Name: Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie In Situ Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer interchromosomale stabiele aberraties detecteren in muizenbeenmerg met mFISH en SKY na totale lichaamsbestraling. Deze techniek maakt geleide visualisatie van stralingsgeïnduceerde genetische schade mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door Arkansas Space Grant Consortium en het National Space Biomedical Research Instituut met behulp van National Aeronautics and Space Administration, verleent NNX15AK32A (RP) en RE03701 (MH-J), en P20 GM109005 (MH-J), en de Amerikaanse Veterans Administration ( MH-J). Wij danken Christopher Fettes, Program Coordinator voor het Ministerie van Milieu en Occupational Health aan de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen, voor redactionele ondersteuning bij de voorbereiding van het manuscript.

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen. Alle dieren werden gehuisvest onder standaard voorzien van airconditioning, dier faciliteit bij 20 ± 2 ° C met 10 - 15 per uur cycli van frisse lucht en gratis toegang tot standaard knaagdier voedsel en water. Bij aankomst werden de muizen in quarantaine gehouden voor 1 week en op voorwaarde dat gecertificeerd knaagdieren chow. 1.Radiation Exposure en in vivo Arrestatie van metafasecellen <ol><li> Expose un-verdoofde muizen tot 2 Gy hele lichaam straling in een bestralingskamer. Tijdens de bestraling, plaats muizen in een goed geventileerde Holding kamer om ervoor te zorgen dat ze niet vrij kunnen bewegen en een uniforme dosering te ontvangen. </li><li> Injecteer 100 ui 0,05% colchicine-oplossing (colchicine poeder opgelost in calcium en magnesium vrij PBS) intraperitoneaal met behulp van een 25 G naald bevestigd met 1 ml wegwerpspuit. Vermijd injectie direct in een orgaan. </li><li> Laat het dier in de kooi 2 uur vóór beenmerg celoogst. Observeer het dier op tekenen van pijn of angst. </li></ol> 2. Bone Marrow Cell Oogst en isolatie van Bone Marrow mononucleaire cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie <ol><li> Euthanaseren de muis door CO 2 stikken. </li><li> Spray 70% ethanol op de rug- en buikzijde. </li><li> Maak een 2 cm incisie op de buikhuid met een scherpe schaar. Pak de huid aan beide zijden van de incisie met stompe pincet en trek open de buikspieren. </li><li> Snijd beide achterpoten met een schaar en ze onmiddellijk plaatsen in pre-gekoelde PBS met 4% FBS. </li><li> Reinig alle spieren aan de achterste ledematen met een scherp scheermesje en katoen gaasverband. </li><li> Scheid de tibia van het dijbeen. Trim beide uiteinden van elk bot met een scheermesje. </li><li> Spoel de inhoud van het beenmerg met 3 ml PBS (met 4% FBS) met een 23 G naald bevestigd aan een 3 ml spuit en laat de inhoud in een 15 ml centrifugebuis. Langs de celsuspensie tenminste 10 maal door de naald om een ​​enkele celsuspensie te maken. </li><li> overlay voorzichtig de celsuspensie op een gelijk volume van lymfocyt scheidingsmedium (3 ml) zonder de interface tussen de celsuspensie en lymfocyt scheidingsmedium. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamel de bufferlaag weg zonder de andere lagen en overdracht verstoort een nieuwe 15 ml centrifugebuis. </li></ol> 3. Voorbereiding van Metaphase Cell Spreads <ol><li> Voeg 10 ml PBS aan de buis met de bufferlaag. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Dan breken up thij celpellet met zachte tikken en voeg 10 ml PBS. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet, breken de pellet en voeg 4 ml voorverwarmde hypotone 0,075 M oplossing van kaliumchloride. Voeg hypotone oplossing druppelsgewijs met zachte constant schudden. </li><li> Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een waterbad. </li><li> Na hypotone behandeling, een gelijk deel (4 ml) fixatief (methanol: ijsazijn, 3: 1 v / v) in 15 mL buis en meng voorzichtig door het buisje. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. </li><li> Breken de celpellet met tikken gevolgd door voorzichtig vortex gedurende enkele seconden en voeg 3 ml fixeeroplossing druppelsgewijs onder constant schudden. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, breken de cel pellet met gentle tikken, en voeg 3 ml vers fixeermiddel. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en de bovenstaande vloeistof. Breek de celpellet met zachte tikken, en voeg vers 3 ml fixeermiddel. </li><li> Herhaal stap 3.12 nog twee keer. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder supernatant zonder de celpellet. Voeg vervolgens 400 tot 600 ul fixatief en meng met pipetteren. </li><li> Drop 30 pi vaste cellen op pre-gereinigd en nat slides gekanteld in een hoek van 45 ° en laat de dia&#39;s aan de lucht drogen volledig &#39;s nachts. </li></ol> 4. Muis Chromosome schilderij van mFISH <ol><li> Chromosome Denaturation <ol><li> Plaats de dia met metafase cel spreads in 2x SSC gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Dehydrateer de schuif door seriële ethanol wassen gedurende 2 minuten elk in 70%, 80% en 100%. Incubeer gedurende 60 minuten bij 65 ° C. </li><li> Verwarm 40 ml denaturatie-oplossing (70% formamide / 2x SSC; pH 7,0) tot 70 ° C (± 2 ° C) in een glazen Coplin jar gedurende 30 min. Denatureren chromosomen door incubatie van de dia in voorverwarmde denaturatie oplossing voor 1-1,5 min. </li><li> Quench glijden onmiddellijk in ijskoude 70% ethanol gedurende 2 minuten om de denaturatie te stoppen en te voorkomen dat het gedenatureerde chromosomen van opnieuw annealing. uitdrogen dan door wassen met 80% ethanol gedurende 2 minuten. Herhaal de ethanol wassen met 100% ethanol gedurende 2 minuten. Volledig droog de glijbaan bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Denaturatie en hybridisatie van Probe Mengsel <ol><li> Kort gecentrifugeerd probe mengsel van de fabrikant, overdracht 10 pi probe mengsel in een 500 pi snap cap centrifugebuis en denatureren door incubatie bij 80 ° C (± 2 ° C) in een waterbad gedurende 7 min. </li><li> Plaats de centrifugebuis met probe mengsel in een waterbad bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Breng het gedenatureerde probe mengsel op de dia met gedenatureerde chromosomes. </li><li> Zorgvuldig bestrijken het gebied met een 18 mm x 18 mm glazen afdekplaat slip en te elimineren zichtbare luchtbellen door zeer voorzichtig te drukken op de cover slip te glijden. Dicht alle vier zijden van het dekglaasje met rubber cement en incubeer gedurende 12 h tot 16 h in het donker bij 37 ° C in een vochtige kamer voor hybridisatie. </li></ol></li><li> Bericht Hybridisatie Wassen en detectie <ol><li> Verwijder voorzichtig de rubber cement en het deksel slip. </li><li> Plaats slide in voorverwarmde 0,4x SSC bij 74 ° C (± 2 ° C) gedurende 5 minuten. </li><li> Wassen dia in wasoplossing II (4x SSC / 0,1% Tween-20) gedurende 2 min. </li><li> Plaats 20 gl anti-fade fixeermiddel met DAPI tegenkleuring (1,5 ug / ml) en bedek met een dekglaasje bedekt. Druk voorzichtig op de dekglaasje met lab weefsel luchtbellen en overtollige montage oplossing te verwijderen. Sluit de randen van dekglaasje met nagellak. </li><li> Bekijk dia&#39;s met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met passende filters. </li></ol></li&gt; </ol> 5. Spectral Karyotypering (SKY) van de muis Chromosomen <ol><li> Chromosoom en Probe Denaturation <ol><li> Equilibreren dia in 2 x SSC bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, zonder schudden. </li><li> Dehydrateren dia in een ethanolreeks (70%, 80% en 100% ethanol) gedurende 2 min elk bij kamertemperatuur. Air-droog de dia om de ethanol volledig te verwijderen. </li><li> Warme 40 ml denaturatie-oplossing (70% formamide / 2xSSC; pH 7,0) in een glazen Coplin jar gedurende 30 min. </li><li> Incubeer dia in voorverwarmde oplossing denaturatie gedurende 1 tot 1,5 minuten. </li><li> Onmiddellijk dompel de dia in ijskoude 70% ethanol gedurende 2 minuten om de denaturatie te stoppen en te voorkomen dat het gedenatureerde chromosomen van opnieuw annealing. </li><li> Dehydrateer de schuif door deze in 80% ethanol gedurende 2 minuten en vervolgens in 100% ethanol gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Denatureren de SKY sonde (flacon # 1 door fabrikant) in een waterbad ingesteld op 80 ° C (± 2 ° C)gedurende 7 min, en vervolgens onmiddellijk te plaatsen in een andere waterbad ingesteld op 37 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Hybridisatie probe <ol><li> Voeg 10 ul gedenatureerde probe SKY op het gedenatureerde chromosomen. </li><li> Plaats voorzichtig een 18 mm x 18 mm glas dekglaasje op de SKY sonde, zodat er geen luchtbellen gevangen onder het dekglaasje. </li><li> Dicht de randen van het dekglaasje met rubber cement. </li><li> Plaats het preparaat in een bevochtigde lichtdichte kamer en incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende 24 uur tot 36 uur. </li></ol></li><li> Post-hybridisatie Wassen en fluorescentiedetectie <ol><li> Verwijder rubber cement heel voorzichtig, zonder het dekglaasje verstoren. </li><li> Plaats