Name: Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Leer hoe je eiwitnanoclusters fabriceert in een ondersteunde lipide dubbellaag voor celbiologisch onderzoek. Deze reproduceerbare methode is compatibel met TIRF- en RICM-microscopie en helpt bij het bestuderen van T-celactivering en adhesie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Laurent Limozin, Pierre Dillard en Astrid Wahl voor een verdere vruchtbare discussies over mobiele toepassingen. We danken ook Frederic Bedu van PLANETE cleanroom faciliteit voor zijn hulp met SEM observaties. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de European Research Council via subsidie ​​No. 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.

1. Cleaning Glass Cover-dia&#39;s en Observation Chambers <ol><li> Plaats de glazen afdekking-glijdt op een multi-slide tray vervaardigd uit een inert materiaal zoals polytetrafluorethyleen (PTFE). </li><li> Dompel de lade met glijbanen en de waarnemingskamer in een oplossing van oppervlakteactieve stof (een product aanbevolen voor het reinigen kwarts cuvetten geschikt). </li><li> Onder toepassing van een ultrasoon bad, ultra-ultrasone trillingen in de surfactant gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). </li><li> Spoel 5 keer met ultrazuiver water (18,2 MΩ.cm, 0,059 mS / cm). </li><li> Ultra-ultrasone trillingen in surfactansoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). </li><li> Spoel 10 keer met ultrapuur water. </li><li> Herhaal stap 1.5 en 1.6 twee keer. </li><li> Opslag in water bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C) gedurende één week. </li></ol> 2. Fabricage van Eiwit Nano-dots <ol><li> Afzetting van kralen <ol><li> Deposit de suspensie van silicapareltjes (2% v / v, 70 pl) druppelsgewijs op een cover-schuif (24 x 24 mm, dikte 170 pm) vastgehouden onder een helling van 15 graden. </li><li> Laat de suspensie verdeeld gedurende ongeveer 1 minuut terwijl flipping het glas 90 ° om de 15 s. </li><li> Laat de vloeistof verdampt onder omgevingsomstandigheden. </li><li> Bewaren in een schone glazen of PTFE ruimte bij omgevingsomstandigheden gedurende tot 2 dagen. </li></ol></li><li> Afzetting van aluminium <ol><li> Plaats de objectglaasjes (bereid in paragraaf 2.1) in een radiofrequentie (RF) magnetron sputteren materiaal 8 op een draaitafel op een afstand van ongeveer 105 mm van een aluminium (99%): silicium (1%) doel. </li><li> Afpompen van de depositiekamer tot 2,6 x 10 -4 Pa behulp van een turbo-moleculaire pomp. Deze stap is belangrijk voor het verwijderen van eventuele gasvormige verontreinigingen. </li><li> Introduceren zuivere argonatmosfeer (5N, 99,999%) met een stroom van 10 sccm onder een druk van 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NB: De binnenkomende flux argon wordt geregeld door een massastroomregelaar en de procesdruk wordt gecontroleerd met behulp van een manometer. Argon gasstroom continu en wordt geregeld door een evenwicht tussen de inlaat- en uitlaatopening kleppen. </li><li> Schakel de HF-stroomgenerator. OPMERKING: Hier wordt een typisch bereik van 400-600 W radiofrequente vermogen bij 13,56 MHz werd gebruikt. De RF-generator wordt gebruikt met een bijpassende netwerk in een capacitieve plasma koppelingswijze. De gereflecteerde energie wordt gecontroleerd en geminimaliseerd via het netwerk aangepast. </li><li> Nadat het plasma wordt gestabiliseerd, sputteren gedurende 2 minuten behandeld, waarbij het licht uit eventuele onzuiverheden van het oppervlak van het doel te verwijderen. </li><li> Opent de sluiter en laat het sputteren voortgaan gedurende 60 min aluminium op het glaasje afzetten tot een dikte van 200 nm. </li><li> Snijd de argonstroom, sluit de afsluiter de turbomoleculaire pomp van de afzettingskamer isoleren en ventileren van de kamer met schone nitrogen de kamerdruk te verkrijgen. Herstellen van de met aluminium beklede objectglaasjes. Bewaren gedurende een maand in een schone en hermetisch afgesloten glazen of PTFE box onder omgevingsomstandigheden. </li></ol></li><li> Opgedampt Organosilan <ol><li> Dompel het met aluminium beklede slide bereid in stap 2.2.6 in ultrazuiver water bij kamertemperatuur en ultra-ultrasone trillingen gedurende 30 seconden in een ultrasoon bad (50W, 50/60 Hz, tussen 20 en 30 ° C). </li><li> Borg 0,5 ml (3-aminopropyl) -triethoxysilaan (APTES) onder in een exsiccator. WAARSCHUWING: APTES een organosilaan, dat gemakkelijk verdampt en is giftig. APTES mag alleen onder een stroom-kap en gehanteerd worden. </li><li> Plaats de glaasjes (bereid in 2.3.1) op een keramische rooster en plaats binnen de exsiccator. </li><li> Sluit de exsiccator een membraanpomp en op het maximale vermogen gedurende 30 min een laag vacuüm te genereren. </li><li> Sluit het ventiel van de exsiccator en schakel de pomp. </li><li> Verhit de exsiccatortot ongeveer 50 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Open