Name: Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor het isoleren van Outer Membrane Vesicles van Legionella pneumophila en het analyseren van hun pro-inflammatoire effecten op macrofagen. Dit protocol verbetert het inzicht in gastheer-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Prof. Dr. Markus Schnare voor het verstrekken van ons met TLR2 - / - en TLR2 / 4 - / - muizen en Prof. Dr. Carsten Kirschning voor TRIF / MyD88 - / - muizen. Delen van dit werk werd gefinancierd door Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) en Hessische Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), allemaal BS.

1. Bereid Medium en Agar Plates <ol><li> Bereid 1 liter bouillon medium (YEB). Los 10 g ACES en 10 g gistextract in 900 ml gedestilleerd water. Breng de pH op 6,9 met KOH (5 N). Voeg 10 ml L-cysteïne (0,4 g in 10 ml gedestilleerd water) en 10 ml Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 ml gedestilleerd water). Vullen tot 1 L met gedestilleerd water en filter steriliseren van de oplossing (poriegrootte: 0,22 pm). Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid gebufferd houtskool gistextract (BCYE) agarplaten. Los 10 g ACES en 10 g gistextract in 900 ml gedestilleerd water. Breng de pH op 6,9 met KOH (5 N). Voeg 15 g agar en 2,5 g actieve kool. Vul tot 1 L met gedestilleerd water en autoclaaf. <ol><li> Voeg 10 ml L-cysteïne (0,4 g in 10 ml gedestilleerd water) en 10 ml Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 ml gedestilleerd water, zowel gesteriliseerd door filtratie door 0,22 urnporiën) afgekoeld tot BCYE (ongeveer 50 ° C). Gietplaten en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Ontwikkel L. pneumophila <ol><li> Verspreid L. pneumophila stam Corby (type wild, WT) op BCYE agarplaten en incubeer ze op 37 ° C gedurende 3 dagen. Inoculeer 10 ml YEB op een OD 600 van 0,3 met L. pneumophila van de voorkweek plaat; Incubeer de kiemen bij 37 ° C op een roterende schudinrichting (150 rpm) gedurende 6 uur. </li><li> Controleer de zuiverheid van de vloeibare kweek door het verspreiden van 100 pi van de suspensie op een bloed-agarplaat. Incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Voeg de overblijvende vloeibare kweek tot 90 ml vers YEB medium en geïncubeerd op een roterende schudinrichting (37 ° C en 150 rpm) tot een OD600 van 3,0-3,5, waarvan ongeveer 16-20 uur duurt bereiken. </li></ol> 3. Bereid en kwantificeren van L. pneumophila OMV OPMERKING: Voer alle volgende centrifugeren staps onder steriele omstandigheden en bij 4 ° C. <ol><li> Centrifugeer de vloeistof cultuur bij 4.000 xg gedurende 20 minuten om de bacteriën pellet. Breng de bovenstaande om verse centrifugebuizen, gooi de bacteriële pellet, en herhaal het centrifugeren (4000 x g gedurende 20 min). Herhaal deze stap een keer. </li><li> Steriel filter resterende supernatant tweemaal (poriegrootte: 0,22 pm). Breng de bacterievrije supernatant ultracentrifuge buizen en ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 3 uur. </li><li> Giet het supernatant en gooi deze weg. Resuspendeer de pellet OMV in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en ultracentrifuge (100.000 xg gedurende 3 h) contaminerende proteïnen en LPS te verwijderen. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de OMV pellet in 500 pi steriel PBS. Streak 20 ul op een bloed agar plaat en op een BCYE agarplaat om bacteriële besmetting van de bereide blaasjes te sluiten. Incubeer het bloed agar plaat &#39;s nachts en de BCYE agarplaat gedurende 3 dagen (beide op 376, C). </li><li> Kwantificeren eiwithoeveelheid verkregen uit de OMV preparaat met een bicinchoninezuur bepaling volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: De concentratie van 100 ml L. pneumophila cultuur is gewoonlijk 1 ug / ul. Bewaar de bereide en gekwantificeerde OMV bij -20 ° C. </li></ol> 4. Pre-treat macrofagen <ol><li> Bereid THP-1-cellen. Opmerking: THP-1 is een monocytische cellijn afgeleid van een leukemie patiënt. <ol><li> Voeg 2x10 5 THP-1-cellen per 24 putjes en differentiëren door toevoegingen 20 nM forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) in macrofaag-achtige cellen. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C. </li><li> Vervang het medium met 500 ul vers medium en incubeer gedurende nog 24 uur; het optimale medium voor THP-1 cellen bestaat uit RPMI 1640 een hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal kalfsserum. </li></ol></li><li> Isoleer het muizen beenmerg afgeleide macrofagen (mBMDM), zoals beschreven in verwijzenENCE 20. </li><li> Behandel THP-1-afgeleide macrofagen of mBMDM met OMV. <ol><li> Ontdooi de OMV&#39;s bereid in stap 3 en toe volgens hun hoeveelheid eiwit (0,1, 1 en 10 ug / ml) aan de menselijke of murine macrofagen. Incubeer de macrofagen met OMV&#39;s bij 37 ° C gedurende ten minste 20 uur. Gebruik het supernatant ELISA of verder gaan met stap 5. </li></ol></li></ol> 5. Infect de macrofagen en te beoordelen Bacteriële replicatie met een kiemgetal (CFU) Assay <ol><li> Gebruik L. pneumophila uit stap 2.1, voorbehandelde THP-1 cellen of mBMDM uit stap 4.3, en niet voorbehandeld macrofagen als controles (2x10 5/24 wells). Mis het medium niet uit te wisselen. </li><li> Infect THP-1 cellen met L. pneumophila Corby WT en mBMDM met een flagelline ontbreekt mutant van L. pneumophila Corby (beide met een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 wells) en incubeer gedurende 24 en 48 uur, respectievelijk. Bereid both L. pneumophila Corby (WT of flagelline-arme mutant) zoals beschreven in stap 2.1. </li><li> Lyse van de cellen in het medium door de toevoeging van saponine (eindconcentratie: 0,1%) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de bacteriën door pipetteren en de suspensie in een reactievat. Bereid seriële verdunningen van de L. pneumophila bevattende media in steriele PBS. </li><li> Strook 50 pi van de benodigde verdunningen op BCYE agarplaten en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C. </li><li> Visueel tellen de gevormde kolonies. Bereken de CFU <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> Normaliseren van de CFU telresultaat niet voorbehandeld maar geïnfecteerde macrofagen, die zijn ingesteld op 100%. </li></ol>

