Name: Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer hoe dextran de efficiëntie van lentivirale transductie in primaire NK-cellen verhoogt. Deze methode behoudt de cytotoxische capaciteit en cytokineproductie van getransduceerde cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Lucia Sammarco en haar Lulu's limonade staan voor inspiratie, motivatie en ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH R01 AI102893 en NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); de Alex Lemonade Stand Stichting (S.M.); het programma van de HRHM van het Fonds MACC (S.M.; S.R.; M.S.T); de Nicolaas Family Foundation (S.M.); de Gardetto familie (S.M.); de Hyundai geleerden Program (M.S.T.); Hyundai hoop op wielen (S.R.); het Fonds MACC (M.S.T. en S.M.); de Children's Research Institute, MCW (S.R.); en de Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).

Alle dierlijke protocollen gevolgd van de humane en ethische behandeling van dieren en zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) binnen de biomedische Research Center (BRC) van de medische universiteit van Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Het gebruik van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werd goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van het bloed onderzoek instituut van het bloed Center van Wisconsin, Milwaukee, WI.
1. muizen, cellijnen en vectoren
<ol><li>C57BL/6 muizen verkrijgen bij commerciële leveranciers. Handhaven van de kolonies van de muis in pathogenen vrije omstandigheden en gebruik van vrouwelijke en mannelijke muizen tussen de leeftijden van 6 tot 12 weken. De geïdentificeerde menselijke PBMCs verkrijgen IRB-erkende bronnen.</li>
	<li>Anesthetize de dieren met een mengsel van 20-30% v/v Isofluraan in propyleenglycol (1, 2-propaandiol, USP rang) naar het anesthetize van de muizen. Dierenarts zalf toepassen in de ogen te voorkomen dat droogte, terwijl de muizen onder verdoving zijn.</li>
	<li>Uitvoeren om te euthanaseren van de dieren, cervicale dislocatie na de inductie van de anesthesie.<ol>
<li>Beperken de muizen door stevig grijpen de basis van de staart met één hand. Plaats de pen van een stevige stok-type of de duim en de eerste vinger van de andere hand tegen de achterkant van de nek, aan de voet van de schedel.</li>
		<li>Voor de productie van de dislocatie, duw de hand beteugeling van het hoofd van het dier toekomen en duw terwijl het naar achteren trekken met de hand die de staart basis hebt. Controleer of de doeltreffendheid van dislocatie door gevoel voor een scheiding van cervicale weefsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Houden van de dieren in de kamer/kooi voor ten minste 5 minuten en verwijder hen alleen wanneer respiratoire activiteit afwezig is of wanneer er een gebrek aan een detecteerbare hartslag.</li>
	<li>K562 en YAC-1 cellen te verkrijgen van commerciële leveranciers en onderhouden ze in RPMI1640 medium met 10% warmte-geïnactiveerd FBS. Test deze cellijnen periodiek uit te sluiten van de mogelijkheid van mycoplasma verontreiniging.</li>
</ol>2. voorbereiding en titratie van lentivirale vectoren
<ol><li>Cultuur 5 × 106 293T cellen overnachting in een T75 cm2 kolf met een oplossing van 20 mL RPMI1640 medium met 10% FBS 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 1 mM natrium pyruvaat, 5% van 7,5% natriumbicarbonaat oplossing, en 0.001% Β-mercaptoethanol. Plaats de kolf in een incubator van de 37 ° C toegediend met 5,2% CO2.</li>
	<li>Oogsten van de cellen van de 293T met behulp van trypsine (0.025%)/EDTA (1 mM) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 5 mL trypsine/EDTA in PBS en de kolven gedurende 10 minuten in een 37 ° C een incubator voor het toestaan van het detachement van 293T cellen uit de T75 cm2 transportvaten uit te broeden.<ol>
