Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen
24 maart 2017
We beschrijven de isolatie van de extracellulaire matrix van het hart van C57Bl/6J controlemuizen, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide. We beschrijven ook de vasodilatatiestudies op de geïsoleerde vaten van C57Bl/6J, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide.
Het algemene doel van deze procedures voor isolatie van extracellulair matrix en ex vivo vasodilatatie is om de behandeling met IRF5 remmende peptide bij knaagdieren te bestuderen. Deze methode kan helpen beantwoorden hoe veranderingen in de extracellulaire matrix de progressie van ziekten kunnen vergroten of verminderen. Het belangrijkste voordeel van de vasodilatatiestudies is dat het ons inzicht geeft in in vivo processen zonder dat we alle signaalcomponenten in overweging hoeven te nemen.
De isolatie van cardiaal extracellulair matrix kan worden toegepast op andere organen zoals de achterpoot of long. We hadden het idee eerst toen we ons begonnen te richten op de duplicatie van fibrillin een in de tight skin muis, en herkenden de impact van veranderd extracellulair matrix en celgedrag. Na het anestheseren van de muis en het voorbereiden op de operatie, open de huid met een schaar.
Snijd vanaf de borst tot aan de kaakboog met de zorg om het onderliggende weefsel aan de voorkant van de kaak niet te verstoren. Snijd vervolgens de fascialis-slagader door het zachte weefsel eromheen te verwijderen. Wees voorzichtig om de ader niet te beschadigen tijdens het doen hiervan.
Dompel het blootgestelde weefsel in mops buffer zodat ze gezond blijven. Zodra de fascialis-slagader volledig is blootgelegd, grijpt u de fascialis proximal van de eerste bifurcatie distaal van waar de ader zal worden doorgesneden. Snijd het vervolgens los van de hoofdader en pak de fascialis-slagader met de pincet vast.
Snijd de twee takken die van de fascialis afkomt en til het vat vervolgens voorzichtig op terwijl u de verbindingen met omliggend weefsel doorknipt totdat de bifurcatie is bereikt. Snijd bij de bifurcatie beide dochter-slagaders door om het vat te bevrijden en breng het over in een schaal met mops buffer waar het gehydrateerd blijft tot het nodig is. Om vasodilatatie te meten, bereidt u zich eerst voor om de vaten te canuleer.
Laad glazen pipetten met een einddiameter van 125 tot 175 microns vol met mops buffer. Vul ook de oplossingsreservoirs met mops. Canuleer nu de geïsoleerde vaten.
Bind ze vast aan glazen pipetten met behulp van een oogheelkundige naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipetten ontstaan. Monteer vervolgens de vaatkamers op een omgekeerde microscoop met de videocamera-aansluiting.
Stuur de video door het videokaliber meetsysteem voor een schermmeting van de vaten. Druk nu de vaten aan met een tweedelige procedure. Verhoog eerst de met mops gevulde reservoirs op een hoogte boven het vat voor 20 millimeter kwikdruk.
Open de lijn met de mops naar het vat. Kijk tijdens het drukken van het vat naar tekenen van lekken rond de knopen en langs de lengte van het vat. Als er geen lekken worden gevonden, verhoog de reservoirs om 60 millimeter kwikdruk te produceren.
Inspecteer de vaten vervolgens opnieuw op lekken. Zodra de druk wordt gehandhaafd zonder lekken, brengt u het vat gedurende 30 minuten in evenwicht bij deze druk. Na het in evenwicht brengen, meet u de vasodilatatie als reactie op een verbinding van belang.
Vernauw eerst het vat met de helft tot drie kwart door U46619 toe te voegen. Laat de oplossing zes minuten lang de vaten baden om te stabiliseren. Voeg vervolgens geleidelijk het testcompound toe aan de badoplossing zoals acetylcholine.
Elke twee minuten verhoogt u de concentratie van de testoplossing in het bad met 10, beginnend bij 000001 molair en toenemend tot 001 molair. De veranderingen in vasodilatatie riepen vragen op over signalering. Maar onze focus ligt op het hart.
Om het gebruik van dieren te verminderen, kozen we ervoor om cardiaal extracellulair matrix te isoleren om ons te concentreren op de signalering die van buitenaf wordt geïnitieerd. Begin met het verzamelen van het hart van een verdoofde muis. Breng het over naar een beker geladen met 15 milliliter hypertone 1 procent natriumdodecylsulfaat.