<ol><li>Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+delivery+of+effector+proteins+into+eukaryotic+cells+by+bacterial+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems.</a> Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).</li>
<li>Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dentilisin+in+Treponema+denticola+epithelial+cell+layer+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration.</a> Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).</li>
<li>Kolling, G. L., Matthews, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+virulence+genes+and+Shiga+toxin+by+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).</li>
<li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li>
<li>Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+capture+and+detection+of+Borrelia+burgdorferi+antigens+in+urine%2C+blood%2C+or+tissues+from+infected+ticks%2C+mice%2C+dogs%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans.</a> J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+vesicles+target+toxin+delivery+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells.</a> EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).</li>
<li>Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+protozoa+by+Legionella+pneumophila+and+its+role+in+bacterial+ecology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).</li>
<li>Winn, W. C., Myerowitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+the+Legionella+pneumonias.+A+review+of+74+cases+and+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature.</a> Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).</li>
<li>Ge, J., Shao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+vesicular+trafficking+and+innate+immune+defence+by+Legionella+Dot%2FIcm+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors.</a> Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+shed+by+Legionella+pneumophila+inhibit+fusion+of+phagosomes+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes.</a> Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).</li>
<li>Galka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+whole+secretome+of+Legionella+pneumophila+and+functional+analysis+of+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles.</a> Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+tissue+explants+reveal+novel+interactions+during+Legionella+pneumophila+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections.</a> Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+produced+outer+membrane+vesicles+from+Pseudomonas+aeruginosa+elicit+a+potent+innate+immune+response+via+combined+sensing+of+both+lipopolysaccharide+and+protein+components%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components.</a> Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).</li>
<li>Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+Legionella+pneumophila+outer+membrane+vesicles+with+eukaryotic+membrane+systems+is+a+mechanism+to+deliver+pathogen+factors+to+host+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes.</a> Cell Microbiol. , (2014).</li>
<li>Jung, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila-Derived+Outer+Membrane+Vesicles+Promote+Bacterial+Replication+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (4), (2016).</li>
<li>Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+of+Clostridium+perfringens+type+A+strains+induce+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).</li>
<li>Whitmire, W. M., Garon, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+nonspecific+responses+of+murine+B+cells+to+membrane+blebs+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).</li>
<li>Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicles+modulate+proliferation+and+interleukin-8+production+by+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells.</a> Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).</li>
<li>Jager, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+outer+membrane+vesicles+shed+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila.</a> Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).</li>
<li>Park, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Casson, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspase-4+mediates+noncanonical+inflammasome+activation+against+gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).</li>
<li>Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+of+the+Legionella+pneumophila+flagellar+regulon+contribute+to+multiple+virulence+traits%2C+including+lysosome+avoidance+and+macrophage+death%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death.</a> Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).</li>
<li>Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MavN+is+a+Legionella+pneumophila+vacuole-associated+protein+required+for+efficient+iron+acquisition+during+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cytosolic+RpsL+by+macrophages+induces+lysosomal+cell+death+and+termination+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection.</a> PLoS Pathog. 11 (3), 1004704(2015).</li>
<li>Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+preparations+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles.</a> Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).</li>
<li>Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+outer+membrane+vesicle+production+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).</li>
<li>Klimentova, J., Stulik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).</li>
