, en met behulp van een 100 urn mondstuk. Houd de cellen in koud blokken gedurende het sorteren van de stofwisseling te verlagen. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul ijskoud dH 2 O tot een homogeen pellet te verkrijgen voor het toevoegen van methanol. Toevoeging van koude methanol rechtstreeks pellet vormt een stevige pellet die moeilijk te mengen. </li><li> Extraheer de metabolieten door toevoeging van 540 pi methanol in droogijs gehouden en houdt extracten bij -80 ° C totdat LC-HRMS analyse. </li></ol></li></ol> 2. massaspectrometrie Analyse Let op: Hier het protocol beschrijven we voor het analyseren van celextracten op een LC-HRMS systeem. Elke metabolomics voor de analyse van celextracten worden gebruikt. Volledige scananalyse kan nuttig zijn voor het detecteren van een groot aantal metabolieten. <ol><li> Kalibreren van het instrument met behulp van een massaspectrometrie referentiekalibratie mix. </li><li> Dooi celextracten op ijs gedurende 30 min en vortex gedurende 15 s. </li><li> Breng 100 pi van het celextract op een spin filter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Injecteer 12,5 pl van het filtraat op de LC-HRMS systeem. </li><li> Afzonderlijke metabolieten met een zwitterionen Hydrofiele Interactie vloeistofchromatografie (ZIC-HILIC) kolom (150 mm x 4,6 mm, 5 urn deeltjesgrootte) voorzien van een ZIC-HILIC voorkolom (20 mm x 2,1 mm) met een gradiënt elutie van 0,1% mieren- zuur in water (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B). Start de gradiëntelutie van 20% oplosmiddel A en verhogen tot 80% in 17 min. Handhaaf dit percentage gedurende 4 minuten met een stroomsnelheid van 400 pL min -1 en kolomtemperatuur en monsterblad bij 23 ° C en 4 ° C. </li><li> Gebruik een instrument gekoppeld aan de chromatografische scheiding van metabolieten detectie verwarmd elektrospray (H-ESI II) in zowel positieve als negatieve modes ionisatiebron, en een volledige scan acquisitiemodus met een massa oplossend vermogen van 70.000 volle breedte half maximum (FWHM) ( m / z 200). </li><li> Gebruik stikstof (zuiverheid&gt; 99,995%) van het omhulsel gas en hulpgas met een debiet van 45 en 10 au (arbitraire eenheden) en stel verdampertemperatuur bij 350 ° C en de electrospray spanning op 4 kV positieve modus -3,5 kV in negatieve mode. </li></ol> 3. Gegevensanalyse <ol><li> Selecteer een aantal metabolieten waarvoor normen beschikbaar zijn en die laten zien een goede kwaliteit pieken in de monsters. Goede kwaliteit pieken hoge signaal-ruisverhouding. Het is belangrijk om te verifiëren piek kwaliteit en zorg valse isotopen te omvatten. Isotoop pieken die verschillen in vorm en / of retentietijd waarschijnlijk vals. </li><li> Voor-isotoop gelabelde monsters te berekenen massa isotopomeer (MI) fracties van het piekoppervlak van elk MI delen met totale piekoppervlak van alle MI. </li><li> Bereken de gelabelde koolstof / stikstof fracties verrijking van 13 C en 15 N, respectievelijk, zoals <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> waarbij n het totale aantal koolstofatomen (of stikstofatomen, respectievelijk) in de metaboliet en MIx is de MI fractie van x. Opmerking: Alle berekeningen worden uitgevoerd onder toepassing programmeertalen. </li></ol>