Houd de oplossing gedurende 18 uur zachtjes roerend op een roerplaat bij kamertemperatuur. Verander de volgende dag de oplossing naar 15 milliliter 5 procent triton X100 gedurende 30 minuten gevolgd door 15 milliliter PBS gedurende 15 minuten. Snap vervolgens het ECM en vloeibare stikstof in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje in.
Eenmaal bevroren, brengt u het weefsel over in een voorgekoelde vijzel en stampt het tot poeder. Suspensie de poeder in PBS met toegevoegd antibioticum in een 1:100 concentratie in een viskeuze oplossing. Soniceer de suspensie gedurende 30 tot 60 seconden in een ijsbad op een hoge sonicatie-instelling.
ECM-eiwit is nu geïsoleerd en moet koud blijven. Voordat u het eiwit gebruikt, meet u de concentratie ervan met behulp van een Bradford-assay. Het IRF5D-peptide is een remmend peptide dat sterk verschilt van normaal IRF5.
IRF5D heeft slechts 17 aminozuren en bindt aan de fosforylatieplaats van IRF5. Dit voorkomt fosforylering en homodimerisatie, waardoor de vorming van de actieve IRF5-toestand wordt verstoord. Heterozygote tight skin muizen werden gedurende drie weken subcutaan behandeld met IRF5D.
Het aantal neutrofielen en CD64 nam af, zoals bepaald door immunohistochemie in het gemiddelde aantal gekleurde cellen per gezichtsveld. IRF5D-behandelingen verbeterden acetylcholine-geïnduceerde vasodilatatie van fascialis-slagaders bij heterozygote tight skin muizen die werden behandeld met IRF5D in vergelijking met die behandeld met fosfaatbuffer. In gekweekte myocyten afgeleid van het hartweefsel van de transgene muizen waren er meer IRF5-positieve cellen in culturen van tight skin heterozygote muizen dan in controle muizen.
Behandeling van een van beide culturen met IRF5D resulteerde in een vermindering van IRF5-positieve kernen. Nadat u deze video hebt bekeken, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een hart kunt decellulariseren. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden overgedragen naar veel organen en helpen bij het beantwoorden van een verscheidenheid
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de isolatie van de cardiale extracellulaire matrix uit diverse muismodellen en de daaropvolgende vasodilatatiestudies. De focus ligt op het begrijpen van de effecten van behandeling met een IRF5-remmend peptide op de progressie van de ziekte.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Cardiovasculaire biologie
- Onderzoek naar de extracellulaire matrix
Achtergrond
- De isolatie van de extracellulaire matrix is cruciaal voor het bestuderen van de rol ervan bij ziekten.
- IRF5 is betrokken bij de progressie van bepaalde ziekten.
- Tight-skin muizen vertonen veranderde eigenschappen van de extracellulaire matrix.
- Vasodilatatiestudies geven inzicht in de vasculaire functie.
Doel van het onderzoek
- Het isoleren van de cardiale extracellulaire matrix voor verdere analyse.
- Het evalueren van de impact van het IRF5-remmende peptide op vasculaire responsen.
- Het begrijpen van hoe veranderingen in de extracellulaire matrix de ziekteprogressie beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Isolatie van de cardiale extracellulaire matrix uit muismodellen.
- Ex vivo vasodilatatiestudies op geïsoleerde vaten.
- Vergelijking van responsen tussen controlemuizen en behandelde muizen.
- Chirurgische preparatie van muizen voor matrixisolatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van de extracellulaire matrix van het hart uit verschillende muizenstammen.
- Vasodilatatieresponsen varieerden tussen de controlegroep en muizen behandeld met IRF5-peptide.
- Verkregen inzichten in de rol van de extracellulaire matrix bij de vasculaire functie.
- Potentiële toepassingen van de isolatiemethode op andere organen.
Conclusies
- De studie benadrukt het belang van de extracellulaire matrix voor de cardiovasculaire gezondheid.
- Behandeling met een IRF5-remmend peptide is veelbelovend voor het modificeren van vasculaire reacties.