<li>Novartis.com. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause">https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause</a> (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De OMV&#39;s van bacteriële pathogenen en de gevolgen van deze vesicles op hun doelwitcellen worden momenteel intensief bestudeerd. Bijvoorbeeld, Clostridium perfringens -afgeleide OMV induceert cytokine secretie in macrofagen, B-lymfocyten worden geactiveerd door OMV&#39;s van Borrelia burgdorferi en Helicobacter pylori -released membraan blaasjes kan handelen maagepitheelcellen 21, 22, 23. L. pneumophila, een intracellulair pathogeen die een ernstige vorm van atypische longontsteking kan veroorzaken, brengt ook OMV&#39;s die kunnen long epitheelcellen en macrofagen 16, 19 te activeren zijn. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de kleine schaal isolatie van L. pneumophila OMV&#39;s uit vloeibare cultuur aan de mogelijke rol van OMV&#39;s in een longontsteking te bestuderen. Het is cruciaal om onder steriele conditionen en uit te sluiten besmetting van andere bacteriën om een pure L. pneumophila verkrijgen -afgeleide OMV voorbereiding. De isolatie van OMV&#39;s omvat een filtratiestap door 0,22 urn poriën teneinde de verontreiniging van de verkregen pellet OMV met L. pneumophila voorkomen, ook al beperkt de OMV opbrengst, aangezien het grootste OMV&#39;s verloren deze filtratiestap. Verder hebben we de activiteit van humane en murine macrofagen die geïsoleerd blaasjes en geïnfecteerde cellen met L. pneumophila getest om dichter te benaderen de situatie in Legionella pneumonia, wanneer OMV&#39;s binnen de LCV worden vrijgegeven door extracellulaire bacteriën 15. De toegepaste doses OMV zijn geschat op basis van de vrije hoeveelheid OMV in een in vitro infectie van humane macrofagen na 24 uur incubatie (beschreven in referentievoorbeeld 20). Voor het stimuleren van andere ontvangende cellen of in vivo experimenten,andere OMV doses kan nodig zijn en moet worden vastgesteld. De analyse van het effect van L. pneumophila OMV vertegenwoordigt een vooruitgang op de door Jager en Steinert 24 protocol. Hier, PMA gedifferentieerde THP-1-cellen dienen als model voor alveolaire macrofagen vanwege de beperkte beschikbaarheid van primaire menselijke materiaal. De toevoeging van PMA onderscheidt de monocytische THP-1 cellen in macrofaag-achtige cellen 25. Bovendien zijn ze een bekend model cellijn L. pneumophila bestudeert 26. Naast deze menselijke monocytische cellijn, worden mBMDM cellen gebruikt. mBMDM worden geaccepteerd voor de studie van de effecten van L. pneumophila 27, 28, 29. De mogelijkheid om genetische knockouts voor verschillende TLRs of andere eiwitten maken ze een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen OMV effecten. in order om de hoeveelheid muizen per experiment verlagen mBMDM gebruikt in plaats van alveolaire macrofagen vanwege de beperkingen van de macrofagen. Key experimenten kunnen alveolaire macrofagen ter validatie vereisen. Naast de hierin beschreven protocol van ultracentrifugatie om OMV zuiveren, kan men een dichtheidsgradiënt centrifugatie, die is opgenomen in het protocol Chutkan et al uitvoeren. 30. Dit kan de zuiverheid van het verkregen OMV preparaat verbeteren en de hoeveelheid co-gezuiverd eiwit aggregaten, flagelline en LPS verminderen. De zuiverheid van de verkregen OMV preparaat kan worden geanalyseerd met transmissie-elektronenmicroscopie of nanodeeltje tracking-analyse als een aanvullende stap in de kwaliteitscontrole. Dit kan een extra middel van kwantificering bieden, voorbij het eiwit meetprocedure hier gepresenteerd. Eventueel kan de LPS-concentratie wordt geanalyseerd door een limulus amoebocyt lysaat proef. Als de OMV rendement laag is, eenaanvullende concentratiestap via centrifugale filters worden uitgevoerd, die hier niet is gedaan. Indien het rendement lager dan verwacht, werden de OMV&#39;s weggegooid. Als onderdeel van de voortdurende inspanning om de biologische mechanismen en functies achter OMV helderen, kan de invloed van verschillende stress op OMV productie getest. Nutrient ontbering, veranderingen in de incubatie temperatuur, of blootstelling aan schadelijke stoffen zou een impact hebben op OMV afscheiding 31 te hebben. Mogelijke stress-condities worden besproken in het protocol door Klimentova en Stulik 32. Bovendien kan hyper- of hypovesiculating L. pneumophila mutanten worden gegenereerd. De verschillende OMV preparaten kunnen dan in infectie-experimenten worden geanalyseerd macrofagen, longweefsel explantaten mens (in Referentievoorbeeld 17 beschreven), of in in vivo modellen. Naast de rol van OMV&#39;s in aangeboren immuunsysteem signalering, hun invloed in bacteriële communicatiekan experimenteel worden aangepakt. Bovendien kan het effect van verschillende aangeboren immuunrespons signaling cascades worden geanalyseerd door het gebruik van muizen knockout cellen of het genereren van CRISPR / Cas9 knockouts in humane cellijnen. Deze fundamentele onderzoek op OMV&#39;s zullen helpen bij de ontwikkeling van nieuwe vaccin strategieën, die reeds meningitis B overgebracht door Neisseria meningitidis 33 bestaan. Uitgaande van het Protocol betreffende de OMV isolatie en karakterisering, kan men dit toepassen op andere Gram-negatieve bacteriën en andere gastheercellen; het moet alleen worden aangepast aan de groei van de bacteriën in vloeibare kweek. Het protocol gepubliceerd door Chutkan et al. geeft gedetailleerde informatie over het genereren van OMV&#39;s van Escherichia coli en Pseudomonas aeruginosa 30. De cultuur moet de late stationaire fase niet bereiken om stijgingen van de gelyseerde bacteriën en verontreinigende eiwitten en mem te voorkomenbranen. Bovendien, de OMV wordt gebruikt bij stimulatie van de gastheercellen te worden bepaald volgens de hoeveelheid OMV aanwezig bij in vivo infectie, maar verzekert een lage cytotoxiciteit. Op deze manier, de pathologische rol van OMV&#39;s, hun impact op inter-soorten communicatie en gastheer-pathogeen interacties kunnen worden onderzocht. Om de rol van L. pneumophila OMV longontsteking verdere studie, zijn gestandaardiseerd OMV preparaten voldoende opbrengst en vergelijkbare infectie experimenten nodig. Dit protocol zal helpen isoleringsprocedures standaardiseren en OMV studies uit te breiden tot andere Gram-negatieve bacteriën en andere gastheercellen. Daarnaast zal het onderzoek profiteren van de gedetailleerde in vitro kennis, die kan worden gebruikt voor experimenten in vivo instellingen verlengen. In de toekomst kan dit protocol worden uitgebreid tot de isolatie van OMV&#39;s uit primaire biologisch materiaal, zoals serum of bronchoalveolaire lavleeftijd vloeistof, om inzicht te krijgen in de samenstelling van OMV&#39;s vrijgegeven onder fysiologische omstandigheden. Dit zal helpen om belangrijke parameters van OMV samenstelling bepalen en de eigenschappen van in vitro -generated OMV begrijpen.