het preparaat in voorverwarmde snelle wasoplossing (0.4x SSC) bij 72 ° C (± 2 ° C) gedurende 5 minuten onder constant schudden. Dompel dia in wasoplossing III (4x SSC / 0,1% Tween 20) en incubeer gedurende 1 min onder schudden. </li><li> Optioneel: Voeg 80 ul van het blokkeren van reagens(Buisje # 2 door fabrikant) op het gebied van hybridisatie plaats een 24 mm x 60 mm plastic dekglaasje en incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende 30 min in een vochtige kamer. </li><li> Verwijder voorzichtig de plastic dekglaasje en was de dia met voorverwarmde (45 ºC) wasoplossing III gedurende 5 minuten. </li><li> Toepassen 80 pi van Cy5 kleuring reagens (flesje # 3 van fabrikant), plaats een 24 mm x 60 mm plastic dekglaasje en incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 40 min in een vochtige kamer. </li><li> Dompel de dia in een glazen Coplin pot met voorverwarmde (45 ° C) wasoplossing III (4x SSC / 0,1% Tween 20) en incubeer bij 45 ° C in een waterbad gedurende 2 min onder schudden. Herhaal deze wasstap 3 keer. </li><li> Toepassen 80 pi van Cy5.5 de kleurstof (buisje # 4 door fabrikant), plaats een 24 mm x 60 mm plastic dekglaasje en incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 40 min in een vochtige kamer. </li><li> Was de dia 3 maal met voorverwarmde (45 ºC) wasoplossing III. </li><li> Houd de dia in een gekantelde positie tegen een papieren handdoek om overtollig vocht af te voeren. Voeg 20 ul anti-fade DAPI reagens (flesje # 5 van de fabrikant) en voorzichtig plaats een 24 mm x 60 mm glas dekglaasje, zonder de invoering van eventuele luchtbellen. Sluit de randen van dekglaasje met nagellak en te observeren met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust voor het vastleggen van beelden SKY. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kodama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+chromosome+aberrations+in+atomic+bomb+survivors%3A+results+from+25+years+of+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation.</a> Radiat Res. 156, 337-346 (2001).</li>
<li>Lucas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+signature+for+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic signature for ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).</li>
<li>Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+radiation-induced+aberrations+in+patients+with+Hodgkin%27s+disease.+Possible+correlation+with+second+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Boll.+Ist.+Sieroter.+Milan%22%5BJournal%5D)">Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy?</a> Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).</li>
<li>Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+and+limitations+of+chromosome+banding+in+pre-+and+postnatal+service+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics.</a> Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+chromosome+aberrations+persist+in+individuals+many+years+after+occupational+exposure+to+densely+ionizing+radiation%3A+an+mFISH+study%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study.</a> Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li>
<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Hopman, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-color+detection+of+two+target+DNAs+by+non-radioactive+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization.</a> Histochemistry. 85, 1-4 (1986).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+fluorescence+in+situ+hybridization+for+the+simultaneous+detection+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences.</a> Cytometry. 10, 20-27 (1989).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Multiple fluorescence in situ hybridization.</a> Cytometry. 11, 126-131 (1990).</li>
<li>Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+spectral+karyotyping+%28SKY%29+in+biodosimetry+for+the+triage+situation+following+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation.</a> Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).</li>
<li>Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+analysis+by+the+FISH-painting+method+for+retrospective+dose+reconstruction+in+individuals+exposed+to+ionizing+radiation+10+years+after+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure.</a> Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).</li>
<li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+%27Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).</li>
<li>Bauchinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).</li>
