Name: De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryos als In Vivo Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer een eenvoudige in vivo-methodologie om signaalroutes en genregulatienetwerken in ongewervelde embryo's te karakteriseren. Deze aanpak biedt waardevolle inzichten voor de evolutionaire en ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Robert Angerer bedanken voor zijn zorgvuldige lezing en bewerking van het manuscript. NIH R15HD088272-01 evenals het Office of Research and Development, en het Department of Biological Sciences aan de Mississippi State University, hebben ondersteuning geboden voor dit project aan RCR.

1. High Throughput Morfolino Design Strategy <ol><li> Identificeer een gen (s) van belang (bijvoorbeeld kandidaat-gen benadering, cis-regulerende analyse RNAseq en / of proteomics differentiële schermen). </li><li> Gebruik genomische, transcriptoom, en genexpressie gegevens beschikbaar over regelmatig bijgewerkt websites (bv SpBase http://www.echinobase.org 20 en S. purpuratus Genome Search http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) om vast te stellen dat de spatiotemporele expressie profiel overlapt met de ontwikkelings-mechanisme in kwestie. Als geen expressie gegevens beschikbaar zijn, dan genereert qPCR primers en / of een antisense probe voor in situ genexpressie patroon beoordelen. </li><li> Na het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie, het verkrijgen van de DNA-sequentie van de genomische websites. <ol><li> Voor het opwekken van translatie-blokkerende morfolino oligonucleotiden, het verkrijgen van sequentie of de 5 &#39;niet-vertaalde gebied (5&#39; UTR) direct stroomopwaarts van het initiatiecodon van expressed sequence tag (EST) databases beschikbaar SpBase of S. purpuratus Genome Search websites. Als deze informatie niet beschikbaar is voor het gen van belang, voer dan 5 &#39;RACE. </li><li> Om een verbinding te blokkeren morfolino ontwerpen, zoeken naar de genoomsequentie waaronder de exons en introns met behulp van het schavot BLASTN instrument in SpBase of S. purpuratus Genome Search tool. </li></ol></li><li> Met het oligonucleotide ontwerpen website http://oligodesign.gene-tools.com teneinde de gewenste 25 baseparen sequentie morfolino ontwerpen. <ol><li> Voor een translationele blokkering morfolino Gebruik de mRNA sequentie van 5 &#39;naar 3&#39; als bron van translationele doelsequentie. Omvatten de 5 &#39;UTR sequentie (ongeveer 70 nucleotiden stroomopwaarts van de transcriptie startplaats) plus 25 basen van coderende gebied (stroomafwaarts van de startplaats) met het startcodon gemarkeerde with haakjes (ATG). </li><li> Voor een verbinding blokkerende morfolino, selecteert intron-exon of exon-intron grens sequentie en omvatten 50 basen (25 bases van exon sequentie en 25 bases van intronsequentie) rond de grens regio&#39;s. Scan het genoom met morfolino sequentie te controleren of de sequentie is uniek. </li></ol></li></ol> 2. Micro-injectie van morfolino oligonucleotiden <ol><li> Bereid 3 mM voorraadoplossingen van de morfolino oligonucleotiden door toevoeging van 100 pi nuclease-vrij water in de 300 nmol morfolino flacon. LET OP: Gebruik geen DEPC behandeld water voor de re-ophanging, omdat diethylpyrocarbonaat de morfolino kunnen beschadigen. </li><li> Voor de eerste bereiding draai naar beneden de flacon met de voorraad oligonucleotide oplossing gedurende 30 seconden op volle snelheid (14.000 - 16.000 xg), kort vortex, warmte bij 65 ° C gedurende 5 tot 10 min, kort vortex, en houden de morfolino voorraad bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur. Morfolino stockoplossing<html> s zijn opgeslagen -20 ° C tot 4 ° C. </li><li> Bereid injectieoplossing die morfolino oligonucleotiden in de gewenste concentratie. Deze oplossing bevat gewoonlijk 20% glycerol en 125 mM KCl als drager en 15% FITC-dextraan (fluoresceïne isothiocyanaat dextran 10.000 MW 2,5 mg / pl voorraadoplossing). FITC-dextraan en andere fluorescerende dextran conjugaten worden routinematig gebruikt om geïnjecteerde embryo&#39;s te identificeren door epifluorescentie microscopie. WINKEL injectieoplossingen bij -20 ° C. </li><li> Verwarm de morfolino oplossing bij 65 ° C in een verwarmingsblok of waterbad gedurende tenminste 2-5 minuten. </li><li> Kort draaien de morfolino oplossing gedurende 30 seconden bij volle snelheid (14.000 - 16.000 xg), vortex gedurende 1 minuut en centrifugeer bij volle snelheid (14.000 - 16.000 xg) gedurende ten minste 10 min. </li><li> Laad de injectienaalden met de morfolino oplossing. Voor een gedetailleerde micro-injectie protocol zie Stepicheva en Song, 2014 21 en Proost en Ettensohn 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> 3. Fixatie en In Situ Protocol na 24 uur na de bevruchting (HPF) in S. purpuratus Embryo&#39;s LET OP: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van Arenas-Mena et al. , 2000 23 en Sethi et al. 2014 24. <ol><li> bevestiging <ol><li> Voeg enkele druppels fixatief (zie hieronder) om putjes die embryo&#39;s, meng voorzichtig door pipetteren, en hen in staat stellen om zich te vestigen. Verwijder het fixatief en meng embryo&#39;s met twee additionele 180 pl wassingen fixatief. LET OP: Het is belangrijk om goed te mengen de embryo&#39;s tijdens de wasbeurten door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. Als dit niet gebeurt kan de signaal-ruisverhouding te verlagen. </li><li> Laat de embryo vast te stellen in de tweede fixeermiddel was voor 50 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur (RT) in 4% paraformaldehyde elektronenmicroscopie rang bestaande uit 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, en kunstmatige seawater (ASW). Maak deze oplossing vers elke keer voor de beste resultaten. Bovendien Eenvoudig, praktisch embryo&#39;s worden gefixeerd in 96-well platen. <ol><li> Voor 20 ml fixeermiddel gebruik 5 mL 16% paraformaldehyde, 15 ml ASW, 200 pi 1 M MOPS pH 7,0, en 20 ul Tween-20. </li></ol></li><li> 5 keer wassen bij kamertemperatuur met 180 ul MOPS wasbuffer bestaande uit 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl en 0,1% Tween-20 gedurende ten minste 5 minuten of totdat embryo naar de bodem van de put. Nogmaals, het is belangrijk om de embryo&#39;s in de wasbuffer meng door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen. MOPS wasbuffer kan worden gebruikt voor 2 dagen houdbaar bij 4 ° C. <ol><li> Voor 40 ml MOPS wasbuffer gebruik 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O en 40 ul Tween-20. </li><li> Vaste embryo&#39;s kunnen gedurende 2 dagen bewaard bij 4 ° C. Opmerking: Als het opslaan vaste embryo langer, voeg dan 0,2% natriumazide in MOPS wasbuffer om bacteriegroei te voorkomen.