<html> Bacteriën kunnen virulentiefactoren uitscheiden via verschillende mechanismen 1. Naast de bekende secretorische systemen kunnen Gram-negatieve bacteriën informatie uit en levert virulentiefactoren via buitenmembraan vesicles (OMV&#39;s), die zijn kleine, bolvormige blaasjes 10-300 nm in diameter en met een tweelagig membraanstructuur. Ze zijn afgescheiden in verschillende groei omstandigheden (vloeibare kweek, vaste fase en biofilms) en in alle groeifasen 2, 3. OMV&#39;s een belangrijk transportmiddel (bijvoorbeeld voor eiwitten, adhesinen, toxines en enzymen, alsmede voor LPS, dat wordt gevonden aan het oppervlak OMV) 4. De intraluminale lading is beschermd tegen proteolytische afbraak, zodat zij kan optreden over lange afstanden en de vesicles kunnen worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen en verre organen 5, 6,&quot;xref&quot;&gt; 7, 8. Ze kunnen alleen worden herkend en opgenomen door eukaryotische cellen 9, 10, maar bovendien kunnen zij de binding van bacteriën en hun invasie in gastheercellen vergemakkelijken 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) is een Gram-negatieve bacterie die OMV&#39;s kunnen vrijgeven. In de menselijke long, het voornamelijk infecteert alveolaire macrofagen, ook al zijn natuurlijke gastheer zijn zoetwater amoeben 11. Een L. pneumophila infectie kan de veteranenziekte, een ernstige vorm van longontsteking 12 veroorzaken. Het blokkeert phagosome-lysosoom fusie in de gastheercel. Het werft ook gastheer organellen, waarbij een replicatie niche, de Legionella-bevattende vacuole (LCV), wordt gevormd 13, 14. Lysosomale afbraak wordt geremd niet alleen effectoreiwit translocation via de type IV secretie systeem, maar ook door het vrijkomen van OMV&#39;s 15. Het zuiveren van OMV&#39;s uit bacteriële kweken moet hun effect op ontvangende cellen te analyseren. Eerdere studies gericht op het eiwitgehalte van L. pneumophila OMV en de invloed van de blaasjes op alveolaire epitheelcellen 16, maar latere studies met humane long weefseltransplantatie aangetoond dat L. pneumophila OMV gebruik is gemaakt door alveolaire macrofagen 17. Als OMV aanwezig pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en andere bacteriële antigenen, kunnen ze van invloed zijn op de infectie van eukaryote cellen en moduleren de immuunrespons van de gastheer 18. L. pneumophila OMV snel fuseren met menselijke celmembranen en bovendien, activeren ze de membraneuze TLR2 19. Aangezien het bekend is dat L. pneumophila OMV stimuleert macrofagen en epitheelcellen in een pro-inflammatoire wijze 16, 17, analyseerden we het effect van OMV&#39;s voor het infectieproces in menselijk en murine macrofagen. We beschrijven hier een protocol voor het kweken van L. pneumophila in vloeibare kweek met de uitgescheiden OMV isoleren differentieel ultracentrifugatie en het effect van de blaasjes op eukaryote gastheercellen beoordelen, hetzij rechtstreeks of na een infectie.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri-schaal</td><td>Sarstedt AG &amp; Co KG (Nuembrecht, Duitsland)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter Incorporation (Californië, VS)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>geactiveerde houtskool</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar met 5% schapenbloed</td><td>Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Duitsland)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>cuvettes</td><td>Sarstedt AG &amp; Co KG (Nuembrecht, Duitsland)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (menselijk)</td><td>BD OptEIA&trade;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Duitsland)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (murine)</td><td>DuoSet, R&amp;D (Minneapolis, VS)</td><td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Duitsland)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &amp; Co KG (Braunschweig, Duitsland)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &amp; Co KG (Braunschweig, Duitsland)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loop</td><td>Sarstedt AG &amp; Co KG (Nuembrecht, Duitsland)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td><td>vriendelijk verstrekt door Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlijn, Duitsland)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby &Delta;flaA</td><td>---</td><td>---</td><td>vriendelijk verstrekt door Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlijn, Duitsland)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td>---</td><td>---</td><td>vriendelijk verstrekt door Prof Dr Markus Schnare (Philipps Universiteit Marburg, Marburg, Duitsland) en Prof Dr Carsten Kirschning (Universiteit Duisburg Essen, Essen, Duitsland)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlijn, Duitsland)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristaat 13-acetaat</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Duitsland)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>roterende shaker (MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &amp; Co KG (Braunschweig, Duitsland)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 met hoge glucose</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Duitsland)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (Cambridge, Engeland)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>steriele filter (poriegrootte: 0,22 &micro;m)</td><td>Corning Incorporated (New York, VS)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Duitsland)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &amp; Co KG (Braunschweig, Duitsland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gietsuit</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co KG (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA eiwitbepaling kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV &amp; Co KG (Braunschweig, Duitsland)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

