Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie

Het algemene doel van deze moleculaire cytogenetische methode is het observeren van interchromosomale stabiele aberraties in de beenmergcellen van muizen die zijn blootgesteld aan totale lichaamsbestraling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de stralingsbiologie, zoals het risico op het induceren van stabiele chromosoomaberraties in de beenmergcellen van muizen die zijn blootgesteld aan totale lichaamsbestraling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gerichte visualisatie mogelijk maakt van stralingsgeïnduceerde stabiele genetische schade in de beenmergcellen van muizen, die over vele celgeneraties heen kan worden voortgeplant.

Nadat het beenmerg uit het dijbeen en scheenbeen van de muis is geïsoleerd en een single-cell suspensie is gemaakt volgens het tekstprotocol, wordt de celsuspensie voorzichtig over een gelijk volume scheidingsmedium voor mononucleaire cellen uit het beenmerg gelaagd. Centrifugeer de gradiënt bij 400 ×g bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verzamel vervolgens voorzichtig de buffy coat zonder de overige lagen te verstoren en breng de oplossing over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml.

Om metafase-celpreparaten te maken, voegt u 10 milliliters PBS toe aan de buis met de buffy coat. Centrifugeer de buis vervolgens 5 minuten lang bij 400 times G bij kamertemperatuur. Verwijder daarna voorzichtig het supernatant en tik zachtjes tegen de buis om de celpellet op te lossen.

Voeg vervolgens 10 milliliters PBS toe en centrifugeer de suspensie opnieuw. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Breek de pellet open en voeg druppelgewijs vier milliliters voorverwarmde hypotone 0.075 molar kaliumchloride-oplossing toe onder voorzichtig, constant schudden.

Incubeer de celsuspensie gedurende 20 minuten bij 37 °C in een waterbad. Voeg vervolgens een gelijk volume fixeerder toe aan de buis en meng voorzichtig door de buis om te keren. Centrifugeer de buis en verwijder het supernatant.

Breek vervolgens het celpellet op en voeg vers fixatief toe. Herhaal het centrifugeren en het toevoegen van fixatief nog vijf keer. Nadat de cellen zijn resuspendeerd in 400 tot 600 µL fixatief, worden 30 µL van de gefixeerde cellen op vooraf gereinigde en natte objectglazen gedruppeld die onder een hoek van 45 graden zijn geplaatst; laat de objectglazen gedurende de nacht volledig aan de lucht drogen.

Om muizchromosoompainting via mFISH uit te voeren, plaatst u de objectglas met de metafase-celpreparaten gedurende twee minuten in 2X SSC bij kamertemperatuur. Dehydrateer vervolgens het objectglas door seriële ethanolwassingen in 70%, 80% en 100% ethanol gedurende twee minuten per wasbeurt. Verwarm 40 milliliter denaturatieoplossing in een glazen Coplin-pot voor tot 70 °C gedurende 30 minuten.

Kruis vervolgens de slide over naar de voorverwarmde oplossing en incubeer het monster gedurende één tot 1 1/2 minuut om de chromosomen te denatureren. Gebruik onmiddellijk ijskoud 70% ethanol om de slide gedurende twee minuten te quenchen, om zo het denaturatieproces te stoppen en te voorkomen dat de gedenatureerde chromosomen opnieuw annealen. Dehydrateer de slide vervolgens met een ethanolserie, beginnend met 80% ethanol gedurende twee minuten.

Plaats vervolgens de objectglas gedurende twee minuten in 100% ethanol. Laat het objectglas daarna volledig drogen bij kamertemperatuur. Om de probe te denatureren, centrifugeert u kortstondig het door de fabrikant geleverde probemengsel, brengt u vervolgens 10 µL over in een snap cap centrifugebuis van 500 µL en incubeert u de buis zeven minuten in een waterbad bij 80 °C.