</li></ol></li></ol></li><li> Pre-hybridisatie <ol><li> Zuig het MOPS wasbuffer en voeg 180 ul van een 2: 1 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo&#39;s in de oplossing door voorzichtig pipetteren meerdere malen en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Hybridisatiebuffer bestaat uit 70% formamide, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA en 0,1% Tween-20. <ol><li> Voor 40 ml hybridisatiebuffer gebruik 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA en 40 ul Tween-20. Meng goed door vortexen, voeg 28 ml formamide, en vortex weer. </li></ol></li><li> Verwijder de 2: 1 verhouding van MOPS wassen en hybridisatie buffers en voeg 180 ul van een 1: 2 verhouding van MOPS wasbuffer aan hybridisatiebuffer, meng embryo in de oplossing en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voordat probe hybridisatie meng embryo&#39;s in 100-150 ul hybridisatiebuffer. Incubeer embryo&#39;s bij 50 ° C gedurende ten minste 1h. OPMERKING: incuberen embryo &#39;s nachts is aanvaardbaar. Vóór incuberen, sluit de putjes van een kleefvel om verdamping te voorkomen. </li></ol></li><li> Hybridisatie <ol><li> In een afzonderlijke buis voeg 0,1-0,3 ng / pl probe en 500 ug / ml gist tRNA in hybridisatiebuffer, dan vortex zachtjes probe-oplossing te maken. Gist tRNA wordt toegevoegd aan de probe-oplossing om niet-specifieke binding van de antisense probe verlagen. Verwarm de oplossing tot 50 ° C, en zuig hybridisatiebuffer. </li><li> Mix pre-embryo gehybridiseerd in 100 pi van de probe-oplossing, afdichting met een kleefvel en hybridiseren bij 50 ° C gedurende 2-7 dagen, afhankelijk van de probe (de foxq2 probe kan worden gedurende 2 dagen). LET OP: Incubation tijden zullen variëren op basis van de sonde. Sommige genen tot expressie op een laag niveau vereisen tot 7 dagen incubatie. 96-well platen kunnen in een vochtige doos worden geplaatst verzekering tegen verdamping als de kleefstoive vel niet goed af te dichten. </li><li> Was 5 keer bij 50 ° C met 180 pi vers gemaakte MOPS wasbuffer voor een totaal van 3 uur. Vervolgens was 3 keer (15 minuten) met 180 ul MOPS wasbuffer bij kamertemperatuur. Vergeet niet om te mengen embryo&#39;s in de wasbuffer telkens met enkele malen zachtjes pipetteren. </li></ol></li><li> antilichaam Incubation <ol><li> Zuig het MOPS wasbuffer en meng embryo&#39;s in 180 ui blokkerende buffer bestaande uit 10% normaal serum van schapen en 5 mg / ml BSA in wasbuffer MOPS en incubeer gedurende ten minste 45 minuten bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht. </li><li> Verwijder blokkerende buffer en meng embryo&#39;s in het blokkeren van buffer die een 1: 1500 verdunning van alkalische fosfatase geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam verdund in het blokkeren van buffer. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur in een gesloten plaat verdamping plaatsvindt. OPMERKING: antilichaam niet achter op meer dan &#39;s nachts. </li><li> Was de embryo&#39;s 6 keer (5 minuten of tot de embryo&#39;s te laten vallen) in MOPS wasbuffer bij kamertemperatuur. embryo&#39;s kunnenworden &#39;s nachts bewaard bij 4 ° C. </li></ol></li><li> In situ ontwikkeling <ol><li> Was embryo 3 keer (10 min) bij kamertemperatuur met vers gemaakte pH 9,5 buffer bestaande uit 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM Levamisol en 0,1% Tween-20. <ol><li> Voor 20 mL pH 9,5 buffer gebruik 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 ui 5M NaCl, 1 ml 1 M MgCl2, 20 ul Tween-20, 16,6 ml dH 2 O en 0,0048 g Levamisool. </li></ol></li><li> Incubeer embryo&#39;s bij 37 ° C in kleurbuffer beschermd tegen licht. Kleuring buffer bestaat uit 10% dimethyl formamide, 4,5 ul / ml 4-nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) en 3,5 pl / ml 5-broom-4-chloor-3-indolyl-fosfaat (BCIP) in vers bereide pH 9,5 buffer . <ol><li> Voor 1 ml vlekken buffer 100 ul dimethyl formamide, 4,5 pi NBT en 3,5 pi BCIP. </li></ol></li><li> Stop de alkalische fosfatase reactie door wassen 3-5 keer MOPS wasbuffer. De reactie with de foxq2 sonde duurt meestal 30 minuten tot 1 uur. Sommige probes kunnen overnacht incubatie nodig op ofwel kamertemperatuur of 4 ° C. </li><li> Meng embryo&#39;s in een oplossing van 70% MOPS was en 30% glycerol. De glycerol verschaft een brekingsindex nodig voor microscopie. Embryo&#39;s kunnen worden opgeslagen in deze oplossing gedurende enkele weken. Dicht de platen met plastic paraffine om verdamping te voorkomen. </li></ol></li><li> Dia voorbereiding en vastleggen van het beeld <ol><li> Bereid een dia door het organiseren van drie kleine strookjes dubbelzijdige tape in een driehoek met kleine openingen tussen de stroken op een glijbaan. </li><li> Overdracht van de embryo&#39;s in de 70% MOPS was en 30% glycerol oplossing voor het midden van de driehoek en bedek met een dekglaasje. </li><li> Dicht de dekglaasje door een laag nagellak rond de randen van het dekglaasje. </li><li> Maak foto&#39;s met behulp van een samengestelde lichtmicroscoop met een 20X objectief en een aangesloten camera. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Erwin, D. H., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hierarchical+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The evolution of hierarchical gene regulatory networks.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).</li>
<li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+body+plan+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development.</a> Cell. 144, 970-985 (2011).</li>