<li>De vrijstaande cellen verzamelen en was ze twee keer in PBS te verwijderen van alle sporen van trypsine en EDTA. Tellen van de cellen met een hemocytometer en aanpassen van het nummer van de cel naar een miljoen cellen per mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfect van de 293T cellen18 met 3.95 µg voor psPAX2, pMD2G 1,32 µg en 5.26 µg pLEP-GFP-Puro (gegenereerd intern op BRI door klonen EF1alpha promotor van pWPI in plaats van een CMV-promotor in lolploeg CMV-GFP-Puro)19.<ol>
<li>Bereiden 1 mL van 150 mM NaCl plus 63 µL van 0,6 mg/mL polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, lineaire). Meng goed en voeg de plasmiden vervolgens en meng. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens toevoegen aan cellen.</li>
		<li>16 h na transfectie, vervang het medium van de transfectie met verse medium plus 4.5 mM natrium butyraat. Oogst van de bovendrijvende substantie met virus 48u na transfectie en concentreren door centrifugering van de overnachting bij 5.000 × g. Zie de tabel van de materialen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepalen van de virale titers cuvetten van 293T door het uitvoeren van seriële verdunningen en assay door stroom cytometry 72 h na transductie20. De expressie voor de groen fluorescente proteïne (GFP) gebruiken als een maatregel te kwantificeren van de virale titers.</li>
</ol>3. de zuivering en uitbreiding van lymfkliertest primaire NK-cellen
<ol><li>Zuiveren lymfkliertest primaire NK cellen21. Kort, pass eencellige milt schorsingen door nylon wol kolommen om afbrekende het aanhangend populaties, bestaande uit de B-cellen en macrofagen.</li>
	<li>Cultuur, de bevolking van niet-aanhanger geëlueerd van de nylon wol kolom waarin lymfkliertest NK-cellen met 1.000 U/mL Interleukine (IL) -2 in RPMI1640 gemiddeld met 10% FBS 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 1 mM natrium pyruvaat, 5% van 7,5% natriumbicarbonaat oplossing, en 0.001% β-mercaptoethanol (RPMI1640 compleet medium).</li>
	<li>Wijzigen van het medium van de kolven op dag 4 van deze cultuur te verwijderen de niet-aanhanger T en de NKT cellen; cellen die gekleefd op de kolven blijven zijn grotendeels NK-cellen. Voeg 20 mL van de verse RPMI1640 compleet medium en 1.000 U/mL IL-2 om aan te vullen van de kolven.</li>
	<li>Neem contact op de zuiverheid van de lymfkliertest NK celculturen op dag 7 door stroom cytometry met NK-cel-specifieke markeringen20 preparaten met meer dan 95 gewichtspercenten CD3-NK1.1+ bevolking.</li>
</ol>4. zuivering en uitbreiding van menselijke primaire NK-cellen
<ol><li>Isoleren PBMCs door verloop van de dichtheid van het buffy coats gezonde menselijke vrijwilligers. Kort, zorgvuldig laag 35 mL half-verdund (met HBSS) cellen meer dan 15 mL dichtheid verloop in een canonieke buis van 50 mL. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 30 minuten bij 20 ° C in een swingende emmer rotor zonder rem.</li>
	<li>Gebruik de commerciële antilichaam gebaseerde negatieve selectie kits voor het zuiveren van menselijke primaire NK-cellen volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Na het isolement, bepalen de zuiverheid van de NK-cel voorbereidingen door immunofluorescentie analyses. Vlek NK cel preparaten met 2 µg/mL anti-CD3 en 2 µg/mL anti-CD56 antilichamen bij 4 ° C gedurende 20 minuten wassen de cellen tweemaal met PBS NK-cel populaties bepaald door het ontbreken van CD3 en de aanwezigheid van CD56 op het celoppervlak.</li>