legionella pneumophila outer membraanvesicles: isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire potential op macrofagen

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteriën zijn in staat om een verscheidenheid aan moleculen af te scheiden via verschillende secretoire systemen. Naast het afscheiden van moleculen in de extracellulaire ruimte of direct in een andere cel, kunnen Gram-negatieve bacteriën ook buitenste membraanvesikels (OMV's) vormen. Deze membraanvesikels kunnen hun lading over lange afstanden afleveren, en de lading wordt beschermd tegen afbraak door proteasen en nucleasen.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is een intracellulaire, Gram-negatieve ziekteverwekker die een ernstige vorm van longontsteking veroorzaakt. Bij mensen infecteert het alveolaire macrofagen, waar het lysosome afbraak blokkeert en een gespecialiseerde replicatievacuole vormt. Bovendien produceert L. pneumophila OMV's onder verschillende groeiomstandigheden. Om de rol van OMV's in het infectieproces van menselijke macrofagen te begrijpen, hebben we een protocol opgesteld om bacteriële membraanvesikels uit vloeibare cultuur te zuiveren. De methode is gebaseerd op differentiële ultracentrifugatie. De verrijkte OMV's werden vervolgens geanalyseerd op hun eiwit- en lipopolysacharide (LPS) hoeveelheid en werden vervolgens gebruikt voor de behandeling van een humane monocytische cellijn of muisbeenmerg-afgeleide macrofagen. De pro-inflammatoire reacties van die cellen werden geanalyseerd door middel van een enzym-gekoppelde immunosorbent assay. Verder werden veranderingen in een volgende infectie geanalyseerd. Hiervoor werd de bacteriële replicatie van L. pneumophila in macrofagen bestudeerd door middel van kolonievormende eenheidstests.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de zuivering van L. pneumophila OMV's uit vloeibare cultuur door middel van ultracentrifugatie en voor de downstream analyse van hun pro-inflammatoire potentieel op macrofagen.

