Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie In Situ Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen
11 januari 2017
Het huidige protocol beschrijft de bruikbaarheid van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectraal karyotypering (SKY) bij het identificeren van inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na blootstelling aan totale lichaamsbestraling.
Het algemene doel van deze moleculaire cytogenetische methode is om interchromosomale stabiele afwijkingen waar te nemen in de beenmergcellen van muizen die zijn blootgesteld aan volledige lichaamsbestraling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vraag in het gebied van stralingsbiologie, zoals het risico van het induceren van stabiele chromosoomafwijkingen in de beenmergcellen van muizen die zijn blootgesteld aan volledige lichaamsstraling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een geleide visualisatie toelaat van door straling geïnduceerde stabiele genetische schade in de beenmergcellen van muizen die door veel celgeneraties kan worden voortgezet.
Na het isoleren van beenmerg uit muizen femur en tibia botten en het maken van een enkele celsuspensie volgens het tekstprotocol, legt u de celsuspensie voorzichtig op een gelijk volume beenmerg mononucleaire celscheidingsmedium. Centrifugeer de gradiënt bij 400 keer G bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verzamel vervolgens voorzichtig de buffycoat zonder de resterende lagen te verstoren en breng de oplossing over in een nieuwe 15 milliliter centrifugeerbuis.
Om metafase celspreidingen voor te bereiden, voegt u 10 milliliter PBS toe aan de buis met de buffycoat. Centrifugeer vervolgens de buis bij 400 keer G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant en tik zachtjes op de buis om de celpellet te breken.
Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe en centrifugeer de suspensie opnieuw. Verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Breek de pellet op en voeg druppelsgewijs vier milliliter voorverwarmde hypotone 0,075 molaire kaliumchlorideoplossing toe met zacht, constant schudden.
Incubeer de celsuspensie bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten in een waterbad. Voeg vervolgens een gelijk volume fixeermiddel toe aan de buis en meng voorzichtig door de buis om te keren. Centrifugeer de buis en verwijder het supernatant.
Breek vervolgens de celpellet op en voeg vers fixeermiddel toe. Herhaal het centrifugeren en het toevoegen van fixeermiddel nog vijf keer. Na het resuspenderen van de cellen in 400 tot 600 microliter fixeermiddel, druppel 30 microliter vaste cellen op voorgereinigde en natte glijbanen die in een hoek van 45 graden zijn gekanteld en laat de glijbanen een nacht volledig aan de lucht drogen.
Om muischromosoombeschildering door mFISH uit te voeren, plaatst u de glijbaan met de metafase celspreidingen gedurende twee minuten in 2X SSC bij kamertemperatuur. Droog vervolgens de glijbaan uit door seriële ethanolwassingen in 70% 80% en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke wassing. Verwarm 40 milliliter denaturatieoplossing voor in een glazen coplinpot tot 70 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Breng vervolgens de glijbaan over in de voorverwarmde oplossing en incubeer het monster gedurende een tot 1 1/2 minuten om de chromosomen te denatureren. Gebruik onmiddellijk ijskoud 70% ethanol om de glijbaan gedurende twee minuten te blussen om het denaturatieproces te stoppen en te voorkomen dat gedenatureerde chromosomen opnieuw aan elkaar hechten. Droog vervolgens de glijbaan uit met behulp van een ethanolreeks, beginnend met 80% ethanol gedurende twee minuten.
Plaats vervolgens de glijbaan gedurende twee minuten in 100% ethanol. Droog vervolgens de glijbaan volledig uit bij kamertemperatuur. Om de sonde te denatureren, centrifugeert u kort de door de fabrikant geleverde sondemengsel, breng vervolgens 10 microliter over in een 500 microliter snap cap centrifugeerbuis en incubeer de buis in een waterbad bij 80 graden Celsius gedurende zeven minuten.