<li>Hieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangements+in+post-Chernobyl+papillary+thyroid+carcinomas%3A+evaluation+by+spectral+karyotyping+and+automated+interphase+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH.</a> J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).</li>
<li>Cohen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+of+chromosome+rearrangements+in+two+cases+of+tMDS+with+a+complex+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype.</a> Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).</li>
<li>Pathak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vitamin+E+Analog+Gamma-Tocotrienol+%28GT3%29+Suppresses+Radiation-Induced+Cytogenetic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage.</a> Pharm Res. , (2016).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).</li>
<li>Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+improving+metaphase+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new method for improving metaphase chromosome spreading.</a> Cytometry A. 51, 46-51 (2003).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+exposure+to+densely+ionizing+radiation+leaves+a+unique+permanent+signature+in+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome.</a> Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).</li>
<li>Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+long-term+effects+of+ionizing+radiation+through+measurement+of+current+sister+chromatid+exchange+%28SCE%29+rates+in+radiology+technologists%2C+compared+with+previous+SCE+values%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values.</a> Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fluorescent+chromosome+painting+using+the+peroxidase%2Fdiaminobenzidine+%28DAB%29+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction.</a> Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).</li>
<li>Kakazu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spectral+colour+banding+in+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis.</a> Lancet. 357, 529-530 (2001).</li>
<li>Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mFISH+analysis+of+chromosomal+damage+in+bone+marrow+cells+collected+from+CBA%2FCaJ+mice+following+whole+body+exposure+to+heavy+ions+%2856Fe+ions%29%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Environ+Biophys%22%5BJournal%5D)">mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions).</a> Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).</li>
<li>Abrahams, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+FISHing+of+transgenic+mice+recommended%3A+FISH+and+SKY+define+BAC-mediated+balanced+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation.</a> Genesis. 36, 134-141 (2003).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+scoring+of+FISH-%26%2334%3Bpainted%26%2334%3B+chromosome-type+exchange+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">On the scoring of FISH-&#34;painted&#34; chromosome-type exchange aberrations.</a> Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+%22painting%22+patterns+resulting+from+complex+exchanges%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges.</a> Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).</li>
<li>Tucker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAINT%3A+a+proposed+nomenclature+for+structural+aberrations+detected+by+whole+chromosome+painting%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting.</a> Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).</li>
<li>Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-based+analysis+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+using+different+nomenclature+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems.</a> Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).</li>
<li>Lucas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+translocation+frequency+analysis+in+humans+decades+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).</li>
<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Verschillende kritische stappen bepalen het succes van mFISH en SKY. De eerste en meest kritische stap is het colchicine behandeling in vivo mitose van het beenmerg mononucleaire cellen te optimaliseren. De colchicine concentratie en de duur van de behandeling individueel of in onderling overleg bepalen de mitotische index evenals chromosoom condensatie-twee belangrijke voorwaarden voor een effectieve chromosoom schilderij. Een hoge concentratie colchicine of langere behandeltijd leidt tot zeer gecondenseerde c...