<ol><li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li>
<li>Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://cancerres.aacrjournals.org/content/44/6/2259">Tumor heterogeneity.</a> Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).</li>
<li>Prat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cell+lines+derived+from+breast+cancers+and+normal+mammary+tissues+for+the+study+of+the+intrinsic+molecular+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes.</a> Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).</li>
<li>Magistretti, P. J., Allaman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Perspective+on+Brain+Energy+Metabolism+and+Functional+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging.</a> Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).</li>
<li>Angelini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+dendritic+cells+provide+the+reducing+extracellular+microenvironment+required+for+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).</li>
<li>Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metabolic+pathways+between+cancer+cells+and+stromal+cells+in+colorectal+carcinomas%3A+A+metabolic+survival+role+for+tumor-associated+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma.</a> Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).</li>
<li>Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiles+of+human+immunodeficiency+virus+infected+CD4%2B+T+cells+and+macrophages+using+LC-MS%2FMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis.</a> Virology. 415 (2), 153-159 (2011).</li>
<li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+FACS+perturb+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).</li>
<li>Moussaieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metabolic+mapping+of+cell+types+in+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).</li>
<li>Johnson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+of+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature of colon cancer initiating cells.</a> Cancer Metab. 2, 32(2014).</li>
<li>Roci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+Profiling+and+Stable+Isotope+Tracing+in+Sorted+Subpopulations+of+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).</li>
<li>Shapiro, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+H+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , Wiley-Liss. New York. (2003).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Noack, S., Wiechert, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24708998">Quantitative metabolomics: A phantom.</a> Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze werkwijze is gebaseerd op het principe dat MID in cellulaire metabolieten weerspiegelen de &quot;geschiedenis&quot; van metabolische activiteiten van een cel. Dit maakt het mogelijk om metabolische activiteiten onderzoeken subpopulatie van cellen, zoals ze zich in het complex door cellen, vóór de celsortering procedure. In tegenstelling piekoppervlakken van metabolieten verschillen sterk tussen de extracten van gesorteerde cellen en directe extractie uit de cultuur schotel 11. Voor een deel ...

Hogere organismen bevatten complexe gemeenschappen van verschillende celtypen die samenwerken om meer complexe functies te brengen. Bijvoorbeeld tumoren bevatten niet alleen kankercellen, maar ook fibroblasten, cellen die bloedvaten vormen, vaak immuuncel infiltraten 1; bloed bevat een complex mengsel van tientallen immuuncel subtypen 2; en zelfs gekweekte cellijnen kunnen bestaan uit meerdere subpopulaties, zoals de luminale en basale subtypes van borstkankercellen 3. Bovendien verschillende celtypen die naast elkaar kunnen metabole &quot;samenwerken&quot; vertonen. Bijvoorbeeld in de hersenen, astrocyten worden verondersteld om glucose om te zetten naar lactaat, die vervolgens &quot;gevoed&quot; neuronen die dit substraat 4 oxideren; T-lymfocyten zijn in sommige contexten afhankelijk aangrenzende dendritische cellen als een bron van cysteïne 5; en kankercellen kunnen samenwerken met assobehorende fibroblasten in tumoren 6. De metabolische gedrag van dergelijke systemen te begrijpen, is het noodzakelijk te scheiden en meten van de metabolische activiteiten van de verschillende celtypen aanwezig. Verreweg de meest gebruikte methode voor het scheiden van celtypes is fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze werkwijze is breed toepasbaar, mits het celtype of de toestand van belang kan worden &quot;gemerkt&quot; met fluorescerende antilichamen expressie van fluorescente proteïnen, of andere kleurstoffen. Een optie is om in eerste instantie een aparte cellen types door middel van een cel sorter, re-cultuur van de afzonderlijke celtypen verkregen, en vervolgens uit te voeren onderzoek naar het metabolisme van deze culturen 7. Dit is echter alleen mogelijk als het type cel of fenotype stabiel in kweekomstandigheden, en kan transient gedrag vangen zoals celcyclus staten, noch de metabolische samenwerking in co-culturen. Voor dergelijke gevallen moet de stofwisseling direct worden gemeten, zodatrted cellen. Dit is een uitdaging, omdat de celsortering procedure onderwerpt cellen om de spanningen die hun metabolisme 8 kunnen verstoren, en we zijn ons bewust van de weinige studies die deze aanpak 9, 10. In het bijzonder hebben wij gevonden dat belangrijke metabolieten zoals aminozuren kunnen lekken uit cellen in celsortering buffer gehouden, zodat metingen van absolute metaboliet abundantie niet meer betrouwbaar 11 (hoewel relatieve vergelijking tussen gesorteerde fracties nog steeds waardevol kan zijn). Om deze problemen te omzeilen, We noemen cellen met stabiele isotopen uit te sorteren, en focus op de MID in cellulaire metabolieten, plaats metaboliet abundanties. Sinds MID&#39;s worden gevormd over langere tijdschalen, moeten ze minder worden beïnvloed door kortdurende blootstelling aan het sorteren van omstandigheden. We kwantificeren MID&#39;s met behulp van full-scan met hoge resolutie massaspectrometrie, die gevoelig genoeg is om da te biedenta op honderden metabolieten vanaf ongeveer 500.000 gesorteerde cellen, die ongeveer 30-60 min van celsortering tijd. Een vergelijking tussen een &quot;mock gesorteerd&quot; controle (cellen doorgegeven via de celsorteerinrichting instrument zonder gating specifieke populatie) en metaboliet extractie direct uit de kweekschaal wordt nagegaan of de waargenomen MID representatief zijn voor die welke in het oorspronkelijke cultuur. Afhankelijk van de keuze van stabiele isotopen kunnen diverse metabole pathways bestudeerd worden met deze methode.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-13C-Glucose</td><td>Cambridge isotopes</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-Glutamine</td><td>Cambridge isotopes</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (JT Baker), HPLC grade</td><td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3,000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6&nbsp;mm, 5 &micro;m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20 mm x 2.1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Geproduceerd met een Milli-Q Gradient systeem</td></tr><tr><td>Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 Screw Vial 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, amber, 100 units</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packing 8-425 (Screw caps)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>Calibratie kit</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td><td>Wolfram Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een methode voor het meten metabolisme in gesorteerde subpopulaties van complex cell gemeenschappen met behulp van stabiele isotoop tracing