	<li>Incubeer de voorbereidingen van de cel met antilichamen voor 20 min bij 4 ° C wassen met PBS en analyseren in een flow-cytometer. NK-cel preparaten gebruiken met meer dan 85% zuiverheid voor de gene transductie testen20.</li>
</ol>5. transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen met lentivirus
<ol><li>Schorten muis of mens primaire NK-cellen in een 24-well plaat op 0,5 × 105/mL van medium in aanwezigheid van GFP lentivirus supernatant in 5, 10 en 20 multipliciteit van infectie (MOI) en in het bijzijn van Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) of dextran (8 µg/mL).</li>
	<li>Centrifugeer de platen bij 1000 × g gedurende 60 min.</li>
	<li>Zonder de bovendrijvende vloeistof decanteren, cultuur de cellen 's nachts (16-18 h) in een incubator van de 37 ° C toegediend met 5,2% CO2.
</li>
	<li>Wassen met 10 mL PBS en resuspendeer in 2 mL zuiver compleet RPMI1640-kweekmedium in aanwezigheid van IL-2 (300 U/mL).</li>
	<li>Testen van de mens en muis primaire NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit tegen K562 en YAC-1, respectievelijk door het uitvoeren van 51chroom (Cr)-release assays bij gevarieerd effector-naar--doelcel ratio's22.<ol>
<li>Kort, geven een miljoen target cellen 50 µCi van radiolabeled natrium chromaat 51Cr. Tijdens de incubatietijd van 4 uur, ze opname de 51Cr tot cellulaire proteïnen. Aan het eind van de incubatie, wassen de cellen om te verwijderen van elk designated etiket.</li>
		<li>Lysis van de cel van de specifieke tumor berekenen door het bedrag van de absolute, spontane en experimentele versie van 51Cr van de doelcellen. Opmerking: De berekening van het percentage van specifieke lysis van pentaplicate experimenten werd gedaan met behulp van de volgende vergelijking: % specifieke lysis = ((51Cr bedoel experimentele introductie - 51Cr gemiddelde spontane release) / (51Cr bedoel maximale release - 51Cr bedoel spontane release)) х 100, waar "51Cr gemiddelde spontane release" is de 51Cr vrijgelaten uit de doelcellen in het ontbreken van NK-cellen en "51Cr gemiddelde maximale release" is de 51Cr doelcellen op lysis verlost door zoutzuur 2 N (HCl).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oogst de getransduceerde NK-cellen op dag 7 door zachtjes te tikken op de kolven.<ol>
<li>Activeer de geoogste cellen met milliliters gestelde concentraties van plaat-gebonden anti-NKG2D (A10) mAb door coating 96-Wells, hoog eiwit-absorberend polystyreen platen met 2,5 µg Mo/mL concentraties van anti-NKG2D mAb's nachts.</li>
		<li>Wassen elk goed met 100 µL van PBS drie keer vóór de toevoeging van primaire NK-cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamelen van supernatant van cultuur met behulp van een precisiepipet meerkanaals tussen 16 en 18 h Activering achteraf te kwantificeren van cytokines zoals IFN-γ. Het genereren van standaard krommen met behulp van de recombinante cytokines voorzien van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits.</li>
	<li>Het percentage van necrotisch cellen onder de getransformeerde NK-cellen met behulp van een stroom cytometer te testen van de levensvatbaarheid van de NK-cellen met behulp van Annexine-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) kleuring23 .<ol>
<li>Voor het uitvoeren van deze test, oogst de NK lymfkliertest en menselijke cellen van vier dagen na de signaaltransductie, was twee keer met 10 mL koude PBS bij 500 × g gedurende 5 minuten elk, en broeden met een Annexin-V (PE) / 7-AAD kit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passende stroom cytometry software gebruiken om de gegevens te analyseren. Selecteer de live-celpopulatie en analyseren van de expressie van GFP (FITC kanaal) als een maatregel van virale transductie24.</li>
</ol>