De twee meest betrouwbare methoden voor het identificeren van straling-geïnduceerde stabiele inter-chromosomale afwijkingen zijn multiple fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH), die het mogelijk maakt om twee of meer chromosomen gelijktijdig te kleuren, en spectraal karyotypering (SKY), die een aparte kleur geeft aan elk homoloog chromosoombeslag in het genoom. In tegenstelling tot onstabiele afwijkingen, zijn stabiele afwijkingen van persistente aard en kunnen ze voor meerdere generaties worden overgedragen in bestraalde populaties1, en worden ze beschouwd als kritische moleculaire "handtekeningen" van door straling geïnduceerde cytogenetische laesies2. Studies van verschillende groepen hebben aangetoond dat stabiele afwijkingen geassocieerd zijn met de pathogenese en ontwikkeling van een aantal ziekten, inclusief kanker3. Voor de era van chromosoombeschildering (ook wel moleculaire cytogenetica genoemd), was de conventionele G-banding techniek de enige methode voor het detecteren van stabiele chromosomale afwijkingen. Echter, chromosoombeschildering is een uitdaging voor cytogenetici omdat de resolutie beperkt is, de reproduceerbaarheid onzeker is, het een arbeidsintensieve procedure is, en het vereist hoog gekwalificeerde en ervaren cytogenetici voor betrouwbare data-interpretatie4. Bovendien, staat de klassieke banding techniek de detectie niet toe van complexe chromosomale herschikkingen, die de interactie van drie of meer breuken omvatten die verdeeld zijn over twee of meer chromosomen, een veelvoorkomend resultaat van stralingsschade. Complexe afwijkingen kunnen bij individuen vele jaren na stralingsblootstelling aanhouden, waardoor ze bruikbaar zijn voor retrospecieve biodosimetrie5. Daarom, was een alternatieve aanpak vereist om de beperkingen van conventionele bandingtechnieken te overwinnen voor het detecteren van stabiele chromosomale herschikkingen.
In de late jaren 1960, startte het pionierswerk van Gall en Pardue (1969) over moleculaire hybridisatie met behulp van nucleïnezuur sondes gelabeld met radioactief materiaal een nieuwe era in het gebied van cytogenetica, die de detectie van een specifiek DNA-sequentie op chromosomen mogelijk maakte6. Echter, het gebruik van radioactieve sondes voor moleculaire hybridisatie had verschillende nadelen: radioactieve sondes zijn relatief onstabiel, de sondeactiviteit is afhankelijk van de radioactieve verval van het gebruikte isotoop, hybridisatie duurt langer, de resolutie is beperkt, de sondes zijn relatief duur, en de radioactieve materialen zijn een gevaar voor de gezondheid. Daarom werd het noodzakelijk om niet-radioactieve sondes te ontwikkelen en te ontwerpen. De introductie van fluorescente gelabelde nucleïnezuur sondes in de jaren 1980 en 1990 overwon de beperkingen van radioactieve sondes en verbeterde de veiligheid, gevoeligheid en specificiteit van de hybridisatietechniek aanzienlijk7-10. Fluorescente sondes geven aanleiding tot extreem heldere signalen wanneer ze worden waargenomen onder fluorescentiemicroscopen uitgerust met de juiste excitatie- en emissiefilters. Elke verlies, winst of herschikking van fluorescent gelabelde chromosoombeslag/en of een deel van het chromosoom is gemakkelijk identificeerbaar met deze FISH-techniek.
Analyse van chromosomale afwijkingen door FISH schilderen heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in cytogenetisch onderzoek door de jaren heen. Het ontwerpen van fluorescent gelabelde sondes voor specifieke toepassingen variërend van locus-specifieke sondes tot hele-chromosoom schilderende sondes heeft het veld aanzienlijk gevorderd; dit heeft ook de detectie van submicroscopische ("cryptische") herschikking mogelijk gemaakt, wat niet mogelijk was door conventionele chromosoombeschildering. Chromosoombeschildering door mFISH en SKY hebben zich bewezen als waardevolle hulpmiddelen voor de identificatie van eenvoudige en complexe inter-chromosomale herschikkingen. De basisprincipes voor beide technieken zijn vergelijkbaar, maar de methode van detectie en discriminatie van fluorescent signaal na in situ hybridisatie en het proces van beeldverwerving zijn anders. In mFISH, worden aparte beelden van elk van de vier fluorochromen vastgelegd door gebruik te maken van nauwkeurige bandpass microscoopfilters; gespecialiseerde software wordt dan gebruikt om de beelden te combineren. Terwijl in SKY, beeldverwerving gebaseerd is op een combinatie van epifluorescentie microscopie, charge-coupled device beeldvorming, en Fourier spectroscopie, wat de meting van het gehele emissiespectrum mogelijk maakt met een enkele blootstelling op alle beeldpunten. In zowel mFISH als SKY, worden monochrome beelden onafhankelijk vastgelegd, vervolgens samengevoegd, en uiteindelijk worden unieke pseudo-kleuren toegewezen aan de chromosomen in monochrome beelden op basis van de specifieke kleurstof die aan elke fluorochroom sonde is gekoppeld.
De bijdrage van mFISH en SKY analyse in het gebied van stralingsbiologie is opmerkelijk, met name voor retrospectief dosisschatting van menselijke blootstelling aan IR (stralingsbiodosimetrie)11-14, risicoschatting van stralingskanker15, evenals detectie en risicoschatting van radiotherapie-gerelateerde secundaire kanker16. Een recente studie bij muizen heeft aangetoond dat een FISH-gebaseerde chromosoombeschilderingstechniek ook een belangrijk hulpmiddel is voor het evalueren van de effectiviteit van stralingsbescherming17. In de huidige studie, is het effect van totale lichaamsstraling blootstelling op de inductie van stabiele chromosomale afwijkingen in de beenmergcellen van muizen gedemonstreerd met behulp van mFISH en SKY technieken.

