Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen
22 februari 2017
We beschrijven de zuivering van Legionella pneumophila (L. pneumophila) buitenmembraan vesicles (OMV) van vloeibare kweken. Deze gezuiverde blaasjes worden vervolgens gebruikt voor de behandeling van macrofagen aan de pro-inflammatoire potentieel analyseren.
Het algemene doel van deze studie is om Outer Membrane Vesicles of OMV's van Legionella pneumophila op een gestandaardiseerde manier te zuiveren en hun invloed op bacteriële replicatie in humane en muis macrofagen te analyseren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van onderzoek naar buitenmembraanvesikels te beantwoorden. De gestandaardiseerde procedure voor OMV-voorbereiding kan bijvoorbeeld helpen om hun impact op de gastheer-pathogeen interactie te bestuderen.
Het grote voordeel van deze techniek is dat het een gestandaardiseerd protocol zal bieden om de impact van Legionella pneumophila OMV's op humane of muis macrofagen te bestuderen en dit zal ons begrip van de pathogeniteit van Legionella pneumophila verbeteren. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we nadachten over het mogelijke pro-inflammatoire potentieel van OMV's en hoe dit het verloop van de infectie zou kunnen beïnvloeden, aangezien OMV's door Legionella zowel binnen de gastheercel als extracellulair worden afgegeven. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kerstin Hoffmann, een technicus uit mijn laboratorium en Analina Young, een postdoctoraal onderzoeker.
Begin door, onder steriele omstandigheden, L.pneumophila stam core B te verspreiden op BCYE agar platen en drie dagen te incuberen bij 37 graden Celsius. Gebruik de L.pneumophila van een voorkweekplaat om 10 milliliter YEB-medium te inoculeren met een OD600 van 0,3 en incubeer de bacteriën bij 37 graden Celsius op een roterende schudder gedurende zes uur. Controleer de zuiverheid van de vloeibare kweek door 100 microliter van de suspensie op een bloedagarplaat te verspreiden.
Incubeer de bloedagarplaat een nacht bij 37 graden Celsius. Voeg de resterende vloeibare kweek toe aan 90 milliliter vers YEB-medium en incubeer de kweek op een roterende schudder tot het een OD600 van 3,0 tot 3,5 bereikt. Centrifugeer de vloeibare kweek bij 4.000 g gedurende 20 minuten om de bacteriën te bezinken.
Breng vervolgens het supernatant over naar verse centrifugebuizen. Gooi de bacteriële pellets weg en centrifugeer de monsters opnieuw voordat je de centrifugeerstap nog een keer herhaalt. Filtreer het resterende supernatant vervolgens twee keer steriel.
Breng vervolgens het bacterievrije supernatant over naar ultracentrifugebuizen en draai de monsters gedurende drie uur bij 100.000 g bij vier graden Celsius. Giet het supernatant af en gooi het weg. Gebruik vervolgens steriel PBS om de OMV-pellets te hersuspenderen en ze samen te brengen.
Herhaal de ultracentrifugatiestap om besmettende eiwitten en vrij LPS te verwijderen. Gooi vervolgens het supernatant weg en droog de ultracentrifugebuis af met een steriele wattenstaafje. Hersuspendeer het OMV-pellet met 500 microliter steriel PBS.
Streek vervolgens 20 microliter elk op bloedagar en BCYE agar platen om bacteriële contaminatie van de bereide vesikels uit te sluiten. Incubeer de bloedagarplaat een nacht en de BCYE agarplaat gedurende drie dagen. Gebruik de BCYE-assay volgens de instructies van de fabrikant om de hoeveelheid eiwit voor de verkregen OMV-voorbereiding te kwantificeren.
Nadat THP-1-cellen volgens het tekstprotocol tot macrofagen zijn gedifferentieerd, gebruik 500 microliter vers medium om het differentiatiemedium te vervangen en incubeer de cellen nog eens 24 uur bij 37 graden Celsius. Om THP-1 of muis BMDM-cellen met OMV's te behandelen, ontdooi eerder bereide OMV's en voeg de juiste hoeveelheid toe aan de cellen. Incubeer de macrofagen met OMV's bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 20 uur om voorbehandelde of onbehandelde THP-1-cellen met wild-type L.pneumophila stam core B of muis BMDM-cellen met een flagella-gebreksmutant van deze stam te infecteren zonder het medium van de cellen te veranderen.
