Name: Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer vasodilatatie van geïsoleerde vaten en isolatie van extracellulaire matrix uit tight-skin muizen. Deze methode onderzoekt het effect van IRF5-remmende peptiden op vasculaire functie en ziekteprogressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) en HL-102836 (KAP) en Cimphoni Life Sciences (onderdeel van DW-salaris). De auteurs danken Meghann Sytsma voor het bewerken van het manuscript.

<ol><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).</li>
<li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li>
<li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Genet%22%5BJournal%5D)">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li>
<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
<li>Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+in+human+autoimmunity+and+murine+models+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease.</a> Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).</li>
<li>Mayes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochip+analysis+identifies+multiple+susceptibility+Loci+for+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).</li>
<li>Dimitroulas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-and+Macrovascular+Treatment+Targets+in+Scleroderma+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease.</a> Curr Pharm Des. , (2013).</li>
<li>Botstein, G. R., LeRoy, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+heart+disease+in+systemic+sclerosis+%28scleroderma%29%3A+advances+in+clinical+and+pathologic+features%2C+pathogenesis%2C+and+new+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches.</a> Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).</li>
<li>Oram, S., Stokes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+scleroderma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Heart+J%22%5BJournal%5D)">The heart in scleroderma.</a> Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046(2012).</li>
<li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Rheumatol.Rep%22%5BJournal%5D)">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li>
<li>Deshpande, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCSB+Protein+Data+Bank%3A+a+redesigned+query+system+and+relational+database+based+on+the+mmCIF+schema%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema.</a> Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Matthew, A. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/drug-discovery/p97058-current-biosensor-technologies-in-drug-discovery-summer-06.html">Current biosensor technologies in drug discovery.</a> Drug Discovery. , 69(2006).</li>
<li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+MED-SuMo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li>
<li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
<li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+phage+display+technology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li>
<li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li>
<li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C+5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
<li>Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoy%2C+S+%22Autoimmune+Disorders+-+Pathogenetic+Aspects%22">Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects</a>. Mavragani, C. , 35(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het doel was om een ​​IRF5 remmer te ontwerpen om de rol van IRF5 op ontsteking, fibrose, en vasculaire functie in de harten van Tsk / + muizen helderen. De bevindingen zijn dat IRF5D geen proliferatie of apoptose induceerde. Bovendien werd inflammatie verminderd en vasculaire functie verbeterd. Deze gegevens suggereren dat IRF5 speelt een belangrijke mechanistische rol in de ontwikkeling van ontsteking en fibrose in het hart van Tsk / + muizen en dat het de potentie om te dienen als een therapeutisch doelwit. <p cl...

<html> Regulatie van celgroei en celdood immuunresponsen staat centraal in de rol van de transcriptiefactor familie van interferon regulerende factoren. IRF5 staat aangegeven als cruciaal voor de regulatie van immuunresponsen tussen type 1, een inflammatoire respons stimuleren en type 2, een immuunreactie gericht weefselherstel. IRF5 is belangrijk bij kanker 1, en autoimmuniteit 2, 3, 4, 5. De strakke huid muis (Tsk / +) is een model voor weefsel fibrose en sclerodermie als gevolg van een verdubbeling mutatie in het fibrillin-1-gen. Deze mutatie resulteert in een strakke huid en een toename van bindweefsel. Deze muizen ontwikkelen myocardiale ontsteking, fibrose en uiteindelijk hartfalen 5, 6, 7,&gt; 8, 9. Scleroderma is een auto-fibrotische aandoening die ongeveer 150.000 patiënten in de Verenigde Staten 6. De kenmerken van deze ziekte fibrose van organen zoals het hart 7, 8, 9, 10, 11. De aard van de studie eiste het ontwerp van een remmend peptide. De software aanpak werd verkozen boven een traditionele benadering waarbij een faagdisplay. De software benadering is eenvoudiger en minder tijdrovend. De RCSB databank wordt gebruikt om geschikte bindingsplaatsen 12 identificeren. De interactie van de nieuw ontworpen peptide met het recombinante eiwit te bestuderen en te focussen op de binding parameters, werd een techniek genaamd biolayer interferometrie gebruikt. Biolayer interferometrie is een biosensor gebaseerd techniqUE die bepaalt bindingsaffiniteit, vereniging en dissociatie met behulp van een biosensor en een bindend monster. De biosensor kan fluorescent, luminescent, radiometrisch en colorimetrisch gelabeld. De meting is gebaseerd op massa toevoeging of depletie lijkt associatie en dissociatie 13, 14. Het doel van deze studie was de rol van IRF5 myocardiale ontsteking en fibrose begrijpen. Het doel was om inzicht te krijgen in de rol van IRF5 in de ontwikkeling van weefsel fibrose en sclerodermie.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensors</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrate</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenylindole)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>1:1.000 verdunning in PBS</td></tr><tr><td>donkey anti rat Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>1:1.000 verdunning in PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Na veel proef en fout kwamen we terug bij deze</td></tr><tr><td>Eclipse TE 200-U microscoop met EZ C1 laser scanning software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>1:1.000 verdunning in PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-goat</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10.000 verdunning in TBS</td></tr><tr><td>HRP donkey anti-mouse</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>1:10.000 verdunning in TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>1:200 verdunning in PBS</td></tr><tr><td>IRF5 antibody (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Micro plate reader Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP neutrofiel marker</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>1:200 verdunning in PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>eiwit-eiwit binding</td></tr><tr><td>Peptide design&nbsp; Medit SA software</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IRF5 eiwitsynthese</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>eiwitexpressie, syntheseservice</td></tr><tr><td>natriumdodecylfosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergens</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Apotheek</td><td></td><td>Schedule III gecontroleerde stof, recept vereist&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5X-45X trinoculaire dissecerende zoom stereomicroscoop met Gooseneck LED-verlichting</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Desalting Columns</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endotheel Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>kit bevat groeisupplementen</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp;Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatatie van geïsoleerde schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van tight-skin muizen