<li>Borggrefe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+intracellular+domain+integrates+signals+from+Wnt%2C+Hedgehog%2C+TGFbeta%2FBMP+and+hypoxia+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways.</a> Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).</li>
<li>Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+canonical+and+noncanonical+Wnt+signaling+pathways+patterns+the+neuroectoderm+along+the+anterior-posterior+axis+of+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos.</a> PLoS Biol. 11, e1001467(2013).</li>
<li>Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2C+TGFbeta+and+Wnt+crosstalk%3A+embryonic+to+in+vitro+cartilage+development+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).</li>
<li>Lapraz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTK+and+TGF-beta+signaling+pathways+genes+in+the+sea+urchin+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome.</a> Dev Biol. 300, 132-152 (2006).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+signalling+pathways+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The evolution of signalling pathways in animal development.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).</li>
<li>Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+signaling+crosstalk+regulates+endomesoderm+segregation+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos.</a> Science. 335, 590-593 (2012).</li>
<li>Range, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+positioning+of+the+anterior+neuroectoderm+in+deuterostome+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos.</a> Genesis. 52, 222-234 (2014).</li>
<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+the+polarity+of+the+primary+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and the polarity of the primary body axis.</a> Cell. 139, 1056-1068 (2009).</li>
<li>Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deuterostome+origin+of+the+Spemann+organiser+suggested+by+Nodal+and+ADMPs+functions+in+Echinoderms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms.</a> Nature communications. 6, 8434(2015).</li>
<li>Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+mechanisms+of+Wnt+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways.</a> Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).</li>
<li>Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).</li>
<li>Houart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+telencephalon+during+gastrulation+by+local+antagonism+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling.</a> Neuron. 35, 255-265 (2002).</li>
<li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li>
<li>Rottinger, E., Lowe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+hemichordates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates.</a> Development. 139, 2463-2475 (2012).</li>
<li>Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li>
<li>Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+control+in+the+sea+urchin+aboral+ectoderm%3A+spatial+initiation%2C+signaling+inputs%2C+and+cell+fate+lockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown.</a> Dev Biol. 374, 245-254 (2013).</li>
<li>Saudemont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancestral+regulatory+circuits+governing+ectoderm+patterning+downstream+of+Nodal+and+BMP2%2F4+revealed+by+gene+regulatory+network+analysis+in+an+echinoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm.</a> PLoS Genet. 6, e1001259(2010).</li>
<li>Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpBase%3A+the+sea+urchin+genome+database+and+web+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SpBase: the sea urchin genome database and web site.</a> Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).</li>
<li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841(2014).</li>
<li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).</li>
<li>Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+expression+of+Hox+cluster+genes+in+the+ontogeny+of+a+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin.</a> Development. , 4631-4643 (2000).</li>
<li>Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+labeling+in+developmental+gene+regulatory+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis.</a> Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).</li>
<li>Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+essential+for+patterning+the+maternally+specified+animal-vegetal+axis+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343(1998).</li>
<li>Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wnt-FoxQ2-nodal+pathway+links+primary+and+secondary+axis+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos.</a> Dev Cell. 14, 97-107 (2008).</li>
<li>Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%3A+master+and+commander+of+the+dorsal-ventral+and+left-right+axes+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).</li>
<li>Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li>
<li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin%2C+a+TGF-beta+related+to+Vg1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li>
<li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li>
<li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells%2C+control+skeletal+morphogenesis+%5Bcorrected%5D+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li>
<li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cnidaria.+Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li>
<li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001(2016).</li>
<li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li>
<li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li>
<li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li>
<li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde methodiek is een voorbeeld dat de kracht van het gebruik van embryo&#39;s met minder genomische en morfologische complexiteit dan gewervelde dieren aan de signalering-routes en GRNs betreffende fundamentele ontwikkelingsstoornissen mechanismen te begrijpen illustreert .. Veel labs worden met vergelijkbare testen tijdens de zee-egel vroege ontwikkeling van het ontleden signaalwegen betrokken bij andere lot van de cel specificatie evenementen (bijv Notch, Hedgehog, TGF-β, en FGF signalering...