Voeg bacteriën toe met een MOI van 0,5 wat neerkomt op een keer 10 tot de vijfde L.pneumophila per putje. Incubeer de culturen gedurende respectievelijk 24 en 48 uur. Om de cellen te lyse, voeg saponine toe met een eindconcentratie van 0,1% en incubeer de cellen gedurende vijf minuten.
Hersuspendeer vervolgens de geliseerde macrofagen door te pipetten en breng de suspensie over naar een reactievat. Gebruik steriel PBS om seriële verdunningen van de L.pneumophila-suspensie te bereiden. Steek vervolgens 50 microliter van de vereiste verdunningen op BCYE-agarplaten en incubeer de platen gedurende drie dagen.
Tel de gevormde kolonies visueel met het blote oog en voer berekeningen uit volgens het tekstprotocol. In dit experiment, waarin het pro-inflammatoire potentieel van L.pneumophila OMV's werd onderzocht, reageerden PMA-gedifferentieerde THP-1-cellen met een tijd- en dosisafhankelijke toename van IL-8 en IL-6 secretie. Hier werd de invloed van verschillende toll-like receptoren op de herkenning van L.pneumophila OMV's geanalyseerd in muis BMDM's met verschillende genetische achtergronden met behulp van een CXCL-1 ELISA-assay.
Muis BMDM's van wild-type muizen scheidden CXCL-1 af na OMV-stimulatie, terwijl muis BMDM's van TLR2/4 dubbele knockout aanzienlijk minder scheidden. Om de impact van L.pneumophila OMV's op bacteriële replicatie in THP-1-macrofagen te bestuderen, werden cellen 20 uur voorbehandeld met OMV's en vervolgens aanvullend geïnfecteerd met L.pneumophila. De voorstimulatie van THP-1-afgeleide macrofagen vermindert eerst de bacteriële replicatie dosisafhankelijk na 24 uur infectie, terwijl het leidt tot een verdubbeling van het CFU-telling op een later tijdstip.
Zoals in dit experiment is getoond, resulteert de voorstimulatie van muis BMDM's met OMV's in een tienvoudige toename van de CFU-telling in muis BMDM's van wild-type dieren, terwijl TLR2 knockout en TRIF/MyD88 macrofagen deze toename in L.pneumophila-replicatie na OMV-voorbehandeling niet vertonen. Terwijl je deze procedure probeert, is het belang
Overzicht
Deze studie beschrijft een gestandaardiseerde methode voor het zuiveren van Outer Membrane Vesicles (OMV's) van Legionella pneumophila en het analyseren van hun effecten op macrofagen. Het onderzoek heeft tot doel het inzicht te vergroten in het pro-inflammatoire potentieel van deze blaasjes bij gastheer-pathogeeninteracties.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Immunologie
- Interacties tussen pathogeen en gastheer
Achtergrond
- Legionella pneumophila staat bekend om zijn pathogeniciteit bij mensen.
- Outer Membrane Vesicles (OMV's) spelen een rol bij bacteriële communicatie en de immuunrespons.
- Gestandaardiseerde protocollen zijn essentieel voor de reproduceerbaarheid in onderzoek.
- Inzicht in OMV's kan leiden tot nieuwe inzichten in infectiemechanismen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor de zuivering van OMV's.
- Om de impact van OMV's op het gedrag van macrofagen te onderzoeken.
- Om de pro-inflammatoire responsen die door OMV's worden opgewekt te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van L. pneumophila uit agarplaten en vloeibare culturen.
- Ultracentrifugatie voor OMV-zuivering.
- Behandeling van macrofagen met gezuiverde OMV's.
- Meting van cytokinesecretie en bacteriële replicatie.
Belangrijkste resultaten
- OMV's induceerden een dosisafhankelijke toename van de secretie van IL-6 en IL-8 door macrofagen.
- Verschillende TLR-paden beïnvloedden de herkenning van OMV's.