<table><tbody><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20× Concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY Laboratory Reagent for Mouse</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - Concentrated Antibody Detection Kit</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Glass Staining Dishes&nbsp; with Screw Cap</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator</td><td>J. L. Shepherd &amp; Associates</td><td>Model 484B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Microscope</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van inter-chromosomale stable aberraties door multiple fluorescentie<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie (mfish) en spectral karyotypering (sky) in bestraalde muizen

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ioniserende straling (IR) induceert talrijke stabiele en onstabiele chromosomale aberraties. Onstabiele aberraties, waarbij de chromosoommorfologie aanzienlijk wordt aangetast, kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door conventionele chromosoomkleuringstechnieken. De detectie van stabiele aberraties, die betrekking hebben op uitwisseling of translocatie van genetisch materiaal zonder aanzienlijke wijziging in de chromosoommorfologie, vereist echter geavanceerde chromosoomkleuringstechnieken die afhankelijk zijn van in situ hybridisatie van fluorescent gelabelde DNA-sondes, een chromosoomkleuringstechniek die populair bekend staat als fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). FISH-sondes kunnen specifiek zijn voor volledige chromosooom(en) of precieze subregio's op chromosooom(en). De methode staat niet alleen de visualisatie van stabiele aberraties toe, maar kan ook de detectie mogelijk maken van het/de chromosooom(en) of specifiek DNA-sequentie(s) die betrokken zijn bij een specifieke aberratievorming. Er zijn verschillende chromosoomkleuringstechnieken beschikbaar in de cytogenetica; hier worden twee zeer gevoelige methoden, meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY), besproken om inter-chromosomale stabiele aberraties te identificeren die zich vormen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling. Hoewel beide technieken afhankelijk zijn van fluorescent gelabelde DNA-sondes, zijn de detectiemethode en het proces van beeldverwerving van de fluorescente signalen anders. Deze twee technieken zijn gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, zoals stralingsbiologie, kankercytogenetica, retrospecieve stralingsbiodosimetrie, klinische cytogenetica, evolutionaire cytogenetica en vergelijkende cytogenetica.