- Verder onderzoek is nodig om de implicaties voor ziektebehandeling te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode maakt mechanistische risicoreductie van IRF5 als therapeutisch doelwit mogelijk door remodeling van de extracellulaire matrix te koppelen aan vasculaire dysfunctie bij inflammatoire fibrose. De ex vivo vasodilatatie-assay biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van de endotheelfunctie, onafhankelijk van systemische storende factoren, wat de doelwitvalidatie in preklinische modellen ondersteunt. Isolatie van ziekterelateerde extracellulaire matrix faciliteert fenotypische screening en pathway-verduidelijking voor de ontdekking van antifibrotische geneesmiddelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese dat IRF5-inhibitie de pro-inflammatoire signalering en de depositie van de extracellulaire matrix bij tight-skin-muizen vermindert.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door de meting van de nucleaire translocatie van IRF5 en de downstream ICAM-expressie in cardiale myocyten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het aantonen van een verbeterde endotheliale vasodilatatie als functionele biomarker van target-engagement.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Geïsoleerde cardiale extracellulaire matrix biedt een gestandaardiseerd, ziekterellevant systeem voor het evalueren van de effecten van verbindingen op celgedrag en signalering.
- Kwantitatieve output: Ex vivo vasodilatatiemetingen met behulp van acetylcholine dosis-respons curven maken een nauwkeurige beoordeling van de endotheelfunctie in geïsoleerde facialis-arteriën mogelijk.
- Hergebruik van platform: Het ECM-isolatieprotocol kan worden overgebracht naar het achterpoten-, long- of andere vasculaire bedden om cross-organ target-validatie te ondersteunen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Maakt gebruik van het tight-skin muismodel, dat fibrose en vasculaire dysfunctie vertoont die analoog zijn aan menselijke sclerodermie.
- Translationele continuïteit: Verbindt IRF5-inhibitie met verminderde veranderingen in de extracellulaire matrix en verbeterde vasodilatatie, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoreductie voor klinische translatie.
- Nut van het preklinische model: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door een target-gemedieerde verbetering van de vasculaire functie aan te tonen na chronische subcutane dosering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling van de werkzaamheid, wat het iteratieve ontwerp van IRF5-modulerende verbindingen mogelijk maakt op basis van vasculaire en matrixfenotypen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de extracellulaire matrix te isoleren om outside-in signaling te bestuderen die IRF5-activatie en pro-inflammatoire responsen aanstuurt.
- Screening: Levert assay-klare vasculaire weefsels met reproduceerbare vasodilatatie-responsen voor het evalueren van de potentie en selectiviteit van verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (veranderingen in vatdiameter) en statistische outputs (EC50, vasodilatatie %) om behandelingseffecten tussen groepen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire target-engagement (nucleaire reductie van IRF5) met uitkomsten op weefselniveau (ECM-remodellering) en functionele verbetering (vasodilatatie) in een ziekte-relevant systeem.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het bestuderen van interacties tussen de extracellulaire matrix en het vasculair systeem in meerdere orgaansystemen en ziekteverschijningsvormen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door vasculaire functie te isoleren van systemische variabelen, wat het vertrouwen in relaties tussen target en ziekte vergroot.
- Operationele waarde: Standaardiseert procedures voor vasodilatatie en ECM-isolatie, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert en crossfunctionele samenwerking mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door target-inhibitie te koppelen aan functionele vasculaire uitkomsten, waardoor biologische risico's in een laat stadium bij fibroseprogramma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van IRF5-gerichte therapieën mogelijk op basis van aangetoonde verbetering in endotheliale functie en matrixhomeostase.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microvasculaire dissectie, drukmyografie en biochemie van de extracellulaire matrix.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder videocalipersystemen, omgekeerde microscopen en drukreservoirs voor vasodilatatiestudies.
- Necessiteert standaardisatie van weefselverwerking, buffersamenstelling (MOPS) en contractieprotocollen (U46619 pre-constrictie) om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van ECM-isolatie op niet-cardiale weefsels, inclusief optimalisatie van decellularisatieragentia (SDS, Triton X-100) en de tijdsduur.
- Praktische beperking: De fragiliteit van het geïsoleerde endotheel vereist een nauwkeurige techniek om mechanische schade tijdens vaten canulatie en onderdrukking te voorkomen.