De experimentele opstelling te bereiden L. pneumophila OMV&#39;s en hun invloed op de pro-inflammatoire reactie van macrofagen na infectie is in Figuur 1 te analyseren. De pro-inflammatoire potentieel van de bereide OMV&#39;s kunnen worden geanalyseerd op PMA gedifferentieerde THP-1-cellen, die is getoond in figuur 2. THP-1-cellen reageren met een tijds- en dosisafhankelijke toename van IL-8 en IL-6 secretie. Bovendien kan de invloed van verschillende TLRs op L. pneumophila OMV erkenning worden geanalyseerd door mBMDM uit verschillende genetische achtergronden, zoals dit door de CXCL1 ELISA in figuur 3. mBMDM van WT-muizen afgescheiden CXCL1 na OMV stimulatie, terwijl mBMDM TLR2 / 4 - / - uitgescheiden aanzienlijk minder. Om het effect van L. pneumophila OMV&#39;s op bacteriële replicatie in THP-1 macrofagen, cellen werden gepreïncubeerd met OMV en bovendien geïnfecteerdmet L. pneumophila (Figuur 4 A). De pre-stimulatie van THP-1-afgeleide macrofagen vermindert eerst de bacteriële replicatie na 24 uur van infectie, maar het leidt tot een verdubbeling CFU tellen bij het later tijdstip (48 uur pi). De impact van Toll-like receptor (TLR) signalering op OMV erkenning na de infectie van de macrofagen kan worden beoordeeld door mBMDM, zoals weergegeven in figuur 4 B. Bacteriële replicatie stijgt met vertienvoudigd in mBMDM van WT dieren na OMV pre-incubatie, terwijl TLR2 - / - en TRIF / MyD88 - / - cellen niet deze toename van L. pneumophila replicatie tonen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> Figuur 1: Experimentele procedure. (A) L. pneumophila Corby WT van 10-cm BCYE agarplaten worden gebruikt om een kleine vloeibare kweek (10 ml), die in 90 ml vers YEB overgedragen entenmedium na 6 uur. Een klein volume wordt ook uitgeplaat op een agarplaat bloed te controleren op zuiverheid. De bacteriën worden geïncubeerd bij 37 ° C tot de vroege stationaire fase (OD 600 = 3,0-3,5). (B) De vloeibare kweek wordt gecentrifugeerd en steriel gefiltreerd om de bacteriën te verwijderen. De Legionella -vrij supernatant wordt vervolgens ultracentrifugeerd een OMV pellet, die wordt geresuspendeerd in PBS en nog te hebben ultracentrifuge. De geïsoleerde blaasjes worden opnieuw gesuspendeerd, gecontroleerd op zuiverheid, en gekwantificeerd voor het eiwit bedrag. De schaal bar vertegenwoordigt 2,5 cm. (C) menselijke of murine macrofagen gestimuleerd met de gekwantificeerde OMV. De celkweek supernatant kan worden gebruikt voor ELISA of macrofagen kunnen worden geïnfecteerd met L. pneumophila bacteriële replicatie bepalen CFU test op 10 cm agarplaten BCYE. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </a&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> Figuur 2: Pro-inflammatoire activatie van THP-1 cellen door L. pneumophila OMV&#39;s. (A) Hier de monocytische THP-1 cellijn wordt gebruikt als model voor alveolaire macrofagen. PMA gedifferentieerde THP-1-cellen werden behandeld met toenemende doses van L. pneumophila OMV (0,01-25 ug / ml) gedurende 24 en 48 uur, respectievelijk. Het celvrije supernatant werd gebruikt voor IL-8-ELISA. De gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten ± SEM getoond. THP-1-cellen reageerden op slechts 0,01 ug / ml L. pneumophila OMV&#39;s met aanzienlijke IL-8 secretie, die tijd- en dosisafhankelijk was. (B) L. pneumophila OMV (0,1-10 ug / ml) werden met PMA gedifferentieerde THP-1 cellen te stimuleren. Het supernatant werd na 24 en 48 uur incubatie, en de vrijgegeven IL-6 werd gemeten in de supernatant via ELISA. De gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten ± SEM getoond. THP-1-cellen uitgescheiden aanzienlijke hoeveelheden IL-6, zelfs bij de laagste dosis OMV&#39;s (0,1 ug / ml). De afscheiding van IL-6 toe met toenemende doses OMV en langere incubatietijden. Statistieken: Mann-Whitney-test; * P &lt;0,05 en ** p &lt;0,01 vergeleken met de overeenkomstige 0 ug / ml OMV. Overgenomen met toestemming van referentie 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> Figuur 3: De pro-inflammatoire activatie van macrofagen afhankelijk TLR2 / 4. mBMDM van WT- en TLR2 / 4 - / - muizen werden met L. pneumophila OMV (0,1 of 1 ug / ml). CXCL1 secretie werd geanalyseerd door ELISA na 24 en 48 uur, respectievelijk. Degemiddelde waarden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten zijn getoond. mBMDM van WT-muizen reageerden met een dosis-afhankelijke CXCL1 secretie na L. pneumophila OMV incubatie. TLR2 / 4 - / - mBMDM uitgescheiden aanzienlijk minder CXCL1 vergelijking met WT mBMDM en deze afscheiding niet toenam dosisafhankelijk. Statistieken: Mann-Whitney-test; * P &lt;0,05 vergeleken met de overeenkomstige 0 ug / ml OMV; #p &lt;0,05 in vergelijking met een gelijk behandeld WT monster. Overgenomen met toestemming van referentie 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> Figuur 4: L. pneumophila OMV voorincubatie verhogingen bacteriële replicatie in macrofagen. (A) gedifferentieerde THP-1-cellen werden gepreïncubeerd met OMV (0,1, 1 of 10 μ, G / ml) of LPS / IFN-γ (200 ng / ml elk) of werden onbehandeld gelaten ter controle. Na voorincubatie (20 h), werden THP-1 cellen geïnfecteerd met L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) gedurende 2, 24 en 48 uur, respectievelijk. THP-1 cellen werden gelyseerd door de toevoeging van saponine en de bacteriën werden geplaat op agarplaten BCYE. KVE&#39;s werden berekend op 0 ug / ml OMV na elk tijdspunt. De balken geven de gemiddelde waarden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in technische duplo. Er waren geen verschillen in bacteriële opname (2 uur na infectie (pi)) ten opzichte van niet voorbehandelde cellen. Veranderingen in bacteriële replicatie werden vastgesteld na 24 en 48 uur, respectievelijk. LPS / IFN-γ voorbehandelde THP-1-cellen bleken de bacteriologische belasting 24 uur pi Dit werd eveneens waargenomen dosisafhankelijk voor L. pneumophila OMV-vooraf behandelde cellen. Bij het later tijdstip (48 uur pi), OMV voorbehandelde THP-1 cellen vertoonden een verdubbeling L. pneumophila replicatie, terwijl LPS / IFN-γ voorbehandelde macrofagen vertoonden een verdere vermindering van bacteriële verontreiniging. Statistieken: Mann-Whitney-test; * P &lt;0,05 en ** p &lt;0,01 vergeleken met de overeenkomstige 0 ug / ml OMV. (B) mBMDM van muizen met verschillende genetische achtergronden (WT, TLR2 - / - en TRIF / MyD88 - / -) werden vooraf geïncubeerd met 0,1 ug / ml L. pneumophila OMV gedurende 20 uur en werden vervolgens geïnfecteerd met een flagellin- deficiënte mutant van L. pneumophila Corby (MOI 0,5) gedurende 48 uur. mBMDM werden gelyseerd door de toevoeging van saponine en de Legionella werden geplaat op agarplaten BCYE. De CFE werd berekend op 0 ug / ml OMV, aangeduid door de getrokken lijn. De balken geven de gemiddelde waarden ±± SEM van drie onafhankelijke experimenten, elk in duplo uitgevoerd. mBMDM van WT-muizen vertoonden een stijging van L. pneumophila replicatie na OMV voorbehandeling. TLR2 - / - macrofagen vertoonden significant verminderde <em&gt; Legionella replicatie die vergelijkbaar TRIF / MyD88 was - / - mBMDM. Statistieken: Mann-Whitney-test; p &lt;0,05 in vergelijking met de WT sample. Overgenomen met toestemming van referentie 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We beschrijven de zuivering van Legionella pneumophila (L. pneumophila) buitenmembraan vesicles (OMV) van vloeibare kweken. Deze gezuiverde blaasjes worden vervolgens gebruikt voor de behandeling van macrofagen aan de pro-inflammatoire potentieel analyseren.