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Zoogdiercelltypen vertonen gespecialiseerd metabolisme, en er is voldoende bewijs dat verschillende naast elkaar bestaande celtypen betrokken zijn bij metabolische samenwerking. Bovendien kunnen zelfs culturen van een enkel celtype cellen bevatten in verschillende metabolische toestanden, zoals rustende of cyclische cellen. Methoden om de metabolische activiteiten van dergelijke subpopulaties te meten, zijn waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van cellulair metabolisme. Complexe celpopulaties worden meestal gescheiden met behulp van een celsorteerder, en subpopulaties die door deze methode zijn geïsoleerd, kunnen worden geanalyseerd met metabolomics-methoden. Een probleem met deze aanpak is echter dat de celsorteringsprocedure cellen onderwerpt aan stress die hun metabolisme kan verstoren.
Om deze problemen te overwinnen, redeneerden we dat de massa-isotopomerverdelingen (MIDs) van metabolieten uit cellen gekweekt met stabiel isotoop-gelabelde voedingsstoffen waarschijnlijk stabieler zijn dan absolute metabolietconcentraties, omdat MIDs worden gevormd over langere tijdschalen en minder zouden worden beïnvloed door kortetermijnblootstelling aan celsorteringscondities. Hier beschrijven we een methode gebaseerd op dit principe, die celsortering combineert met vloeistofchromatografie-hoog resolutie massaspectrometrie (LC-HRMS). De procedure omvat het analyseren van drie soorten monsters: (1) metaboliete extracten verkregen direct uit de complexe populatie; (2) extracten van 'mock sorted' cellen die door het celsorteerder-instrument zijn gepasseerd zonder enige specifieke populatie te scheiden; en (3) extracten van de daadwerkelijk gesorteerd populaties. De mock sorted cellen worden vergeleken met directe extractie om te verifiëren dat MIDs inderdaad niet worden gewijzigd door de celsorteringsprocedure zelf, voorafgaand aan het analyseren van de daadwerkelijke gesorteerd populaties. We tonen voorbeeldresultaten van HeLa-cellen gesorteerd volgens celcyclusfase, die veranderingen in nucleotidemetabolisme onthullen.

Als voorbeeld beschrijven we een experiment onderzoek naar het metabolisme van HeLa cellen gesorteerd volgens celcyclus fase. Een groot aantal centrale metabolieten zowel koolstofatomen en stikstofatomen labelen we gekweekte cellen gedurende 48 uur met gebruik van U-13C-glucose en U- 13 C, 15 N-glutamine als tracers. Rijke MID voor validatieproef verkrijgen we hier gekozen voor een mengsel van 40% U- 13 C-glucose en 70% U- 13 C, <sup...

Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van cellulair metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen, met behulp van een combinatie van stabiel isotooptracering, celsortering om specifieke celtypen te isoleren en massaspectrometrie.

Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Het algemene doel van deze methode is om isotooptracering te gebruiken om het metabolisme van gesorteerd geordende populaties van complexe celgemeenschappen te meten. Dus met deze methode kunnen we de metabolische verschillen tussen subpopulaties van complexe celgemeenschappen bestuderen, en ook de metabolische samenwerking tussen die subpopulaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat door isotooptracering te combineren met celsortering, we een betrouwbaardere meting van het metabolisme kunnen krijgen, en we ook kunnen valideren hoe betrouwbaar de methode is.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het verschillende technieken combineert, en de manier waarop cellen worden behandeld en de lengte van de procedure kunnen het celmetabolisme beïnvloeden. Voor metabolietenextractie uit een schaal, eerst cellen kweken in een zes-putten plaat in stabiel isotoop gelabeld kweekmedium met gedialyseerde supplementen. Wanneer de cellen 75%confluency bereiken, spoel de putten twee keer met 500 microliters koud HBSS met uniform gelabelde glucose.Voeg vervolgens 600 microliters van 100%droog ijs gekoelde methanol toe aan elke put, en breng de plaat over naar het droogijs. Gebruik een celschraper om de cellen los te maken en breng vervolgens de extracten van elke put voorzichtig over in individuele microcentrifugebuizen. Bewaar cellen op min 80 graden Celsius tot massaspectrometrie analyse.Voor metabolietenextractie van gesorteerd geordende cellen, kweken cellen in een 100 millimeter schaal in gelabeld kweekmedium met gedialyseerde supplementen, zodat ze 75%confluency bereiken op de sorteerdag. Voor pulse labeling van celcyclus gesorteerd geordende cellen, kweek de cellen in ongelabeld medium met gedialyseerde supplementen tot ze 75%confluency bereiken. Label vervolgens de cellen gedurende twee uur door het medium te vervangen door vers gelabeld kweekmedium.Spoel de schaal met warm HBSS met uniform gelabelde glucose, en detacheer de cellen met 1,5 milliliters trypsin EDTA op 37 graden Celsius. Na vier minuten, deactiveer de trypsin met drie milliliters ijs koud HBSS met gelabelde glucose en gedialyseerde supplementen, en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie. Resuspendeer het pellet in HBSS met gelabelde glucose, gedialyseerde supplementen en EDTA bij een concentratie van een tot twee maal 10 tot de zes cellen per milliliter, en filter de cellen door een 40-micron zeef om een enkele cel suspensie te verkrijgen.Breng de cellen over in een vijf milliliter buis en sorteer ze op een flowcytometer. Voor metabolietenextractie uit mock gesorteerd geordende cellen, verwijder het puin en sorteer alleen de singletten. Voor metabolietenextractie uit celcyclus gesorteerd geordende cellen, verwijder het puin en doubletten, en sorteer cellen in G1 en SG2M, gebaseerd op de geminin sonde fluorescentie.Aan het einde van de sorteer, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 50 microliters ijs koud gedestilleerd water om een homogeen pellet te verkrijgen. Extraheer vervolgens snel de metabolieten door 540 microliters droogijs gekoelde methanol toe te voegen. Bewaar het monster op min 80 graden Celsius tot LCMS analyse.De extractie van metabolieten uit gesorteerd geordende cellen moet goed van tevoren worden gepland, met experimenteel werk dat zo snel mogelijk wordt voltooid om metabolische veranderingen te minimaliseren. Voor analyse van de geëxtraheerde metabolieten, selecteer eerst een aantal metabolieten met overeenkomstige beschikbare standaarden die goede kwaliteit monsters pieken vertonen. Vervolgens, verifieer de kwaliteit van de pieken, zorg ervoor dat geen valse isotopen worden opgenomen.Bereken de massaisotoop uit onze fracties voor de isotoop gelabelde monsters door de piekoppervlakte van elke massaisotoop uit onze fractie te delen door de totale piekoppervlakte van alle massaisotopen uit onze fracties. Bereken vervolgens de gelabelde koolstoffracties voor de verrijking van koolstof-13 met behulp van de formule voor koolstofverrijking. Bereken tenslotte de gelabelde stikstoffracties voor de verrijking van stikstof-15 met behulp van de formule voor stikstofverrijking.In dit representatieve experiment waren 66 metabolieten geselecteerd uit de dataanalyse aanwezig in de mock gesorteerd geordende cellen, waarvan 60 met een vergelijkbare massaisotoop gelabeld leken te zijn uit onze verdelingen tussen de schaalextracten en de mock gesorteerd geordende cellen. Bijvoorbeeld, de massaisotoop uit onze verdeling van glutamaat is vergelijkbaar tussen de schaal en mock gesorteerd extracten, wat aangeeft dat de glutamaat massaisotoop uit onze verdeling ook betrouwbaar is in gesorteerd geordende celpopulaties. Analyse van HELA cellen gesorteerd in G0, G1 of SG2M celcyclusfasen met behulp van de FUCCI geminin sonde onthult cytidine labelen in beide populaties met een hogere verrijking in de SG2M fase, consistent met een verhoogde de novo synthese van nucleotiden tijdens de S fase.In dit experiment vertoonde de massaisotoop uit onze verdeling hetzelfde patroon in beide celcyclus gesorteerd geordende fracties, wat suggereert dat dezelfde syntheseroute wordt gebruikt, maar actiever is in de SG2M fase, wat aantoont dat metabolische verschillen gemakkelijk detecteerbaar zijn door deze methode, zelfs tussen nauw verwante subpopulaties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u metabolieten uit gesorteerd geordende fracties kunt extraheren, en de waarschuwingen begrijpen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen snel moeten worden behandeld tijdens het sorteren en metabolietenextractie, aangezien de manier en de duur waarop cellen worden behandeld hun metabolisme kunnen beïnvloeden.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vijf uur worden uitgevoerd. Deze procedure kan worden toegepast op andere celtypen. Bijvoorbeeld, immuuncel subsets in bloed, of verschillende soorten cellen binnen een tumor, met behulp van een verscheidenheid aan sondes, antilichamen of kleuringsmethoden voor sortering.