Gen regulerende netwerken (GRNs) en signaaltransductiewegen stellen de ruimtelijke en temporele expressie van genen tijdens de embryonale ontwikkeling die worden gebruikt om het volwassen dier lichaam kunnen samenstellen. Cel-tot-cel signaaloverdracht zijn essentiële componenten van deze regulerende netwerken die het mogelijk maakt waarbij cellen communiceren. Deze cellulaire interacties vast te stellen en verfijnen van de expressie van de regelgevende en differentiatie genen in en tussen de verschillende gebieden tijdens de embryogenese 1, 2. Interacties tussen uitgescheiden extracellulaire modulatoren (liganden, antagonisten), receptoren en co-receptoren controle over de activiteiten van signaaltransductieroutes. Een assortiment van intracellulaire moleculen transduceert deze ingangen resulteert in veranderde genexpressie, delen en / of vorm van een cel. Hoewel veel van de sleutelfactoren die de extracellulaire en intracellulaire niveaus in grote pathwaybekend is, is een onvolledige kennis grotendeels te danken aan de complexiteit van afzonderlijke signaalpaden. Bovendien hebben verschillende signaalwegen vaak met elkaar positief of negatief in de extracellulaire intracellulaire en transcriptionele niveau 3, 4, 5, 6. Belangrijk is dat de kerncomponenten van signaaltransductiewegen sterk geconserveerd in alle metazoan soort en, opmerkelijk meeste grote signaalwegen voeren vaak dezelfde ontwikkelingsfunctie in vele species bij vergelijking organismen van nauw verwante phyla name 7, 8, 9, 10, 11. De studie van signalering tijdens de ontwikkeling is een enorme taak in elk organisme, en erzijn verscheidene belangrijke uitdagingen voor het bestuderen signaalwegen meeste nieuwmondigen modellen (gewervelde, ongewervelde chordates, hemichordaten en stekelhuidigen): 1) In vertebraten er grote aantallen mogelijke ligand en receptor / co-modulator interacties intracellulaire transductie moleculen, alsmede mogelijke interacties tussen verschillende signaalwegen vanwege de complexiteit van het genoom 12, 13, 14; 2) Het complex morfologie en morfogenetische mutaties in gewervelden vaak moeilijker om functionele interacties in en tussen signaaltransductieroutes interpreteren; 3) Analyses in de meeste niet-echinoderm invertebrate nieuwmondigen model soorten worden beperkt door korte vensters van graviditeit met uitzondering van enkele soorten manteldier 15, 16. Dezeeëgel embryo enkele van de hierboven genoemde beperkingen en biedt een uitstekende eigenschappen voor het uitvoeren van een gedetailleerde analyse van signaaltransductie in vivo. Deze omvatten het volgende: 1) De relatieve eenvoud van de zee-egel genoom vermindert het aantal mogelijke ligand, receptor / coreceptor en intracellulaire transductie molecuul interacties 17; 2) De GRNs besturen van de specificatie en patroonvorming van de kiem lagen en grote embryonale assen zijn goed ingeburgerd in zeeëgel embryo, hulp bij het begrijpen van de regulerende context van de cel / gebied ontvangen van de signalen 18, 19; 3) Vele signaaltransductieroutes kunnen worden onderzocht tussen splitsing en vroege stadia, gastrula embryo uit één gelaagde epitheel waarvan de morfologie gemakkelijker te analyseren; 4) De moleculen omvattend in signaalwegen in de zee-egels zijn gemakkelijk te manipuleren; 5) Veel zee-egels zijn gravid gedurende 10 tot 11 maanden per jaar (bv Strongylocentrotus purpuratus en Lytechinus variegatus). Hier presenteren we een methode om systematisch en doeltreffend karakteriseren componenten van de signaalroutes die aangeven en patroon gebieden zeeegel&#39;s naar de voordelen die verschillende ongewervelde modelsystemen bieden in de studie van complexe moleculaire mechanismen illustreren.