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Het interferon regulator factor 5 (IRF5) is cruciaal voor cellen om te bepalen of ze op een pro-inflammatoire of anti-inflammatoire manier reageren. IRF5's vermogen om cellen van de ene naar de andere route te schakelen, is zeer aantrekkelijk als therapeutisch doelwit. We ontwierpen een decoy-peptide IRF5D met een moleculair modelleringssoftware voor het ontwerpen van kleine moleculen en peptiden.
IRF5D remde IRF5, verminderde veranderingen in de extracellulaire matrix en verbeterde endothèle vasodilatatie bij de tight-skin muis (Tsk/+). De Kd van IRF5D voor recombinant IRF5 is 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, zoals bepaald door bindingsexperimenten met behulp van biolayer interferometrie experimenten. Proliferatie en apoptose van endotheelcellen (EC) veranderden niet bij gebruik van toenemende concentraties IRF5D (0 tot 100 µg/mL, 24 uur). Tsk/+ muizen werden behandeld met IRF5D (1 mg/kg/d subcutaan, 21 dagen). IRF5 en ICAM expressies waren verminderd na behandeling met IRF5D. Endotheelfunctie was verbeterd, zoals beoordeeld door vasodilatatie van facialis slagaders van Tsk/+ muizen behandeld met IRF5D vergeleken met Tsk/+ muizen zonder IRF5D behandeling. Als transcriptiefactor, verplaatst IRF5 zich van het cytosol naar de kern. Translocatie werd beoordeeld door immunohistochemie op cardiale myocyten gekweekt op de verschillende extracellulaire matrices van het hart. Behandeling van de Tsk/+ muis met IRF5D resulteerde in een verminderd aantal IRF5-positieve kernen in vergelijking met dieren zonder IRF5D behandeling (50 µg/mL, 24 uur). Deze bevindingen tonen de belangrijke rol die IRF5 speelt in ontsteking en fibrose bij Tsk/+ muizen.

De resultaten aangetoond in figuur 1 zien hoe een peptide ontwerpen. Figuur 1, linksboven toont het gebied (tussen de 2 gele pijlen, aminozuren (aa) 425-436) in IRF5 dat wordt gefosforyleerd door een aantal kinasen. Figuur 1, rechtsboven, toont een gele ovaal, waar gefosforyleerd domein IRF5&#39;s bindt. De dimere structuur van 3DSH werd gedraaid om een ​​gespleten of de vallei aan de linkerkant van de Helix 2 (aa303-312) in acht nemen. ...

We beschrijven de isolatie van de extracellulaire matrix van het hart van C57Bl/6J controlemuizen, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide. We beschrijven ook de vasodilatatiestudies op de geïsoleerde vaten van C57Bl/6J, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide.

Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Het algemene doel van deze procedures voor de isolatie van de extracellulaire matrix en ex vivo vasodilatatie is het bestuderen van de behandeling met het IRF5-remmende peptide bij knaagdieren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de vraag hoe veranderingen in de extracellulaire matrix de progressie van een ziekte kunnen versterken of verminderen. Het belangrijkste voordeel van de vasodilatiestudies is dat ze ons inzicht geven in in vivo processen zonder dat alle signaalcomponenten in overweging genomen hoeven te worden.De isolatie van de extracellulaire matrix van het hart kan worden toegepast op andere organen, zoals de achterpoot of de long. We kregen dit idee toen we ons begonnen te richten op de duplicatie van fibrilline 1 in de tight skin-muis en de impact van een veranderde extracellulaire matrix en celgedrag erkenden. Nadat de muis is geanestheseerd en is voorbereid voor de operatie, opent u de huid met een schaar.Snijd voorzichtig van de borst naar de zijkant van het kaakbeen, waarbij u erop let dat het onderliggende weefsel aan de voorzijde van de kaak niet wordt verstoord. Dissecteer vervolgens de arteria fascialis door het omliggende zachte weefsel te verwijderen. Wees hierbij voorzichtig om beschadiging van de slagader te voorkomen.Bad het blootgelegde weefsel in MOPS-buffer om de vitaliteit te behouden. Zodra de arteria fascialis volledig is blootgelegd, grijpt u de arteria fascialis proximaal van de eerste bifurcatie, distaal van de plek waar de arterie zal worden doorgesneden. Snijd deze vervolgens los van de moederarterie en houd de arteria fascialis vast met de pincet.Knip de twee takken die van de fascialis aftakken af en til het vat vervolgens voorzichtig op terwijl de verbindingen met het omliggende weefsel worden doorgesneden totdat de bifurcatie is bereikt. Knip bij de bifurcatie beide dochterarteriën door om het vat vrij te maken en breng het over naar een schaal met mops-buffer, waar het gehydrateerd blijft tot het nodig is. Om vaatverwijding te meten, dient u eerst voorbereidingen te treffen om de vaten te canuleren.Vul glazen pipetten met een diameter van 125 tot 175 micron aan de punt volledig met MOPS-buffer. Vul daarnaast de oplossingreservoirs met MOPS. Cannuleer vervolgens de geïsoleerde vaten.Bind ze aan glazen pipetten met behulp van ooghechtmateriaal. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipetten ontstaan. Plaats vervolgens de vatkamers op een omgekeerde microscoop met een videocamera-accessoire.Voer de video uit via het video-schuifmaatmeetsysteem voor een schermmeting van de vaten. Zet de vaten nu onder druk met behulp van een proces in twee stappen. Til eerst de met mops gevulde reservoirs op tot een hoogte die een druk van 20 millimeters kwik boven het vat geeft.Open de leiding met de mops naar het vat. Terwijl het vat onder druk wordt gezet, moet u controleren op tekenen van lekkage rond de verbindingen en over de gehele lengte van het vat. Als er geen lekken worden gevonden, verhoog dan de reservoirs om een druk van 60 millimeters kwik te genereren.Controleer vervolgens de vaten opnieuw op lekken. Zodra de druk zonder lekken wordt gehandhaafd, laat u het vat 30 minuten equilibreren bij deze druk. Nadat de equilibratie is voltooid, meet u de vaatverwijding als reactie op een verbinding van belang.Vernauw het bloedvat eerst met een halve tot driekwart door U46619 toe te voegen. Laat de vaten zes minuten in de oplossing baden om te stabiliseren. Voeg vervolgens geleidelijk de testverbinding, zoals acetylcholine, toe aan de badoplossing.Verhoog elke twee minuten de concentratie van de testoplossing in het bad met 10, beginnend bij 000001 molar en oplopend tot 001 molar. De veranderingen in vasodilatatie riepen vragen op over signalering. Maar onze focus ligt op het hart.Om het gebruik van dieren te verminderen, hebben we ervoor gekozen om de cardiale extracellulaire matrix te isoleren om ons te concentreren op de signalering die van buitenaf wordt geïnitieerd. Begin met het wegnemen van het hart van een geanestheseerde muis. Breng dit over naar een bekerglas gevuld met 15 milliliters hypertoon één procent natriumlaurylsulfaat.Houd de oplossing 18 uur lang zachtjes roerend op een roerplaat bij kamertemperatuur. Vervang de oplossing de volgende dag door 15 milliliters van 5 procent triton X100 gedurende 30 minuten, gevolgd door 15 milliliters PBS gedurende 15 minuten. Vries vervolgens de ECM en vloeibare stikstof snel in in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.Zodra het weefsel is ingevroren, wordt dit overgebracht naar een vooraf gekoelde vijzel en stamper en tot een poeder vermalen. Suspendeer het poeder in een viskeuze oplossing van PBS waaraan antibiotica zijn toegevoegd in een concentratie van 1:100. Sonicate de suspensie gedurende 30 tot 60 seconden in een ijsbad bij een hoge sonication-instelling.Het ECM-eiwit is nu geïsoleerd en moet koud blijven. Meet vóór gebruik de concentratie van het eiwit met een Bradford-assay. Het IRF5D-peptide is een inhiberend peptide dat sterk verschilt van normaal IRF5.IRF5D bestaat uit slechts 17 aminozuren en bindt aan de fosforyleringsplaats van IRF5. Dit voorkomt fosforylering en homodimerisatie, waardoor de vorming van de actieve staat van IRF5 wordt gehinderd. Heterozygote tight skin-muizen werden gedurende drie weken subcutaan behandeld met IRF5D.Het aantal neutrofielen en CD64 was verlaagd, zoals bepaald via immunohistochemie aan de hand van het gemiddelde aantal gekleurde cellen per gezichtsveld. Behandelingen met IRF5D verbeterden de acetylcholine-geïnduceerde vaatverwijding van de fascialis-slagaders in heterozygote tight skin-muizen die met IRF5D waren behandeld, in vergelijking met muizen die waren behandeld met fosfaatbuffer. In gecultiveerde myocyten, afgeleid van het hartweefsel van de transgene muizen, waren er meer IRF5-positieve cellen in culturen van heterozygote tight skin-muizen dan in controlemuizen.Behandeling van beide culturen met IRF5D resulteerde in een vermindering van IRF5-positieve kernen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een hart kunt decellulariseren. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden overgedragen naar veel organen en helpen bij het beantwoorden van diverse vragen. En onthoud dat het belangrijk is om de matrix niet te oververteren.U dient daarnaast een goede beheersing te hebben van het dissekeren en ophangen van de arteria fascialis. Eenmaal onder de knie, zou deze techniek ongeveer 60 minuten in beslag nemen en kan deze voor vrijwel elk vasculair bed worden toegepast. Het is belangrijk om te onthouden hoe fragiel het endotheel is; ga voorzichtig te werk tijdens de dissectie.Het komt regelmatig voor dat er sprake is van gezonde gladde spieren en een beschadigd endotheel.