de exsiccator en het verzamelen van de dia&#39;s. </li><li> Naar een andere schone exsiccator opslag tot 48 uur bij kamertemperatuur (20-30 ° C). </li></ol></li><li> Afzetten van de eerste laag van eiwit - runderserumalbumine gemerkt met biotine (BSA-biotine) <ol><li> Plaats een van de dia&#39;s, bereid in paragraaf 2.3 op een PTFE-ondersteuning. </li><li> Borg 1 mL 25 ug / mL BSA-biotine opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-30 ° C). </li><li> Spoel 10 keer met PBS. Bewaar het monster tot 24 uur bij 4 ° C verwijderd van de lichtbron. </li></ol></li><li> Verwijdering van aluminium masker <ol><li> Incubeer de glaasjes in een oplossing van NaOH in PBS (bereid door druppelsgewijze toevoeging van 1 M NaOH tot ongeveer 100 ml PBS om pH≈12 verkrijgen) over-nacht bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). VOORZICHTIGHEID. NaOH is corrosief en moeten worden behandeld met handschoenen. </li><li> Spoelen10 keer in ultrapuur water. </li></ol></li></ol> 3. Afzetting van ondersteunde lipide dubbellaag (SLB) <ol><li> Reinigen van de Langmuir trog <ol><li> Verwijder het water in de PTFE-omhulling van de Langmuir trog met een pomp. </li><li> Reinig met een pluisvrije non-woven disposable handdoek gedrenkt in chloroform. VOORZICHTIGHEID. Chloroform is giftig en worden gemanipuleerd in een goed geventileerde ruimte, met een masker (of onder een stroom-kap) en met geschikte handschoenen. </li><li> Clean 4 maal met lauwwarm ultrazuiver water (40-50 ° C). </li><li> Clean minstens 6 keer met koud ultrapuur water. </li></ol></li><li> Afzetten van de eerste lipidelaag <ol><li> Plaats PTFE PTFE schotels in de behuizing van de Langmuir trog en vul het met ultrazuiver water. </li><li> Met de besturingssoftware van de Langmuir inrichting om de gemeten druk 0 mN / m ingesteld. </li><li> Gebruik een gasdichte glas / metaal spuit aan 30 ul van een 1 mg / ml lipideoplossing deponeren (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) in chloroform) op het oppervlak van het water. Het chloroform verdampt en het lipide moleculen spontaan een monolaag. </li><li> Met de besturingssoftware de lipide monolaag te comprimeren door het sluiten van de PTFE slagboom totdat de gewenste druk (27 mN / m bij DOPC) is bereikt. </li><li> Met de besturingssoftware op de glasplaatje bereid in paragraaf 2.5.2 in de PTFE omhulling met behulp van een gemotoriseerde klem dip. </li><li> Houden het preparaat in de klem, loodrecht op het lucht-watergrensvlak. Met de besturingssoftware te langzaam (15 mm / min) te verhogen via de interface, terwijl een constante druk bij 27 mN / m. </li><li> Breng in een droge omgeving voor zowel onmiddellijk gebruik of voor opslag tot 24 uur bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). </li></ol></li><li> Afzetten van de tweede lipidelaag <ol><li> Handhaven van de oppervlaktedruk van de Langmuir trog op de gewenste waarde van 27 mN / m. Comprimeren met behulp van debesturingssoftware van de Langmuir apparaten en / of voeg een kleine hoeveelheid lipide tot de gewenste druk te bereiken. </li><li> Plaats de glazen objectglaasjes die de lipide monolaag, bereid in paragraaf 3.2.6, horizontaal op het wateroppervlak. Waarborgen dat elke slede zweeft boven een PTFE lade. </li><li> Duw het glas glijdt, één dia tegelijk in de bijbehorende PTFE openen via PTFE of metalen pincet zodat ze ondergedompeld in het water. Vermijd kantelen van de dia&#39;s terwijl het duwen. </li><li> Met PTFE of metaal pincet om de PTFE laden met schuift over in een kristallisatievat gevuld met ultrazuiver water zorg ervoor dat de objectglaasjes niet worden blootgesteld aan lucht. </li><li> Met PTFE of metalen pincet te dragen, terwijl het werken onder water, een dubbellaag beklede glasplaat in een waarnemingskamer. OPMERKING: De observatiekamer onder water geplaatst in de kristallisator. De waarnemingskamer is op maat gemaakt en bestaat uit een PTFE ring met een rubberpakkingd stalen omhulsels die onder water kan worden samengesteld tot een waterdichte kamer waarvan het bodemoppervlak wordt gemaakt van het glaasje vooraf bekleed met de lipide bilaag maken. </li><li> Sluit de tank terwijl ze blijven werken onder water en waarborgen dat ongeveer 1 ml water wordt opgesloten binnen de kamer. </li><li> Neem de samengestelde kamer uit het water. Zorg ervoor dat het is waterdicht en lekvrije. </li><li> Vervang 1 ml ultrazuiver water in de waarnemingskamer met PBS door het toevoegen en verwijderen van 500 pi PBS 10 keer. Zorgen dat de kamer nooit waaruit de vloeistof. </li></ol></li><li> SLB blokkeren stap <ol><li> Invoeren 100 ug / ml runderserumalbumine (BSA) in de waarnemingskamer met de slede bereid in paragraaf 3.3.6 en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). </li><li> Spoel de bilaag door verwijdering en toevoeging van 500 pi PBS 10 keer. De bilaag kan worden gehouden 24 uur bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. functionalisering met Liganden <ol><li> fluorescerende of niet-fluorescerende neutravidine (NAV, een gedeglycosyleerd avidine versie niet geladen bij pH 7) toe aan 2 ug / ml in de kamer die de slede bereid in paragraaf 3.4.2 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). </li><li> Spoelen door het toevoegen en verwijderen van 500 pi PBS 10 keer. </li><li> Add gebiotinyleerd anti-CD3 bij 2 ug / ml aan de kamer die de slede bereid in paragraaf 3.4.2. Bij dubbele functionalisering van de SLB en stippen, voeg Fc-ICAM1 His-label 5 ug / ml (hier, wordt de dubbellaag van DOPC + 1% nitrilotriazijnzuur (NTA) lipiden). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C). </li><li> Spoelen door het toevoegen en verwijderen van 500 pi PBS 10 keer </li><li> Vervang PBS met celmedium (PBS + 0,1% BSA) door het toevoegen en verwijderen van 500 pi van het celmedium 10 keer. </li><li> Laat 200 pi van de cel medium in de chamber met de slede. </li><li> Plaats de kamer gedurende 10 minuten bij 37 ° C voordat cellen. </li></ol> 5. celafzetting (zie referentie 7 voor details) <ol><li> Zorgvuldig deponeren 400 pi van de celsuspensie in de kamer. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Bevestig de cel met 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Vervang het PFA met PBS door herhaalde verwijdering en toevoeging van 500 pi PBS. </li></ol> 6. Observation <ol><li> Proteo-lipide Nano-patroon en SLB vloeibaarheid <ol><li> Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het eiwit patroon epifluorescentie wijze met behulp van geschikte golflengte belichting (639 nm) en filter blokjes (bijvoorbeeld hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). OPMERKING: De intensiteit van het signaal kan worden gekwantificeerd om de hoeveelheid eiwit te schatten binnen en buiten de stip. Gebruik een geschikte golflengte belichting (330 nm) en filter kubus beeld de bilaag (BP 365/12, FT 395, LP 397), die licht met donkere gaten weergegeven. </li><li> Met continue bleken door (CPB) techniek 13, 15 naar de diffusieconstante tracer lipiden in de bilaag te meten. Deze waarneming wordt bij voorkeur net na de SLB afzetting. Opmerking: Om de diffusieconstante kwantificeren, worden twee parameters gemeten tijdens CPB proces: de specifieke bleektijd van de kleurstof (gespannen) en de vervallengte van de fluorescerende profiel van de halo gevormd rond het gebleekte gebied (tauD). De eerste wordt verkregen door de tijdsevolutie van de fluorescentie-intensiteit bij het midden van het verlichte veld tijdens het proces CPB. De tweede wordt verkregen door het intensiteitsprofiel aan de rand van het verlichte zone (gemiddeld over 12 lijnen en 5 beelden na stationaire toestand is bereikt). De krommen zijn gemonteerd op strak en tauD verkrijgen. De diffusieconstante wordt gegeven door tauD 2 / strak (D = <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunological+Synapse%3A+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li>
<li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays%3A+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li>
<li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li>
<li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li>
<li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li>
<li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li>
<li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+intermembrane+distance%3A+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li>
<li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026146o">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li>
<li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li>
<li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/2009ApSS..256..395M">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li>
<li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li>
<li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li>
<li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li>
<li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.Soc.Rev%22%5BJournal%5D)">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li>
<li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li>
<li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398(2012).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De kritische stappen in het hierboven beschreven protocol hebben betrekking op de vorming van het eiwit nano-stippen of back-vullen van de ruimte rond de puntjes met een ondersteunde lipide dubbellaag. De eerste kritische stap met betrekking tot eiwit nano-punten is de bereiding van de hiel-masker. Het reinigen van het deksel dia kritisch. De glaasjes moeten ofwel worden gereinigd met een reinigingsmiddel dat wordt aanbevolen voor het reinigen kwarts cuvetten of met zuurstofplasma. Andere reinigingstechnieken zoals onde...

