Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Het algemene doel van deze procedure is om iPS-cellen te genereren uit volwassen menselijke perifere bloedmononucleaire cellen met behulp van niet-integrerende episomale vectoren. Dit protocol kan wetenschappers in het stamcelgebied helpen die iPS-cellen willen genereren voor ziektemonitoring, medicijnscreening en reguliere radiogeneeskunde. Ons herprogrammeringsprotocol is heel eenvoudig, maar zeer efficiënt.

Volgens deze procedure kan men gemakkelijk de techniek van bloedcelherprogrammering beheersen. De kwaliteit van het plasma is net zo belangrijk voor een succesvolle herprogrammering. Verontreinigingen kunnen de herprogrammeringsefficiëntie verminderen, daarom raden we aan om Endofree-kits te gebruiken om episomale plasmiden te zuiveren.

iPS-cellen zijn kwetsbaarder dan andere cellen. Het voorbereiden van cellen voor meer dan één genoverdracht kan massale celdood veroorzaken, vooral bij vroege passages. Om deze procedure te beginnen, bereidt u al het benodigde kweekmedium voor volgens de bijbehorende handleiding.

Combineer vervolgens 10 ml verse PB-monster en tien ml PBS-buffer in een 50 ml buis en meng goed. Breng PBS naar kamertemperatuur of 37 graden Celsius voor gebruik. Voeg vervolgens 10 ml ficoll toe aan de bodem van de buis.

Dit proces moet langzaam worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de ficoll-laag niet mengt met de PB. Centrifugeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 400 x g met lage versnelling en vertraging. Na centrifugatie bevinden de PB MNC's zich in de witte laag tussen het PB-plasma en ficoll. Aspibeer langzaam 10 ml PB-plasma zonder de buff ficoll-laag te verstoren.

Vervolgens oogst u voorzichtig de witte laag in een nieuwe 50 ml buis. Het totale volume van de verzamelde cellen uit de witte laag moet ongeveer drie tot zes ml zijn. Voeg daarna PBS toe om het totale volume tot 30 ml te brengen en meng goed.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende tien minuten bij 400 x g. Na tien minuten verwijdert u het supernatant en suspendeert u het celpellet in 20 ml kweekmedium. Meng goed en centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 400 x g om de meeste bloedplaatjes te verwijderen.

Vervolgens verwijdert u het supernatant en suspendeert u het celpellet in één tot twee ml IMDM. De cellen kunnen onmiddellijk voor cultivatie worden gebruikt of worden ingevroren voor later gebruik. Voeg voor cryoconservatie een gelijke hoeveelheid cryoconservatiemedium toe.

Deel de cellen op in cryovials en breng ze onmiddellijk over naar een vriezer van 80 graden Celsius. Bereid in deze procedure vijf ml IMDM-medium voor in een 15 ml buis. Ontdooi de bevroren PB MNC's snel in een waterbad van 37 graden Celsius voordat u ze overbrengt naar de buis met IMDM-medium.

Centrifugeer het monster gedurende vijf tot tien minuten bij 400 x g. Verwijder daarna het supernatant en suspendeer het celpellet in erytroid medium. Tel vervolgens de cellen onder een microscoop met behulp van een hemocytometer.

Vervolgens kwekt u PB MNC's in een niet-gecoate zes-putjesplaat met twee ml medium per putje bij 37 graden Celsius in een met 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator. Voeg op dag drie en dag vijf een ml vers erytroid medium toe in elke putje zonder het medium te vervangen. Op dag zes oogst u PB MNC's voor nucleofectie.

Een dag voorafgaand aan de nucleofectie bekleedt u de gecoate zes-putjesplaat met 0,1% gelatine bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Ontdooi de geïnactiveerde MEF-feedercellen in een waterbad van 37 graden Celsius en breng ze onmiddellijk over naar een 15 ml buis met vijf ml MEF-medium. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 400 x g en verwijder het supernatant.

Verwijder vervolgens de gelatine uit de zes-putjesplaat en suspendeer het celpellet in MEF-medium. Zaai vervolgens de geïnactiveerde MEF-cellen in twee ml MEF-medium in elke putje van een met gelatine voorbehandelde zes-putjesplaat en kweek ze bij 37 graden Celsius in een met 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator. Op de dag van de nucleofectie aspibeert u het MEF-medium en vervangt u het door een ml erytroid medium.

Pre-equilibreer vervolgens de kweekplaat gedurende 10-30 minuten bij 37 graden Celsius in een met 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator. Voeg twee microgram PEV OCT4 tot Sox2, één microgram PEV MYC, één microgram PEV KLF4 en 0,5 microgram PEV Bcl-XL toe aan een 1,5 ml steriele buis. Verwarm de buis gedurende vijf minuten bij 50 graden Celsius om besmetting te voorkomen en laat hem afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 57 microliter nucleofectiebuffer en 13 microliter supplementbuffer toe aan het monster. Verzamel tweemaal tien tot de zesde gekweekte PBMNC's in een vijf ml buis door centrifugatie bij 200 x g gedurende zeven minuten. Verwijder daarna het supernatant en voeg het mengsel van plasmide en nucleofectiebuffer toe aan het celpellet.

Meng vervolgens goed door de buis met een vinger te schudden. Breng vervolgens het DNA in celsuspensie over naar de cuvet die bij het kit wordt geleverd en sluit de cuvet. Selecteer programma U-008 op het nucleofectieapparaat.

Plaats vervolgens de cuvet in de houder en druk op OK. Neem daarna de cuvet uit de houder. Voeg 0,5-1 ml voorverwarmd erytroid medium toe aan elke cuvet en breng de cellen onmiddellijk over naar de vooraf geëquilibreerde MEF-plaat. Voor sommige monsters kunt u duizenden kolonies krijgen van één miljoen bloed.

Als u een enkele kolonie wilt selecteren voor verdere cultivatie, moet u mogelijk één extra putje zaaien met slechts 1 miljoen cellen. Vlak voordat u de hypoxiekamer in de incubator plaatst, schudt u de kamer voorzichtig meerdere keren om een gelijkmatige verdeling van cellen in de kweekputjes te creëren. Breng vervolgens de plaat over naar een hypoxiekamer.

Spoel de kamer gedurende één tot