<ol><li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+despite+immunosurveillance%3A+immunoselection+and+immunosubversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).</li>
<li>Arina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+liaisons+of+natural+killer+lymphocytes+in+immunology+and+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).</li>
<li>Manilay, J. O., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+their+role+in+graft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and their role in graft rejection.</a> Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).</li>
<li>Raulet, D. H., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-tolerance+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Self-tolerance of natural killer cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).</li>
<li>Chouaib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+outcome+of+leukemia+by+natural+killer+cell-based+immunotherapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies.</a> Front Immunol. 5, 95(2014).</li>
<li>Dulphy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underground+Adaptation+to+a+Hostile+Environment%3A+Acute+Myeloid+Leukemia+vs.+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, 94(2016).</li>
<li>Tran, J., Kung, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+mediate+stable+and+efficient+gene+delivery+into+primary+murine+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells.</a> Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).</li>
<li>Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+human+natural+killer+cell+line%2C+NKL%2C+using+the+Amaxa+nucleofection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system.</a> J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).</li>
<li>Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+gene+transfer+into+natural+killer+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection.</a> J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).</li>
<li>Becknell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+of+human+natural+killer+cells+with+an+EBV%2Fretroviral+hybrid+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector.</a> J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).</li>
<li>Jiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+regulation+of+phosphoinositide+3-kinase-dependent+NK+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function.</a> J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).</li>
<li>Burshtyn, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+residues+amino-terminal+of+cytoplasmic+tyrosines+contribute+to+the+SHP-1-mediated+inhibitory+function+of+killer+cell+Ig-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors.</a> J. Immunol. 162, 897-902 (1999).</li>
<li>Schroers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+human+T+lymphocytes+and+natural+killer+cells+by+Ad5%2FF35+chimeric+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors.</a> Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).</li>
<li>Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+primary+natural+killer+cells+overcomes+inhibitory+signals+and+induces+specific+killing+of+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells.</a> Blood. 106, 376-383 (2005).</li>
<li>Denning, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+transductional+efficiency+of+lentiviral+vectors%3A+effect+of+sera+and+polycations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations.</a> Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).</li>
<li>Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+gene+transduction+and+expansion+of+human+T+lymphocytes+for+clinical+immunogene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).</li>
<li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PLoS. ONE. 4, e6529(2009).</li>
<li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li>
<li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+Fyn-ADAP+via+the+Carma1-Bcl-10-MAP3K7+signalosome+exclusively+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells.</a> Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li>
<li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li>
<li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-%7Bbeta%7D-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li>
<li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).</li>
<li>Toyoshima, K., Vogt, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+and+inhibition+of+avian+sarcoma+viruses+by+polycations+and+polyanions%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions.</a> Virology. 38, 414-426 (1969).</li>
<li>Jensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bi-specific+CD3+x+NCAM+antibody%3A+a+model+to+preactivate+T+cells+prior+to+tumour+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).</li>
</ol>