a-method-for-measuring-metabolism-sorted-subpopulations-complex-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Stabiel isotopische profilering door middel van gaschromatografie massaspectrometrische analyse van intermediaire metabole flux wordt beschreven in de...

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren

De actieve bacteriegemeenschappen geassocieerd met de darm van Spodoptera littoralis, werd bepaald door stabiele-isotoop probing (SIP) gekoppeld pyrosequencing. Met behulp van deze methodiek, de identificatie van de metabolisch actieve bacteriën soorten binnen de gemeenschap werd gedaan met een hoge resolutie en nauwkeurigheid.

Identificatie van metabool actieve bacteriën in de darm van de Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Stabiele Isotopen Onderzoek naar gebruik van<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Het vetzuur trofische marker aanpak, dat wil zeggen, de assimilatie van vetzuren als hele molecuul en transfer in consument weefsel met geen of een kleine wijziging, wordt gehinderd door lacunes in de kennis in de vetzuurstofwisseling van kleine bodem-ongewervelde dieren. Isotopologue profilering wordt geleverd als een waardevol instrument te ontwarren trofische interacties.

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.

Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen

Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH), ook bekend als mid-infrarood fototherme-FISH (MIP-FISH), om individuele cellen te identificeren en hun metabolisme te begrijpen. Deze methodologie kan breed worden toegepast voor diverse toepassingen, waaronder het in kaart brengen van het cellulaire metabolisme met een resolutie van één cel.

Optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH)

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

Leer hoe je metabolisme meet in gesorteerde subpopulaties van complexe celgemeenschappen met stabiele isotopen en massaspectrometrie. Deze methode onthult metabole verschillen en samenwerking tussen celtypen.

Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing (Video) | JoVE Journal

Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing

Meer video's verkennen