Een methode voor het meten Metabolisme in gesorteerde subpopulaties van Complex Cell Gemeenschappen Met behulp van stabiele isotoop Tracing
4 februari 2017
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van cellulair metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen, met behulp van een combinatie van stabiel isotooptracering, celsortering om specifieke celtypen te isoleren en massaspectrometrie.
Het algemene doel van deze methode is om isotooptracering te gebruiken om het metabolisme van gesorteerd geordende populaties van complexe celgemeenschappen te meten. Dus met deze methode kunnen we de metabolische verschillen tussen subpopulaties van complexe celgemeenschappen bestuderen, en ook de metabolische samenwerking tussen die subpopulaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat door isotooptracering te combineren met celsortering, we een betrouwbaardere meting van het metabolisme kunnen krijgen, en we ook kunnen valideren hoe betrouwbaar de methode is.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het verschillende technieken combineert, en de manier waarop cellen worden behandeld en de lengte van de procedure kunnen het celmetabolisme beïnvloeden. Voor metabolietenextractie uit een schaal, eerst cellen kweken in een zes-putten plaat in stabiel isotoop gelabeld kweekmedium met gedialyseerde supplementen. Wanneer de cellen 75%confluency bereiken, spoel de putten twee keer met 500 microliters koud HBSS met uniform gelabelde glucose.
Voeg vervolgens 600 microliters van 100%droog ijs gekoelde methanol toe aan elke put, en breng de plaat over naar het droogijs. Gebruik een celschraper om de cellen los te maken en breng vervolgens de extracten van elke put voorzichtig over in individuele microcentrifugebuizen. Bewaar cellen op min 80 graden Celsius tot massaspectrometrie analyse.
Voor metabolietenextractie van gesorteerd geordende cellen, kweken cellen in een 100 millimeter schaal in gelabeld kweekmedium met gedialyseerde supplementen, zodat ze 75%confluency bereiken op de sorteerdag. Voor pulse labeling van celcyclus gesorteerd geordende cellen, kweek de cellen in ongelabeld medium met gedialyseerde supplementen tot ze 75%confluency bereiken. Label vervolgens de cellen gedurende twee uur door het medium te vervangen door vers gelabeld kweekmedium.
Spoel de schaal met warm HBSS met uniform gelabelde glucose, en detacheer de cellen met 1,5 milliliters trypsin EDTA op 37 graden Celsius. Na vier minuten, deactiveer de trypsin met drie milliliters ijs koud HBSS met gelabelde glucose en gedialyseerde supplementen, en breng de cellen over naar een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie. Resuspendeer het pellet in HBSS met gelabelde glucose, gedialyseerde supplementen en EDTA bij een concentratie van een tot twee maal 10 tot de zes cellen per milliliter, en filter de cellen door een 40-micron zeef om een enkele cel suspensie te verkrijgen.
Breng de cellen over in een vijf milliliter buis en sorteer ze op een flowcytometer. Voor metabolietenextractie uit mock gesorteerd geordende cellen, verwijder het puin en sorteer alleen de singletten. Voor metabolietenextractie uit celcyclus gesorteerd geordende cellen, verwijder het puin en doubletten, en sorteer cellen in G1 en SG2M, gebaseerd op de geminin sonde fluorescentie.
Aan het einde van de sorteer, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 50 microliters ijs koud gedestilleerd water om een homogeen pellet te verkrijgen. Extraheer vervolgens snel de metabolieten door 540 microliters droogijs gekoelde methanol toe te voegen. Bewaar het monster op min 80 graden Celsius tot LCMS analyse.
De extractie van metabolieten uit gesorteerd geordende cellen moet goed van tevoren worden gepland, met experimenteel werk dat zo snel mogelijk wordt voltooid om metabolische veranderingen te minimaliseren. Voor analyse van de geëxtraheerde metabolieten, selecteer eerst een aantal metabolieten met overeenkomstige beschikbare standaarden die goede kwaliteit monsters pieken vertonen. Vervolgens, verifieer de kwaliteit van de pieken, zorg ervoor dat geen valse isotopen worden opgenomen.