De auteurs beweren geen financieel belangenconflict.

Deze studie toont aan dat het gebruik van dextran als een agent van kationische polymeer de efficiëntie van de lentivirale transductie van zowel menselijke als lymfkliertest primaire NK-cellen verbetert. Bovendien hebben andere kationogene stoffen, als Pb of PS, geen waarneembaar effect op de levering van virale vectoren naar menselijke primaire NK-cellen. Eerder, is gebleken dat Pb gene signaaltransductie in menselijke T cellen17kan vergroten. Deze resultaten suggereren echter Pb noch PS hebben e...

Natural killer (NK) cellen zijn de belangrijkste lymfatische bevolking van het aangeboren immuunsysteem1. NK cellen functioneren als de verdedigers van de eerste regel van de immuunrespons van de gastheer tegen infecties en tumoren2,3,4. NK-cellen spelen ook een centrale rol in de ontwikkeling van tolerantie door de afscheiding van krachtige cytokines en chemokines5. Vanwege hun krachtige vermogen te richten en te elimineren van tumorcellen, worden meerdere klinische proeven uitgevoerd om te evalueren van donor-afgeleide menselijke NK cellen als een adoptive-immunotherapie voor kanker6,7. In tegenstelling tot de T-cellen moet de ontwikkelingsbiologie van NK-cellen nog goed gekarakteriseerd8. Dit gebrek aan kennis is gedeeltelijk te wijten aan het gebrek aan efficiënte technieken die genen van belang te aan de muis of menselijke primaire NK-cellen leveren. Om deze redenen, zijn meeste NK-cel studies uitgevoerd in cellijnen, in plaats van elektrische elementen. Daarom is het noodzakelijk om een betrouwbaar en efficiënt protocol te transduce primaire NK-cellen met genen van belang cruciaal.
Het algemene doel van deze studie was om het formuleren van een consistente en betrouwbare methode waarbij primaire mens of lymfkliertest NK-cellen kon worden transduced met lenti- of retrovirussen.
Eerdere studies dat geprobeerd dit probleem aan te pakken zijn uitgevoerd, voornamelijk met behulp van de tijdelijke transformatie van primaire NK-cellen. Dit omvat plasmide transfectie9,10, Epstein - Barr Virus (EBV) / retrovirale hybride vector11, "vacciniavirus" vectoren12,13, en14chimeer adenovirale vectoren AD5-post/F35. Ondanks de bescheiden efficiëntie van deze technieken maakt de voorbijgaande aard van signaaltransductie hen ongeschikt voor het langdurig gebruik van de genetisch gemodificeerde NK-cellen. Een paar recente studies hebben gewend retrovirale vectoren transduce NK-cellen, waarbij meerdere cycli van infectie tot een aanvaardbaar niveau van gen expressie11,15. In tegenstelling tot retrovirale vectoren kunt lentivirale vectoren gastheercel nucleaire importeren machines translocate van de virale pre integratie-complex in de kern. Dit is een belangrijke beperkende factor in de replicatie van het virus in niet-delende cellen, waaronder primaire NK-cellen.
Interacties tussen de verschillende receptoren van het celoppervlak en virale deeltjes toestaan virale opname in de cel. De eerste gevechten tussen de virale envelop eiwitten en hun receptoren cognaat host kunnen worden beperkt wegens de potentiële negatieve kosten bestaan tussen deze twee. De grondgedachte achter vele transductie technieken is dat de toevoeging van kationische polymeren, zoals polybrene (Pb), tijdje sulfaat (PS) of dextran, zou kunnen geven van een positieve lading aan de receptoren van het celoppervlak en daarmee de binding van virale envelop vergroten eiwitten. Dit verhoogt de efficiëntie van de fusie en de opname van de virale deeltjes door de cellen16. Hoewel het is gemeld dat de Pb of PS genenoverdracht van T cellen17kan verbeteren, had hun toepassing geen enkel effect in de efficiëntie van de transductie van primaire NK-cellen. Bovendien heeft een vergelijkende analyse tussen deze reagentia met behulp van primaire NK-cellen niet is uitgevoerd. In deze studie, werden de efficiëntie van de transductie van de drie kationische polymeren vergeleken. De resultaten tonen aan dat, onder deze drie kationische polymeren, alleen dextran aanzienlijk efficiënte virale signaaltransductie in zowel muis als menselijke primaire NK-cellen verbetert.

<table><tbody><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90-64-91-9</td><td></td></tr><tr><td>polybrene (Pb)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>protamine sulfate (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p3369</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATALANTA</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>MT25000CI</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma (IFN-&gamma; )</td><td>eBioscience</td><td>14-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>Propidium lodding staining solution</td><td>BD</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>PHOENIX</td><td>NDC 57319-559-05</td><td></td></tr><tr><td>NK cell negative selection kit</td><td>Stem Cell</td><td>19855</td><td></td></tr><tr><td>Yac-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td>Jakson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Cornnig</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>antibody-based negative selection kits</td><td>Stem Cell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>51Chromium (Cr)-release assays</td><td>perkin elmer's</td><td>NEZ030</td><td></td></tr><tr><td>ELISA kits</td><td>Ebioscience</td><td>00-4201-56</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate</td><td>Sigma</td><td>5887-5G</td><td></td></tr><tr><td>Linear polyethylenimine</td><td>polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Life Science</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire nk-cellen

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

De efficiënte transductie van specifieke genen in natural killer (NK) cellen is een belangrijke uitdaging geweest. Succesvolle transductions zijn cruciaal voor het definiëren van de rol van het gen van belang in de ontwikkeling, differentiatie en functie van NK-cellen. Recente vooruitgang aan chimeer antigeen receptoren (auto's) in kanker immunotherapie gerelateerde benadrukken de noodzaak van een efficiënte methode voor exogene genen naar effector lymfocyten. De efficiëntie van lentivirale-gemedieerde gen transductions in primaire mens of muis NK cellen blijven aanzienlijk laag, dat is een belangrijke beperkende factor. Recente vorderingen met behulp van kationische polymeren, zoals polybrene, weergeven een verbeterde gene transductie efficiëntie in T cellen. Echter zijn deze producten niet om de efficiëntie van de transductie van NK-cellen te verhogen. Dit werk toont dat dextran, een polysaccharide vertakte glucan, aanzienlijk verbetert de efficiëntie van de transductie van mens en muis primaire NK-cellen. Deze zeer reproduceerbaar transductie methodiek biedt een bevoegde instrument voor menselijke primaire NK-cellen, die enorm klinische gene levering toepassingen en dus NK cel-gebaseerde kanker immunotherapie. verbeteren kunnen transducing