<html> Celadhesie vindt plaats via gespecialiseerde celadhesiemoleculen (CAM&#39;s), eiwitten aanwezig op het celmembraan dat kan binden aan het contradeel van de extracellulaire matrix of op een andere cel. Aan gehechte cellen, meeste adhesiemoleculen zoals de alomtegenwoordige integrine en cadherine worden in de vorm van clusters 1. De interactie van T-lymfocyten (T-cellen) met antigeen presenterende cellen (APCs) een bijzonder opvallende afbeelding van de betekenis van receptor clusters gevormd bij het grensvlak tussen de twee cellen - vaak een immunologische synaps. Bij het vormen van het eerste contact met de APC, T-celreceptoren (TCR&#39;s) op het oppervlak van de T-cel vorm micronschaal clusters die als signalering platform 2, 3, 4, en uiteindelijk gecentraliseerd op grotere centrale supramoleculaire cluster (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Onlangs werd aangetoond dat de APC kant, worden de liganden van de TCR ook geclusterde 8. In de context van T-cel-APC interactie de inzet van hybride systemen, waarbij de APC wordt nagebootst door een kunstmatig oppervlak gefunctionaliseerd met relevante eiwitten sterk geavanceerde ons begrip van de synaptische grensvlak 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In dit verband is zeer relevant voor APC mimetische oppervlakken die een of meer aspecten van de doelcel te vangen ontwerpen. Bijvoorbeeld als liganden worden geënt op ondersteunde lipide bilagen, kunnen ze diffunderen in het vlak van de bilaag, bootsen de situatie op de APC oppervlak en tegelijkertijd de vorming mogelijk maken van decSMAC 6, 7. Zo hebben de clusters op de APC werd nagebootst door het creëren van liganden eilanden in een zee van polymeren 9, 10, 11, 12, 13, 14. Echter, deze twee functies zijn tot nu toe niet gecombineerd. Hier beschrijven we een nieuwe techniek om nano-dots anti-CD3 (een antilichaam dat het TCR complex richt) omgeven door een lipide dubbellaag met diffunderende lipiden maken. De dubbellaag wordt afgezet met behulp Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer techniek 7, 15, 16 en indien gewenst kunnen worden gefunctionaliseerd met een specifiek eiwit - bijvoorbeeld de ligand van de T-cel integrine (ICAM1 genoemd). Daarnaast is de anti-CD3 eiwit stippen could worden vervangen door een ander antilichaam of CAM. Terwijl we de eiwitten hebben gekozen voor toekomstig gebruik als platform voor T-cel adhesie studies, kan de strategie hier gedetailleerd worden aangepast voor elk eiwit en zelfs DNA.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&nbsp;</td><td>Dominique Dustcher, France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&egrave;me&nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL, France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Momenteel is er veel belangstelling voor het creëren van geordende reeksen van kleefeiwit eilanden in een zee van gepassiveerde oppervlak voor celbiologische studies. In de afgelopen jaren is het steeds duidelijker dat de levende cellen te reageren, niet alleen om de biochemische aard van de aan hen moleculen, maar ook om de manier waarop deze moleculen worden gepresenteerd te worden. Creëren eiwit micro-patronen is derhalve nu standaard in veel biologische laboratoria; nano-patronen zijn ook toegankelijk. In de context van cel-cel interacties, er behoefte symbolen niet alleen eiwitten maar ook lipide bilagen. Dergelijke dubbele proteo-lipide patroonvorming tot nu toe niet gemakkelijk toegankelijk zijn. Wij kunnen een gemakkelijke techniek om nano-eiwit stippen aangebracht op glas te maken en stelt een werkwijze voor de inter-puntruimte opvulling met een ondersteunde lipide dubbellaag (SLB). Van foto-bleken van fluorescerende tracer lipiden in de SLB, tonen we aan dat de bilaag vertoont aanzienlijke in-plane vloeibaarheid. Functionaliseren van het eiwit stippen met fluorescerende groepen stelt ons in staat om de afbeelding hen en om te laten zien dat ze zijn gerangschikt in een regelmatig zeshoekig rooster. De typische dot is ongeveer 800 nm en de afstand gedemonstreerd is 2 micron. Deze substraten worden verwacht dat zij als nuttig platforms voor celadhesie, migratie en mechanisch-sensing studies dienen.