<table><tbody><tr><td>Translational-blocking morpholino en/of splice-blocking morpholino</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Aangepast</td><td>Meer informatie op www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (dextran fluoresceïne isothiocyanaatje)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Maak 25 mg/mL stockoplossing</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% oplossing EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Gist tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline fosfatase-geconjugeerd anti-digoxigenine-antilichaam</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisoolhydrochloride (levamisol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-fosfaat</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Nitro blauw tetrazoliiumchloride (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

de kracht van eenvoud: sea urchin embryo&#39;s als<em&gt; in vivo</em&gt; developmental modellen voor het bestuderen van complexe cell-to-cell signaling network interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Opmerkelijk weinig cel-tot-cel signaaltransductieroutes zijn nodig tijdens de embryonale ontwikkeling om de grote verscheidenheid aan celtypen en weefsels in de volwassen lichaamsvorm te genereren. Toch worden er elk jaar meer componenten van individuele signaalroutes ontdekt, en onderzoeken geven aan dat er, afhankelijk van de context, significante cross-talk is tussen de meeste van deze routes. Deze complexiteit maakt het bestuderen van cel-tot-cel signalering in elk in vivo ontwikkelingsmodelsysteem een moeilijke taak. Bovendien zijn efficiënte functionele analyses vereist om moleculen te karakteriseren die geassocieerd zijn met signaalroutes die zijn geïdentificeerd uit de grote datasets gegenereerd door next generation differentiële screens. Hier illustreren we een eenvoudige methode om efficiënt componenten van signaaltransductieroutes te identificeren die de celbestemming en asspecificatie in zee-egelembryo's bepalen. De genomische en morfologische eenvoud van embryo's, vergelijkbaar met die van de zee-egel, maken ze krachtige in vivo ontwikkelingsmodellen voor het begrijpen van complexe signaalinteracties. De hier beschreven methodologie kan worden gebruikt als sjabloon voor het identificeren van nieuwe signaaltransductiemoleculen in individuele routes, evenals de interacties tussen de moleculen in de verschillende routes in vele andere organismen.