Dextran induceert de efficiënte genenoverdracht van lentivirale vector in primaire menselijke en lymfkliertest NK-cellen
Menselijke NK cellen werden geïsoleerd en gezuiverd van PBMC (met een zuiverheid van meer dan 85%) en 's nachts geïncubeerd met rIL-2 300 U/mL. Werden vervolgens getransduceerde deze primaire NK-cellen met GFP lentivirus op gevarieerde multipliciteit van infectie (MOI; 3, 10 en 20 IU per cel) in 24-Wells-platen i...

Het doel van deze studie was om formuleren van technologieën die het mogelijk voor succesvolle gene signaaltransductie in primaire natural killer (NK) cellen maken. De dextran-gemedieerde lentivirale transductie van mens of muis primaire NK cellen leidt tot hogere rendementen van gen expressie. Deze methode van gene transductie zal sterk verbeteren NK cel genetische manipulatie.

Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Het algemene doel van dit protocol is het formuleren van technologieën die een succesvolle gentransductie in primaire natural killer-cellen mogelijk maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de immunotherapie, zoals het effect van genetische modificatie op effectorlymfocyten, waaronder natural killer-cellen, of NK-cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de efficiënte expressie van een gen van belang in primaire muizen- of menselijke NK-cellen.Nadat de lentivirale vectoren volgens het tekstprotocol zijn voorbereid en getitreerd, worden murine primaire NK-cellen gezuiverd door miltcellen in enkelcel-suspensie door nylonwolkolommen te leiden om de adherente populaties, bestaande uit B-cellen en macrofagen, te verwijderen. Gebruik 1 000 units per milliliter Interleukine-2 in RPMI1640 compleet medium om de niet-adherente populatie die NK-cellen bevat te kweken. Vervang op dag vier van de kweek het medium met 20 milliliters RPMI1640 compleet medium en 1 000 units per milliliter IL-2 om de niet-adherente T- en NKT-cellen te verwijderen.Gebruik op dag zeven MK-celspecifieke markers om de zuiverheid van de muizen NK-cellen te controleren via flowcytometrie, waarbij preparaties met een populatie van meer dan 95% CD3-negatief en NK1.1-positief worden gebruikt. Om perifere bloedmononucleaire cellen, of PBMCs, te isoleren, wordt 35 milliliter half verdunde cellen voorzichtig over een 15 milliliter dichtheidsgradiënt in een 50 milliliter conische buis gegoten. Centrifugeer de gradiënt in een swing-out rotor bij 400 ×g en 20 °C gedurende 30 minuten zonder rem.Nadat de menselijke primaire NK-cellen zijn gezuiverd volgens het tekstprotocol, wordt de zuiverheid van de cellen bepaald door twee microgram per milliliter anti-CD3 en twee microgram per milliliter anti-CD56-antilichamen toe te voegen. Incubeer de cellen 20 minuten bij vier graden Celsius. Was de cellen tweemaal met PBS.Analyseer vervolgens de cellen via flowcytometrie. De NK-celpopulatie zal positief zijn voor CD56 op het celoppervlak en negatief voor CD3. Suspendeer primaire NK-cellen van muis of mens in de putjes van een 24-wells plaat met een concentratie van 0,5 × 10⁵ per milliliter medium met GFP Lentivirus supernatant, bij een NLY van vijf, 10 en 20.Centrifugeer vervolgens de platen in aanwezigheid van polybrene, protaminesulfaat of dextraan bij 1.000 ×g gedurende 60 minuten. Kweek de cellen daarna, zonder het supernatant af te gieten, gedurende de nacht in een incubator van 37 °C met 5,2% koolstofdioxide.Nadat de cellen zijn gewassen met 10 milliliters PBS, gebruik twee milliliters RPMI1640-medium met IL-2 om de cellen opnieuw te suspenderen. Coat de dag voor het oogsten van de cellen 96-wells polystyreenplaten met een hoge eiwitabsorptie met 2,5 micrograms per milliliter anti-MKG2D monoklonale antilichamen en incubeer de platen gedurende de nacht bij kamertemperatuur of in de koelkast.Was de volgende dag elke well drie keer met 100 µL PBS. Oogst de getransduceerde NK-cellen door eerst voorzichtig op de platen te tikken, en voeg vervolgens 100 µL van de cellen toe aan elke well van de 96-wells platen. Verzamel 16 tot 18 uur na activatie de supernatanten met een meerkanaals pipet.Genereer vervolgens met behulp van het recombinante cytokine uit een ELISA-kit een standaardcurve en kwantificeer de cytokinen, zoals Interferon Gamma, in het supernatant. Om de levensvatbaarheid van de NK-cellen te testen, was de cellen vier dagen na transductie twee keer met 10 milliliters koude PBS. Oogst daarna de cellen en gebruik XM5 7-aminoactinomycine D om ze te kleuren.Gebruik flowcytometrie om het percentage necrotische cellen tussen de getransformeerde NK-cellen te bepalen en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Deze figuur laat zien dat humane NK-cellen die werden geïncubeerd met recombinant IL-2 en vervolgens werden getransduceerd met GFP Lentivirus een hogere transductie-efficiëntie bereikten en de virale titer verhoogden wanneer dextran aan de cultuur werd toegevoegd, in vergelijking met de toevoeging van polybrene of protaminesulfaat. Zoals hier te zien is, werden vergelijkbare resultaten aangetoond in murine NK-cellen, waarbij dextran de efficiëntie van Lentivirale vectoren verhoogde vergeleken met polybrene of protaminesulfaat.In dit experiment werd de cytotoxische capaciteit van getransduceerde primaire NK-cellen onderzocht met een CR-release assay tegen K562 en YAC-1 als doelcellen. De transductie van NK-cellen door dextran beïnvloedt het dodingspotentieel van getransformeerde NK-cellen niet negatief in vergelijking met niet-getransduceerde NK-cellen. Hierbij werden getransduceerde humane primaire NK-cellen gedurende 24 uur gecocultiveerd met K562, waarna de supernatanten werden verzameld om Interferon Gamma te meten.De resultaten geven aan dat dextran geen invloed heeft op het vermogen van getransduceerde NK-cellen om cytokinen te produceren. Daarnaast toonde een onafhankelijke validatie aan dat dextran-behandelde NK-cellen, geactiveerd met plaatgebonden anti-NKG2DA10 monoklonale antilichamen, nog steeds in staat waren om het cytokine Interferon Gamma te produceren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de getransduceerde cellen te centrifugeren.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals transfectie, worden ingezet om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het verbeteren van de genoverdracht. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de immunologie om genmanipulatie in NK-cellen te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u NK-cellen kunt transduceren.