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Het algemene doel van deze studie is om Outer Membrane Vesicles (OMV's) van Legionella pneumophila op een gestandaardiseerde manier te zuiveren en hun invloed op bacteriële replicatie in humane en muïse macrofagen te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar outer membrane vesicles. Zo kan de gestandaardiseerde procedure voor de preparatie van OMV's helpen bij het bestuderen van hun impact op de interactie tussen gastheer en pathogeen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gestandaardiseerd protocol biedt om de impact van Legionella pneumophila OMVs op menselijke of muïse macrofagen te bestuderen, wat ons begrip van de pathogeniteit van Legionella pneumophila zal verbeteren. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we nadachten over het mogelijke pro-inflammatoire potentieel van OMVs en hoe dit het verloop van de infectie zou kunnen beïnvloeden, aangezien OMVs door Legionella zowel binnen de gastheercel als extracellulair worden afgegeven. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kerstin Hoffmann, een technicus uit mijn laboratorium, en Analina Young, een postdoctoraal onderzoeker.Om te beginnen wordt L.pneumophila stam core B onder steriele omstandigheden uitgeplaat op BCYE-agarplaten en gedurende drie dagen geïncubeerd bij 37 °C. Gebruik de L.pneumophila van een precultuurplaat om 10 ml YEB-medium te inoculeren tot een OD600 van 0,3 en incubeer de bacteriën gedurende zes uur bij 37 °C op een roterende schudmachine. Verifieer de zuiverheid van de vloeistofcultuur door 100 µL van de suspensie uit te platen op een bloedagarplaat.Incubeer de bloedagarplaat gedurende de nacht bij 37 °C. Voeg de resterende vloeibare cultuur toe aan 90 milliliters vers YEB-medium en incubeer de cultuur op een rotatieschudder totdat een OD600 van 3,0 tot 3,5 wordt bereikt. Centrifugeer de vloeibare cultuur bij 4 000 g gedurende 20 minuten om de bacteriën te pelletteren.Schenk vervolgens het supernatant over in nieuwe centrifugebuisjes. Verwijder de bacteriële pellets en centrifugeer de monsters opnieuw voordat de centrifugatiestap nogmaals wordt herhaald. Filtersteriliseer daarna het resterende supernatant tweemaal.Breng vervolgens het bacterievrije supernatant over naar ultracentrifugebuizen en centrifugeer de monsters bij 100 000 g bij vier graden Celsius gedurende drie uur. Giet het supernatant af en gooi dit weg. Gebruik daarna steriele PBS om de OMV-pellets opnieuw te suspenderen en voeg deze samen.Herhaal de ultracentrifugatiestap om contaminerende eiwitten en vrij LPS te verwijderen. Gooi nu het supernatant weg en droog de ultracentrifugebuis met een steriel wattenstaafje. Resuspendeer het OMV-pellet in 500 microliters steriele PBS.Strijk vervolgens telkens 20 µL uit op bloedagar- en BCYE-agarplaten om bacteriële contaminatie van de geprepareerde vesikel uit te sluiten. Incubeer de bloedagarplaat gedurende één nacht en de BCYE-agarplaat gedurende drie dagen. Gebruik de BCYE-assay volgens de instructies van de fabrikant om de eiwithoeveelheid van de verkregen OMV-preparatie te kwantificeren.Nadat de THP-1-cellen zijn gedifferentieerd tot macrofagen volgens het tekstprotocol, vervangt u het differentiatiemedium door 500 microliters vers medium en incubeert u de cellen nogmaals 24 uur bij 37 graden Celsius. Om THP-1- of murine BMDM-cellen met OMV's te behandelen, ontdooit u eerder bereide OMV's en voegt u de juiste hoeveelheid toe aan de cellen. Incubeer de macrofagen met OMV's bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 20 uur om voorbehandelde of onbehandelde THP-1-cellen te infecteren met de wild-type L.pneumophila-stam core B, of murine BMDM-cellen met een flagel-deficiënte mutant van deze stam, zonder het medium van de cellen te verversen.Voeg bacteriën toe bij een MOI van 0,5, wat overeenkomt met 1 × 10⁵ L.pneumophila per well. Incubeer de culturen gedurende respectievelijk 24 en 48 uur. Voeg om de cellen te lyseren saponine toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% en incubeer de cellen gedurende vijf minuten.Resuspendeer vervolgens de gelyseerde macrofagen door te pipetteren en breng de suspensie over naar een reactievat. Gebruik steriele PBS om seriële verdunningen van de L.pneumophila-suspensie te bereiden. Ent vervolgens 50 microliters van de benodigde verdunningen uit op BCYE-agarplaten en incubeer de platen gedurende drie dagen.Tel de gevormde koloniën visueel en voer de berekeningen uit volgens het tekstprotocol. In dit experiment, waarbij het pro-inflammatoire potentieel van L.pneumophila OMVs wordt onderzocht, reageren PMA-gedifferentieerde THP-1-cellen met een tijd- en dosisafhankelijke toename in de secretie van IL-8 en IL-6. Hier werd de invloed van verschillende toll-like receptoren op de herkenning van L.pneumophila OMV's geanalyseerd in muizen-BMDM's met verschillende genetische achtergronden met behulp van een CXCL-1 ELISA-assay.Murine BMDM's van wild-type muizen scheidden CXCL-1 uit na OMV-stimulatie, terwijl murine BMDM's van TLR2/4-dubbele knock-outs significant minder scheidden. Om de impact van L.pneumophila-OMV's op de bacteriële replicatie in THP-1-macrofagen te bestuderen, werden de cellen gedurende 20 uur gepre-incubeerd met OMV's en vervolgens aanvullend geïnfecteerd met L.pneumophila. De pre-stimulatie van THP-1-afgeleide macrofagen vermindert eerst de bacteriële replicatie dosisafhankelijk na 24 uur infectie, terwijl het op een later tijdstip leidt tot een verdubbeling van het CFU-getal.Zoals in dit experiment wordt aangetoond, resulteert de prestimulatie van murine BMDM's met OMV's in een tienvoudige toename van het CFU-aantal in murine BMDM's van wild-type dieren, terwijl TLR2-knock-out en TRIF/MyD88-macrofagen deze toename in L.pneumophila-replicatie na OMV-pre-incubatie niet vertonen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om onder steriele omstandigheden te werken en te controleren op bacteriële contaminatie van de gezuiverde OMV's. Anders geeft de daaropvolgende analyse geen conclusieve resultaten.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals nanoparticle tracking-analyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke Legionella-mutant meer of minder OMV's produceert, of om het effect van verschillende stresscondities op de secretie van OMV's te onderzoeken. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van OMV-onderzoek om de impact van OMV's op gastheer-pathogeen interacties in vitro en vervolgens in vivo te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe OMV's gezuiverd moeten worden en hoe u het effect ervan op de daaropvolgende infectie van macrofagen kunt analyseren.Dit protocol kan vervolgens worden toegepast op verschillende gramnegatieve bacteriën en hun respectievelijke gastheercellen na het aanpassen van de incubatie- en groeitijden. Houd er rekening mee dat werken met Legionella pneumophila extreem infectieus kan zijn voor mensen; daarom moet het werk altijd onder een steriele tafel worden uitgevoerd bij het hanteren van Legionella en het uitvoeren van deze procedure.