- Pre-incubatie met OMV's beïnvloedde de bacteriële replicatie in macrofagen.
- Gestandaardiseerde OMV-preparatie verbeterde de experimentele consistentie.
Conclusies
- De studie biedt een robuust protocol voor OMV-onderzoek.
- De bevindingen verbeteren het begrip van de pathogeniteit van L. pneumophila.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode om gastheer-pathogeen-dynamiek te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Inzicht in het pro-inflammatoire potentieel van bacteriële buitenmembraanvesikels (OMV's) biedt mechanistische inzichten in gastheer-pathogeeninteracties, die kunnen dienen als basis voor targetvalidatie en strategieën voor risicovermindering bij de ontwikkeling van anti-infectieve middelen. Gestandaardiseerde isolatie en functionele analyse van OMV's maken een reproduceerbare beoordeling van immunomodulerende effecten mogelijk, wat beslissingen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze benadering helpt bij het evalueren van virulentiefactoren en hun impact op immuunresponsen, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij de preklinische selectie van targets.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door OMV-gemedieerde immuunactivatie te koppelen aan virulentiemechanismen van pathogenen.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van bacteriële componenten die de immuniteit van de gastheer moduleren, waardoor mechanische ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde OMV-monsters voor voor kwantitatieve cytokine- en replicatie-assays, waardoor de gereedheid voor de assay en de reproduceerbaarheid worden gewaarborgd.
- Operationele waarde: Ondersteunt de schaalbare preparatie van virulentie-geassocieerde biomoleculen voor het screenen van immunomodulerende activiteit in macrofaag-gebaseerde systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt OMV-geïnduceerde immuunmodulatie met downstream infectie-uitkomsten, wat bijdraagt aan ziekte-relevante systeemmodellering.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door vroege immunomodulerende effecten te koppelen aan veranderingen in de bacteriële replicatiekinetiek.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot mechanische risicoreductie, waarbij OMV-isolatie bijdraagt aan de beoordeling van immunomodulerende targets en assays op basis van macrofagen functionele readouts bieden voor de evaluatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van de bijdragen van virulentiefactoren aan immuunactivatie en infectieprogressie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare OMV-preparaten voor het evalueren van gastcelresponsen in immunomodulerende screeningcampagnes.
- Analytics: Genereert gegevens over cytokinesectie en CFU-tellingen die vergelijking van immunomodulerende en antimicrobiële effecten tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt vroege immuunsignaleringsgegevens met preklinische infectiemodellen, wat continuïteit ondersteunt van mechanisme tot fenotype.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van Gram-negatieve virulentiefactoren in meerdere pathogeen-gastheersystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanische risicoreductie van interactiemechanismen tussen gastheer en pathogeen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor de isolatie en functionele analyse van OMV's.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door immunomodulerende risico's in een vroeg stadium van discovery te verduidelijken, waardoor biologische uitval in een late fase wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van gevalideerde immunomodulerende en replicatiefenotypes.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in microbiologie, immunologie en celkweektechnieken voor de veilige omgang met pathogene bacteriën en macrofaagdifferentiatie.
- Toegang tot ultracentrifugatieapparatuur, instrumenten voor endotoxine- en proteïnekwantificering en systemen voor cytokinedetectie (bijv. ELISA).
- Standaardisatie tussen teams voor steriele techniek, contaminatietests en consistente preparatie en opslag van OMV's.
- Aanpassingen voor verschillende Gram-negatieve bacteriën en gastheerceltypen, inclusief groeicondities en infectietijdlijnen.
- Beperkingen omvatten de noodzaak van faciliteiten met biosafety level 2 (BSL-2) bij het werken met L. pneumophila en potentiële variabiliteit in de OMV-opbrengst tussen stammen en kweekcondities.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Cultivate L. pneumophila and Prepare and Quantify L. pneumophila Outer Membrane Vesicles (OMVs)
3:42
Pre-treat, Infect Macrophages, and Assess Bacterial Replication with a Colony-Forming Unit (CFU) Assay
5:31
Results: Pro-inflammatory Response of Macrophages from L. pneumophila Infection
7:04
Conclusion