Plaats nu de buis met de gedenatureerde probe 10 minuten lang in een waterbad van 37 °C. Breng vervolgens het probemengsel aan op een objectglas met gedenatureerde chromosomen. Bedek het gebied voorzichtig met een glazen dekglas van 18 millimeter bij 18 millimeter en verwijder eventuele zichtbare luchtbellen door het dekglas zeer voorzichtig op het objectglas te drukken.

Gebruik rubbercement om alle vier de zijden van het dekglas af te dichten. Incubeer het preparaat vervolgens in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 12 tot 16 uur. Verwijder na de hybridisatie voorzichtig het rubbercement en het dekglas en plaats het preparaat gedurende vijf minuten in voorverwarmde 0.4X SSC bij 74 °C.

Breng het preparaat vervolgens gedurende twee minuten over in wasoplossing drie. Voeg 20 µL antifade monteermiddel met DAPI-tegenkleuring toe aan het preparaat en dek dit af met een glazen dekglas. Gebruik laboratoriumpapier om voorzichtig op het dekglas te drukken om eventuele luchtbellen en overtollig monteermiddel te verwijderen.

Gebruik vervolgens nagellak om de randen van het dekglas af te dichten. Bekijk de preparaten met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met de juiste filters. Voor spectrale karyotypering van muizenchromosomen brengt u 80 microliters SY5-kleuringsreagens aan op het preparaat, nadat de probes op de gedenatureerde chromosomen zijn gehybridiseerd en de monsters volgens het tekstprotocol zijn gewassen.

Plaats een plastic dekglas van 24 bij 60 millimeter bovenop het monster en incubeer dit in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 40 minuten. Dompel de objectglas in een glazen Coplin-pot met voorverwarmde wasoplossing drie en incubeer dit in een waterbad bij 45 °C onder schudden gedurende twee minuten. Herhaal het wassen drie keer.

Breng 80 µL SY5.5-kleuringsreagens aan op het monster, dek dit af met een plastic dekglas van 24 bij 60 mm en incubeer het monster in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 40 minuten. Gebruik voorverwarmde wasoplossing drie om het preparaat drie keer te wassen en houd het preparaat vervolgens schuin tegen een papieren handdoek om het overtollige vocht af te laten lopen. Voeg 20 µL antifade DAPI-reagens toe aan het monster en plaats voorzichtig een glazen dekglas erbovenop zonder luchtbellen te introduceren.

Gebruik nagellak om de randen af te dichten en observeer het monster met een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust voor het vastleggen van sky-beelden. Deze figuur toont representatieve metafase-celspreads met normale en aberrante muizenchromosoomparen één, twee en drie. Hier is een stabiele aberratie waarbij chromosoom één betrokken is; een deel van chromosoom één is geïntegreerd in een niet-gekleurd DAPI-chromosoom, terwijl een ander deel een acentrisch fragment heeft gevormd.

In dit voorbeeld is een deel van chromosoom twee geïntegreerd in een niet-geverfd chromosoom. Deze stabiele aberratie betreft chromosoom drie. Stabiele aberraties waarbij alle drie de geverfde chromosomen betrokken zijn, zijn zichtbaar in deze metafase-spreiding.

Hier wordt een voorbeeld getoond van spectrokaryotypering van een normale vrouwelijke muis. Dit paneel representeert een stabiele aberratie waarbij chromosoom vier en 12 betrokken zijn. Ten slotte betreft de stabiele chromosomale aberratie in dit paneel chromosoom zeven en 10.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen 48 tot 72 uur worden uitgevoerd indien dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alleen prolifererende cellen gebruikt mogen worden. Na deze procedure kunnen deze en andere methoden, zoals in-band analyse, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of er interchromosomale stabiele aberraties aanwezig zijn in de bestraalde cellen.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van moleculaire cytogenetica om de associatie tussen genetische aberraties en diverse ziekten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een duidelijker beeld moeten hebben van hoe interchromosomale stabiele aberraties kunnen worden vastgesteld. Vergeet niet dat het werken met colchicine extreem gevaarlijk kan zijn omdat het carcinogeen is; voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van dit experiment.