legionella-pneumophila-outer-membrane-vesicles-isolation-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor de isolatie en zuivering van...

Zuivering van Pathogeen vacuolen uit<em&gt; Legionella</em&gt;-Geïnfecteerde Fagocyten

Source: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the pre-treatment of macrophages with Legionella pneumophila outer membrane vesicles (OMVs) to examine their effect on bacterial replication. By altering host immune signaling, OMVs make macrophages more permissive to infection. Higher colony counts in treated cells, compared to untreated ones, indicate...

Assaying Legionella pneumophila Replication in Macrophages Pretreated with Outer Membrane Vesicles

Source: Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the isolation of outer membrane vesicles (OMVs) from Legionella pneumophila using sequential centrifugation, sterile filtration, and ultracentrifugation. The purified OMVs, enriched in membrane proteins and lipopolysaccharides, are suitable for host-pathogen interaction studies.

Ultracentrifugation-Based Isolation of Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles

In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

This video demonstrates a technique to study NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome formation in primary macrophages via immunofluorescence. The macrophages are first primed with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to upregulate NLRP3 protein expression. Exposing the macrophages to nigericin—a potassium ionophore—leads to the activation of NLRP3 and the formation of inflammasomes, which are visualized via immunofluorescence.

An In Vitro Technique to Study Inflammasome Complex Formation in Macrophages

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

De larve van de wasmot Galleria mellonella werd onlangs opgericht als een in vivo model om Legionella pneumophila infectie te bestuderen. Hier tonen we basistechnieken de pathogenese van Legionella karakteriseren de larven, zoals inoculatie meting van bacteriële virulentie en replicatie en extractie en analyse van geïnfecteerde hemocytes.

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Leer een gestandaardiseerde methode voor het isoleren van Outer Membrane Vesicles van Legionella pneumophila en het analyseren van hun pro-inflammatoire effecten op macrofagen. Dit protocol verbetert het inzicht in gastheer-pathogeen interacties.

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Meer video's verkennen