In de zee-egel embryo hebben we aangetoond dat 3 verschillende Wnt signalering branches (Wnt / β-catenine, Wnt / JNK en Wnt / PKC) 4, 25 interactie vertonen een Wnt signalering netwerk anterior-posterior (AP) patronen regelt vormen. Een van de belangrijkste gevolgen van deze signalering gebeurtenissen is die de oorspronkelijke algemeen uitgedrukt anterior neuroectoderm (ANE) GRN wordt beperkt tot een klein gebied rond de oogbol d...

Deze video artikel beschrijft een eenvoudige in vivo methodiek die gebruikt kunnen worden om systematisch en efficiënt te karakteriseren componenten van complexe signaalwegen en regulatorische netwerken in vele ongewervelde embryo&#39;s.

De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryo&#39;s als<em&gt; In Vivo</em&gt; Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Het algemene doel van deze experimenten is om de voordelen te illustreren die eenvoudige organismen bieden bij de studie van complexe interacties tussen genregulatoire netwerken die ontwikkelingsprocessen sturen. Deze methodologie kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de evolutionaire en ontwikkelingsbiologie, zoals de vraag hoe signaleringspaden de specificatie van het cellot bepalen langs de belangrijkste embryonale assen bij metazoën. Een van de belangrijkste voordelen van deze methodologie is dat deze kan worden gebruikt om signaleringspaden en de genregulatoire netwerken die zij activeren, efficiënt te karakteriseren in een in vivo ontwikkelingscontext. Marina Martinez-Bartolom zal deze procedure demonstreren

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen

Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo's en cellen van verschillende soorten.

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

We hebben een protocol ontwikkeld om aggregaten van muizen embryonale stamcellen te genereren die zelforganisatie, symmetrie-breking en verlenging vertonen die parallel loopt met axiale ontwikkeling. Deze techniek maakt de studie van axiale ontwikkelingsprocessen en de generatie van celtypen mogelijk die anders moeilijk uit te voeren zijn in monolaagcultuur.

Generatie Aggregaten van muis embryonale stamcellen die Toon symmetriebreking, polarisatie en Emergent Collective Gedrag<em&gt; In Vitro</em

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

Weefsel complexiteiten van multicellulaire systemen Verwar de identificatie van causaal verband tussen extracellulaire cues en individuele cellulaire gedragingen. Hier presenteren we een methode om de directe link tussen contact afhankelijke signalen en delings assen te bestuderen met behulp van C. elegans embryo blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen.

In vitro reconstitutie van ruimtelijke Celcontactpatronen met geïsoleerde Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen

Zebravis blastoderm explantaten worden gegenereerd door embryonale cellen te isoleren van endogene signaleringscentra in het vroege embryo, waardoor relatief naïeve celclusters worden geproduceerd die gemakkelijk ex vivokunnen worden gemanipuleerd en gekweekt. Dit artikel geeft instructies voor het maken van dergelijke explants en toont hun nut aan door rollen te onderzoeken voor nodale signalering tijdens gastrulatie.

Generatie van naïeve Blastoderm Explants uit Zebravis Embryo's

Hier beschrijven we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische karakterisering van cellijnen met bekende weefsellotgevallen in het gewervelde Xenopus laevis-embryo .

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Leer een eenvoudige in vivo-methodologie om signaalroutes en genregulatienetwerken in ongewervelde embryo's te karakteriseren. Deze aanpak biedt waardevolle inzichten voor de evolutionaire en ontwikkelingsbiologie.

De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryos als In Vivo Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions (Video) | JoVE Journal

De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryo's als

Meer video's verkennen