dextran-enhances-lentiviral-transduction-efficiency-murine-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

This video demonstrates an assay for cationic polymer-mediated viral transduction in natural killer (NK) cells. The cells are incubated with transgenic lentivirus vectors encoding a fluorescent protein. The addition of a cationic polymer enables the virus to attach to the cells and integrate its RNA into the host genome, expressing the fluorescent protein. The fluorescence is quantified to assess the polymer-induced enhancement of transduction.

Enhancing Viral Transduction in Natural Killer Cells Using a Cationic Polymer

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

In dit artikel geven wij dat een gedetailleerd protocol voor de expressie van fluorescerende fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. De methode is gebaseerd op de transductie van het beenmerg progenitoren met retrovirale constructies gevolgd door differentiatie in macrofagen en dendritische cellen in vitro.

Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.

Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

Het huidige protocol laat zien hoe CD3−/CD45+CD56+ cellen met milde cytotoxiciteit kunnen worden onderscheiden van humane expanded potential stamcellen (hEPSC's) onder zowel 3D- als 2D-kweekomstandigheden. Dit maakt routinematige fenotypische validatie mogelijk zonder de vernietiging van de complexe micro-omgeving.

Generatie van Natural Killer Cellen uit Human Expanded Potential Stamcellen

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Leer hoe dextran de efficiëntie van lentivirale transductie in primaire NK-cellen verhoogt. Deze methode behoudt de cytotoxische capaciteit en cytokineproductie van getransduceerde cellen.

Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen

Meer video's verkennen