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een voorbereiding voor het visualiseren en manipuleren van calcium signalering in de moedertaal, intact microvasculaire endotheel. Endotheliale buizen vers geïsoleerd uit muis weerstand slagaders die skeletspieren behouden in vivo morfologie en dynamische signalisatie binnen en tussen naburige cellen. Endotheliale buizen kunnen worden bereid uit microvaten van andere weefsels en organen.

Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Het raam van de muizen dorsale huidplooi kamer gepresenteerd visualiseert een zone van acute aanhoudende ischemie van een musculocutane flap. Intravitale epi-fluorescentie microscopie vergunningen voor directe en repetitieve evaluatie van de microvasculatuur en kwantificering van hemodynamiek. Morfologische en hemodynamische resultaten kunnen verder worden gecorreleerd met histologische en moleculaire analyses.

Ischemische Tissue Injury in de dorsale huidplooien kamer van de Muis: A Skin Flap Model naar Acute Persistent Ischemia Onderzoek

Het doel van dit protocol is de isolatie en kweektechnieken van murine primaire vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de coronaire circulatie demonstreren. Zodra VSMC's werden geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor vele standaard kweektechnieken.

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Protocollen voor het bestuderen van de embryonale en perinatale lymfkliertest aorta met behulp van in vivo klonale analyse en lot toewijzing, aorta explantaten en geïsoleerde gladde spier cellen zijn gedetailleerd hier. Deze uiteenlopende benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta in normale ontwikkeling en de pathogenese in ziekte.

Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de vasculaire lekkage geïnduceerd door intradermale toediening van permeabiliteit bevordering van agenten in de lymfkliertest huid. Deze techniek kan worden gebruikt om de mogelijkheid van moleculen te bevorderen of belemmeren van vasculaire lekkage of te bestuderen van de moleculaire mechanismen die vasculaire permeabiliteit regelen bepalen.

Beoordelende vasculaire Hyperpermeability-inducerende stoffen in de huid met de Miles-test

Dit manuscript wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van de arteriolen uit het netvlies rat die kunnen worden gebruikt in elektrofysiologische, calcium beeldvorming en druk myography studies beschreven.

Isolatie van retinale arteriolen voor Ex Vivo cel fysiologie Studies

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.

Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Leer vasodilatatie van geïsoleerde vaten en isolatie van extracellulaire matrix uit tight-skin muizen. Deze methode onderzoekt het effect van IRF5-remmende peptiden op vasculaire functie en ziekteprogressie.

Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen

Meer video's verkennen