Bereken de massaisotoop uit onze fracties voor de isotoop gelabelde monsters door de piekoppervlakte van elke massaisotoop uit onze fractie te delen door de totale piekoppervlakte van alle massaisotopen uit onze fracties. Bereken vervolgens de gelabelde koolstoffracties voor de verrijking van koolstof-13 met behulp van de formule voor koolstofverrijking. Bereken tenslotte de gelabelde stikstoffracties voor de verrijking van stikstof-15 met behulp van de formule voor stikstofverrijking.
In dit representatieve experiment waren 66 metabolieten geselecteerd uit de dataanalyse aanwezig in de mock gesorteerd geordende cellen, waarvan 60 met een vergelijkbare massaisotoop gelabeld leken te zijn uit onze verdelingen tussen de schaalextracten en de mock gesorteerd geordende cellen. Bijvoorbeeld, de massaisotoop uit onze verdeling van glutamaat is vergelijkbaar tussen de schaal en mock gesorteerd extracten, wat aangeeft dat de glutamaat massaisotoop uit onze verdeling ook betrouwbaar is in gesorteerd geordende celpopulaties. Analyse van HELA cellen gesorteerd in G0, G1 of SG2M celcyclusfasen met behulp van de FUCCI geminin sonde onthult cytidine labelen in beide populaties met een hogere verrijking in de SG2M fase, consistent met een verhoogde de novo synthese van nucleotiden tijdens de S fase.
In dit experiment vertoonde de massaisotoop uit onze verdeling hetzelfde patroon in beide celcyclus gesorteerd geordende fracties, wat suggereert dat dezelfde syntheseroute wordt gebruikt, maar actiever is in de SG2M fase, wat aantoont dat metabolische verschillen gemakkelijk detecteerbaar zijn door deze methode, zelfs tussen nauw verwante subpopulaties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u metabolieten uit gesorteerd geordende fracties kunt extraheren, en de waarschuwingen begrijpen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen snel moeten worden behandeld tijdens het sorteren en metabolietenextractie, aangezien de manier en de duur waarop cellen worden behandeld hun metabolisme kunnen beïnvloeden.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vijf uur worden uitgevoerd. Deze procedure kan worden toegepast op andere celtypen. Bijvoorbeeld, immuuncel subsets in bloed, of verschillende soorten cellen binnen een tumor, met behulp van een verscheidenheid aan sondes, antilichamen of kleuringsmethoden voor sortering.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van cellulair metabolisme in complexe gemeenschappen van meerdere celtypen. De techniek combineert stabiel isotooptracering, celsortering en massaspectrometrie om metabolische verschillen en samenwerkingen tussen subpopulaties te analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulair metabolisme
- Isotooptracering
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van metabolisme in complexe celgemeenschappen is cruciaal voor verschillende biologische studies.
- Isotooptracering maakt een gedetailleerde analyse van metabolische paden mogelijk.
- Celsortering helpt bij het isoleren van specifieke celtypen voor nauwkeurigere metingen.
- Massaspectrometrie biedt gevoelige detectie van metabolieten.
Doel van de studie
- Om het metabolisme van gesorteerd populaties binnen complexe celgemeenschappen te meten.
- Om metabolische verschillen tussen subpopulaties te onderzoeken.
- Om metabolische samenwerkingen tussen verschillende celtypen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Kweek cellen in stabiel isotoop gelabeld medium.
- Sorteer specifieke celtypen met behulp van celsorteringstechnieken.
- Gebruik massaspectrometrie voor metabolietenanalyse.
- Valideer de betrouwbaarheid van de methode door middel van visuele demonstraties.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterd begrip van metabolische verschillen in celsubpopulaties.
- Aangetoonde samenwerking in metabolisme tussen verschillende celtypen.
- Valideerde de betrouwbaarheid van de gecombineerde methode.
- Biedt een visueel raamwerk voor de procedure en de impact ervan op het celmetabolisme.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste benadering voor het bestuderen van cellulair metabolisme.
- Combineren van isotooptracering met celsortering levert betrouwbare metabolische gegevens op.
- Deze techniek kan worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden die complexe celinteracties omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