Total body bestraling induceert talrijke chromosomale afwijkingen in de beenmergcellen van bestraalde muizen. Het huidige protocol is geoptimaliseerd voor in vivo mitose van beenmergcellen na blootstelling aan straling, oogst van beenmergcellen van de achterpoten van bestraalde muizen, de isolatie van beenmerg mononucleaire cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie, bereiding van metafase cel smeersels, en daaropvolgende detectie van straling veroorzaakte stabiele chromosomal...

Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Het algemene doel van deze moleculaire cytogenetische methode is het observeren van interchromosomale stabiele aberraties in de beenmergcellen van muizen die zijn blootgesteld aan totale lichaamsbestraling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de stralingsbiologie, zoals het risico op het induceren van stabiele chromosoomaberraties in de beenmergcellen van muizen die zijn blootgesteld aan totale lichaamsbestraling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gerichte visualisatie mogelijk maakt van stralingsgeïnduceerde stabiele genetische schade in de beenmergcellen van muizen, die over vele celgeneraties heen kan worden voortgeplant.Nadat het beenmerg uit het dijbeen en scheenbeen van de muis is geïsoleerd en een single-cell suspensie is gemaakt volgens het tekstprotocol, wordt de celsuspensie voorzichtig over een gelijk volume scheidingsmedium voor mononucleaire cellen uit het beenmerg gelaagd. Centrifugeer de gradiënt bij 400 ×g bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verzamel vervolgens voorzichtig de buffy coat zonder de overige lagen te verstoren en breng de oplossing over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml.Om metafase-celpreparaten te maken, voegt u 10 milliliters PBS toe aan de buis met de buffy coat. Centrifugeer de buis vervolgens 5 minuten lang bij 400 times G bij kamertemperatuur. Verwijder daarna voorzichtig het supernatant en tik zachtjes tegen de buis om de celpellet op te lossen.Voeg vervolgens 10 milliliters PBS toe en centrifugeer de suspensie opnieuw. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Breek de pellet open en voeg druppelgewijs vier milliliters voorverwarmde hypotone 0.075 molar kaliumchloride-oplossing toe onder voorzichtig, constant schudden.Incubeer de celsuspensie gedurende 20 minuten bij 37 °C in een waterbad. Voeg vervolgens een gelijk volume fixeerder toe aan de buis en meng voorzichtig door de buis om te keren. Centrifugeer de buis en verwijder het supernatant.Breek vervolgens het celpellet op en voeg vers fixatief toe. Herhaal het centrifugeren en het toevoegen van fixatief nog vijf keer. Nadat de cellen zijn resuspendeerd in 400 tot 600 µL fixatief, worden 30 µL van de gefixeerde cellen op vooraf gereinigde en natte objectglazen gedruppeld die onder een hoek van 45 graden zijn geplaatst; laat de objectglazen gedurende de nacht volledig aan de lucht drogen.Om muizchromosoompainting via mFISH uit te voeren, plaatst u de objectglas met de metafase-celpreparaten gedurende twee minuten in 2X SSC bij kamertemperatuur. Dehydrateer vervolgens het objectglas door seriële ethanolwassingen in 70%, 80% en 100% ethanol gedurende twee minuten per wasbeurt. Verwarm 40 milliliter denaturatieoplossing in een glazen Coplin-pot voor tot 70 °C gedurende 30 minuten.Kruis vervolgens de slide over naar de voorverwarmde oplossing en incubeer het monster gedurende één tot 1 1/2 minuut om de chromosomen te denatureren. Gebruik onmiddellijk ijskoud 70% ethanol om de slide gedurende twee minuten te quenchen, om zo het denaturatieproces te stoppen en te voorkomen dat de gedenatureerde chromosomen opnieuw annealen. Dehydrateer de slide vervolgens met een ethanolserie, beginnend met 80% ethanol gedurende twee minuten.Plaats vervolgens de objectglas gedurende twee minuten in 100% ethanol. Laat het objectglas daarna volledig drogen bij kamertemperatuur. Om de probe te denatureren, centrifugeert u kortstondig het door de fabrikant geleverde probemengsel, brengt u vervolgens 10 µL over in een snap cap centrifugebuis van 500 µL en incubeert u de buis zeven minuten in een waterbad bij 80 °C.Plaats nu de buis met de gedenatureerde probe 10 minuten lang in een waterbad van 37 °C. Breng vervolgens het probemengsel aan op een objectglas met gedenatureerde chromosomen. Bedek het gebied voorzichtig met een glazen dekglas van 18 millimeter bij 18 millimeter en verwijder eventuele zichtbare luchtbellen door het dekglas zeer voorzichtig op het objectglas te drukken.Gebruik rubbercement om alle vier de zijden van het dekglas af te dichten. Incubeer het preparaat vervolgens in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 12 tot 16 uur. Verwijder na de hybridisatie voorzichtig het rubbercement en het dekglas en plaats het preparaat gedurende vijf minuten in voorverwarmde 0.4X SSC bij 74 °C.Breng het preparaat vervolgens gedurende twee minuten over in wasoplossing