Een robuuste Longontsteking Model in Immunocompetente Knaagdieren om Antibacteriële Werkzaamheid Evalueer tegen S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa of A. baumannii

Het algemene doel van deze niet-chirurgische intrabronchiale infectieprocedure is om een robuuste bacteriële longontsteking bij immuuncompetente knaagdieren te veroorzaken. Deze methode levert waardevolle bijdragen voor de ontdekking en ontwikkeling van antibiotica door de werkzaamheid van potentiële behandelingen te beoordelen in een immuuncompetent model van ernstige longontsteking. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het een robuuste en reproduceerbare longinfectie veroorzaakt met veel isolaten, inclusief die welke doorgaans neutropenie bij de dieren vereisen of isolaten die met andere methoden geen levensvatbare infectie produceren.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze procedure het lastig vinden. Goede intubatie is een blinde procedure die vereist dat de juiste tastzin wordt geleerd om de luchtpijp in plaats van de slokdarm te intuberen. Goede intubatie is voor elke wetenschapper anders.

De exacte hoek van de canule mag niet voor iedereen hetzelfde zijn. Het voelen van de richels van de luchtpijp is de sleutel. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Cindy Mininger, een wetenschapper uit ons laboratorium.

Om te beginnen, bereidt u zoutoplossing met bacteriën op uit overnacht gekweekte bouillonculturen, zoals aangegeven in het tekstprotocol, of uit agarplaten, zoals hier gedemonstreerd. Haal overnacht groei van agarplaten door kolonies van het oppervlak te schrapen met een steriele lus. Breng het geoogste materiaal over in vijf milliliter steriele zoutoplossing tot een troebele, ondoorzichtige suspensie is verkregen, en schudden de cultuur voorzichtig tot het homogeen is.

Verdun vervolgens serieel en plateer een aliquot uit elke verdunning volgens het tekstprotocol. Na het bereiden van het agar en het assembleren van de benodigde gereedschappen voor het infectieproces, volgens het tekstprotocol, pipetteert u negen milliliter agar in een steriele buis en plaatst u de buis vervolgens in het waterbad totdat de agar is uitgekomen tot ongeveer 42 graden Celsius. Voeg een milliliter van de eerder bereide zoutoplossing met bacteriën toe aan de buis met agar.

Keer vervolgens de buis meerdere keren om te mengen en plaats deze terug in het water. Plaats een schone, wegwerpbare mat op het werkoppervlak dicht bij het waterbad. Om het werkoppervlak en het intubatieapparaat voor te bereiden, steriliseert u eerst de metalen canule en het polyethyleenslang volgens het tekstprotocol en brengt u het vervolgens in zijn glazen opslagbuis naar het werkoppervlak.

Vervolgens verwijdert u het dopje van de opslagbuis en schuift u het handvatuiteinde van de canule naar het opene uiteinde van de buis. Verwijder met steriele pincetten één lengte polyethyleenslang uit de beker en steek deze door de binnenkant van de steriele metalen canule, ervoor zorgen dat deze vrij beweegt. Plaats een geleidmerk op een vooraf bepaalde locatie met onuitwisbare pen.

Pas vervolgens een steriele wegwerpbare 25 gauge naald toe op het vrije uiteinde van de polyethyleenslang door de naald enkele millimeters in de slang te schuiven. Gebruik vervolgens steriele zoutoplossing om een verse wegwerpbare ee milliliter spuit te vullen. Bevestig de spuit aan de naald die op de polyethyleenslang is gemonteerd en spoel het volledige volume zoutoplossing door de slang.

Gooi de gebruikte spuit in de container voor scherpe voorwerpen. Vul vervolgens een nieuwe steriele wegwerpbare ee milliliter spuit met het agar-gebaseerde inoculum uit het waterbad. Bevestig de 25 gauge naald en slang weer en spoel agar door de slang door de zuiger iets naar beneden te drukken totdat de slang volledig gevuld is met agar.

Na het anesthesieren van de rat volgens het tekstprotocol, plaatst u het dier in een rugligging op de wegwerpbare mat met het hoofd naar rechts en de staart naar links. Steek vervolgens het vrije uiteinde van de metalen canule in de mond van het dier. Draai de canule zodat het vrije uiteinde omhoog is gebogen en schuif het voorzichtig in de luchtpijp, waarbij de larynxstructuren voorzichtig worden omzeild met een lichte draaiende beweging.

Bevestig de inbrenging in de luchtpijp, in tegenstelling tot de slokdarm, door de canule enkele malen voor en terug te schuiven terwijl u de tracheale ringen met de linker wijsvinger voelt. Om te verzekeren dat de canule in de luchtpijp en niet in de slokdarm is ingebracht, beweegt u de canule enigszins heen en weer en voelt u de richels. Als de canule soepel door de keel glijdt en de richels niet te voelen zijn, verwijdert u het apparaat en probeert u het opnieuw.

Wanneer de canule de bifurcatie bereikt waar de luchtpijp zich splitst in de linker en rechter bronchus, maakt u een lichte draaiende beweging naar de linkerkant van het dier om te verzekeren dat de canule in de linker bronchus is ingebracht. Een veelvoorkomende fout is het niet diep genoeg plaatsen van de inocula in de long, wat de luchtwegen kan blokkeren en de ademhaling kan remmen. Wanneer de canule naar de juiste hoek is gedraaid, moet deze gemakkelijk in de linker bronchus schuiven en soepel naar de juiste diepte worden gebracht.

Breng de metalen canule vooruit tot het uiteinde halverwege tot drie kwart in de linker long is, gebruikmakend van de eerder geplaatste geleidmerk om te bevestigen dat de juiste diepte is bereikt. Met de metalen canule op zijn plaats, brengt u de polyethyleenslang enkele millimeters vooruit met behulp van de eerder geplaatste geleidmerk op de slang om ervoor te zorgen dat deze alleen ver genoeg wordt gebracht om het uiteinde van de metalen canule te verlaten en niet de long te puncteren. Met beide canules op hun plaats, gebruikt u de bevestigde spuit om 100 microliters agar suspensie diep in de grote lob van de linker long te infiltreren.

Trek enkele millimeters van de slang terug en verwijder voorzichtig het intacte intubatieapparaat. Plaats het terug in de glazen opslagbuis en verplaats het dier in een nieuwe kooi om te herstellen. Bereid het werkoppervlak en de canule voor zoals zojuist gedemonstreerd voor ratten, met behulp van het geschikte formaat materiaal voor muizen.

Ge