De fluorescentiebeelden werden geanalyseerd om de afstand en de grootte van de stippen meten. Typische afstand werd gevonden 1900 ± 80 nm en typische dot-grootte was 600 ± 100 nm (Figuur 1g). De afstand wordt door de grootte van de korrels voor het masker ingesteld. De puntafmeting wordt door de hiel-omvang en neerslagomstandigheden ingesteld. SLB is uniek rond het eiwit stippen en niet afgezet daarop (figuur 2), met perfecte complementariteit tussen de ...

Wij presenteren een protocol glas functionaliseren met nanometrische eiwit pleisters omgeven door een vloeibare lipide dubbellaag. Deze substraten zijn compatibel met geavanceerde optische microscopie en zullen naar verwachting om te dienen als platform voor celadhesie en migratie studies.

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Het algemene doel van deze techniek is het fabriceren van een array van eiwit-nanoclusters in een ondersteunde lipide dubbellaag, die compatibel is met gevoelige oppervlaktemicroscopietechnieken voor toepassingen in de celbiologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiofysica, in het bijzonder hoe de nanoclustering van liganden de activatie en adhesie van T-cellen beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig reproduceerbaar is in een standaard biofysisch laboratorium en compatibel is met geavanceerde oppervlaktegevoelige microscopietechnieken, zoals TIRF en RICM.Hoewel deze techniek is ontworpen om inzicht te bieden in de immunologie, kan deze worden toegepast op andere celtypen met potentiële toepassingen in de celbiologie, oncologie en weefseltechnologie. Om deze procedure te starten, reinigt u de glazen dekglasplaatjes en observatiekamers zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng vervolgens 70 µL van een 2% silica-beadsuspensie druppel voor druppel aan op een dekglasplaatje dat onder een hoek van 15 graden wordt vastgehouden.Draai het glas elke 15 seconden 90 graden gedurende één minuut terwijl d

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the technique of studying the septin protein assembly on microspheres coated with lipid bilayers. This technique helps in understanding the curvature-dependent assemblies of protein on curved surfaces.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: A Technique to Observe the Septin Assembly on Microspheres

Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.

Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode

We rapporteren over een slimme toepassing van koolstofnanobuizen voor de kinetische stabilisatie van lipidedeeltjes die zelf-geassembleerde nanostructuren bevatten in hun kernen. De bereiding van lipidedeeltjes vereist vrij lage concentraties van koolstofnanobuizen, wat hun gebruik mogelijk maakt in biomedische toepassingen zoals geneesmiddelafgifte.

Facile Bereiding van Intern Self-assembled Lipid Particles gestabiliseerd door koolstof nanobuisjes

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

We rapporteren een protocol voor het produceren van een hybride lipide membraan op de water/lucht interface door het smeren van de lipide bilayer met koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) moleculen. Het resulterende hybride lipidemembraan heeft een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur. Dit protocol kan ook worden toegepast op de vorming van andere functionele nanomaterialen.

Self-Assembly van hybride lipid membranen doped met hydrofobe organische moleculen op de Water / Air Interface

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.

Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro

Hier wordt een protocol beschreven voor het genereren van lichtgereguleerde en omkeerbare eiwitpatronen met hoge spatiotemporele precisie bij kunstmatige lipidemembranen. De methode bestaat uit de gelokaliseerde fotoactivering van het eiwit iLID (verbeterd lichtinduceerbaar dimeer) geïmmobiliseerd op modelmembranen dat, onder blauw licht, bindt aan zijn partnereiwit Nano (wildtype SspB).

Dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen

Leer hoe je eiwitnanoclusters fabriceert in een ondersteunde lipide dubbellaag voor celbiologisch onderzoek. Deze reproduceerbare methode is compatibel met TIRF- en RICM-microscopie en helpt bij het bestuderen van T-celactivering en adhesie.

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Meer video's verkennen