drie. Voeg 20 µL antifade monteermiddel met DAPI-tegenkleuring toe aan het preparaat en dek dit af met een glazen dekglas. Gebruik laboratoriumpapier om voorzichtig op het dekglas te drukken om eventuele luchtbellen en overtollig monteermiddel te verwijderen.Gebruik vervolgens nagellak om de randen van het dekglas af te dichten. Bekijk de preparaten met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met de juiste filters. Voor spectrale karyotypering van muizenchromosomen brengt u 80 microliters SY5-kleuringsreagens aan op het preparaat, nadat de probes op de gedenatureerde chromosomen zijn gehybridiseerd en de monsters volgens het tekstprotocol zijn gewassen.Plaats een plastic dekglas van 24 bij 60 millimeter bovenop het monster en incubeer dit in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 40 minuten. Dompel de objectglas in een glazen Coplin-pot met voorverwarmde wasoplossing drie en incubeer dit in een waterbad bij 45 °C onder schudden gedurende twee minuten. Herhaal het wassen drie keer.Breng 80 µL SY5.5-kleuringsreagens aan op het monster, dek dit af met een plastic dekglas van 24 bij 60 mm en incubeer het monster in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 40 minuten. Gebruik voorverwarmde wasoplossing drie om het preparaat drie keer te wassen en houd het preparaat vervolgens schuin tegen een papieren handdoek om het overtollige vocht af te laten lopen. Voeg 20 µL antifade DAPI-reagens toe aan het monster en plaats voorzichtig een glazen dekglas erbovenop zonder luchtbellen te introduceren.Gebruik nagellak om de randen af te dichten en observeer het monster met een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust voor het vastleggen van sky-beelden. Deze figuur toont representatieve metafase-celspreads met normale en aberrante muizenchromosoomparen één, twee en drie. Hier is een stabiele aberratie waarbij chromosoom één betrokken is; een deel van chromosoom één is geïntegreerd in een niet-gekleurd DAPI-chromosoom, terwijl een ander deel een acentrisch fragment heeft gevormd.In dit voorbeeld is een deel van chromosoom twee geïntegreerd in een niet-geverfd chromosoom. Deze stabiele aberratie betreft chromosoom drie. Stabiele aberraties waarbij alle drie de geverfde chromosomen betrokken zijn, zijn zichtbaar in deze metafase-spreiding.Hier wordt een voorbeeld getoond van spectrokaryotypering van een normale vrouwelijke muis. Dit paneel representeert een stabiele aberratie waarbij chromosoom vier en 12 betrokken zijn. Ten slotte betreft de stabiele chromosomale aberratie in dit paneel chromosoom zeven en 10.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen 48 tot 72 uur worden uitgevoerd indien dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen prolifererende cellen gebruikt mogen worden. Na deze procedure kunnen deze en andere methoden, zoals in-band analyse, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of er interchromosomale stabiele aberraties aanwezig zijn in de bestraalde cellen.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van moleculaire cytogenetica om de associatie tussen genetische aberraties en diverse ziekten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een duidelijker beeld moeten hebben van hoe interchromosomale stabiele aberraties kunnen worden vastgesteld. Vergeet niet dat het werken met colchicine extreem gevaarlijk kan zijn omdat het carcinogeen is; voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van dit experiment.

detection-inter-chromosomal-stable-aberrations-multiple-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Spectral Karyotypering (SKY) is een geavanceerde cytogenetica techniek om genomische en chromosomale afwijkingen te identificeren. Deze techniek profiteert van chromosoom schilderkunst probes, waarmee indeling van alle chromosomen. SKY kan ook worden aangegeven complexe chromosoomafwijkingen en de segregatie defecten in muizen en mensen met diverse ziekten, waaronder polycystische nierziekte.

Spectral Karyotypering naar chromosoomafwijkingen bij mensen en muizen Studie met polycysteuze nierziekte

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.

Een werkwijze voor het screenen en Validatie van Resistente Mutaties Tegen kinaseremmers

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Hier presenteren we een protocol voor het verbeteren van het succes van interfase fluorescentie in situ hybridisatiedetectie op beenmerguitstrijkjes van patiënten met multipel myeloom.

Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Leer interchromosomale stabiele aberraties detecteren in muizenbeenmerg met mFISH en SKY na totale lichaamsbestraling. Deze techniek maakt geleide visualisatie van stralingsgeïnduceerde genetische schade mogelijk.

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie In Situ Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen (Video) | JoVE Journal

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie

Meer video's verkennen