Plaats nu de buis met het gedenatureerde sonde in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens het sondemengsel aan op een glijbaan met gedenatureerde chromosomen. Bedek voorzichtig het gebied met een glazen deksel van 18 millimeter bij 18 millimeter en verwijder eventuele zichtbare luchtbellen door de deksel heel voorzichtig op de glijbaan te drukken.
Gebruik rubbercement om alle vier de zijden van het deksel af te sluiten. En incubeer de glijbaan in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur. Na hybridisatie verwijdert u voorzichtig het rubbercement en het deksel en plaatst u de glijbaan in voorverwarmd 0,4X SSC bij 74 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Breng vervolgens de glijbaan gedurende twee minuten over in wasoplossing drie. Voeg 20 microliter antifade montagemedium met DAPI tegenkleuring toe op de glijbaan en bedek deze met een glazen deksel. Gebruik laboratoriumpapier om voorzichtig op het deksel te drukken om eventuele luchtbellen en overtollig montageoplossing te verwijderen.
Gebruik vervolgens nagellak om de randen van het deksel af te sluiten. Bekijk de glijbanen met een fluorescerende microscoop uitgerust met de juiste filters. Voor spectraal karyotypering van muischromosomen, nadat de sondes zijn gehybridiseerd op de gedenatureerde chromosomen en de monsters zijn gewassen volgens het tekstprotocol, brengt u 80 microliter SY5-kleuringsreagens aan op de glijbaan.
Plaats een 24 bij 60 millimeter plastic deksel op het monster en incubeer het in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 40 minuten. Dompel de glijbaan in een glazen coplinpot met voorverwarmde wasoplossing drie en incubeer het in een waterbad bij 45 graden Celsius met schudden gedurende twee minuten. Herhaal de wassing drie keer.
Breng 80 microliter SY5.5-kleuringsreagens aan op het monster, bedek het met een 24 bij 60 millimeter plastic deksel en incubeer het in het donker in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 40 minuten. Gebruik voorverwarmde wasoplossing drie om de glijbaan drie keer te wassen en houd de glijbaan vervolgens in een gekantelde positie tegen een papieren handdoek om de overtollige vloeistof af te tappen. Voeg 20 microliter antifade DAPI-reagens toe aan het monster
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de toepassing van meervoudige fluorescentie in situ hybridisatie (mFISH) en spectrale karyotypie (SKY) om inter-chromosomale stabiele afwijkingen in de beenmergcellen van muizen na totale lichaamsbestraling te identificeren. Deze methode is belangrijk voor het begrijpen van de genetische effecten van blootstelling aan straling.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschappelijke vakgebied
- Stralingsbiologie
- Cytogenetica
- Moleculairbiologie
Achtergrond
- Stabile chromosomale afwijkingen kunnen worden geïnduceerd door blootstelling aan straling.
- Beenmergcellen zijn essentieel voor het bestuderen van genetische schade.
- Het begrijpen van deze afwijkingen helpt bij het beoordelen van stralingsrisico's.
- mFISH en SKY zijn geavanceerde technieken voor het visualiseren van genetische veranderingen.
Doel van het onderzoek
- Om interchromosomale stabiele afwijkingen in beenmergcellen te observeren.
- Om het risico van stabiele chromosomale schade door totale lichaamsbestraling te evalueren.
- Om een methode te bieden voor geleide visualisatie van genetische schade.
Gebruikte methoden
- Isolatie van beenmerg uit het dijbeen en scheenbeen van muizen.
- Bereiding van een enkele cel suspensie.
- Gebruik van beenmerg mononucleair cel scheidingsmedium.
- Centrifugatie om de buffy coat voor analyse te verzamelen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van stabiele chromosomale afwijkingen in bestraalde cellen.
- Demonstratie van de effectiviteit van mFISH en SKY technieken.
- Inzichten in de voortplanting van genetische schade door celgeneraties heen.
- Bijdrage tot het begrijpen van stralingsgeïnduceerde genetische risico's.
Conclusies
- mFISH en SKY zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van stralingseffecten.
- Stabile afwijkingen kunnen worden gevolgd door meerdere celdelingen heen.
- Dit onderzoek helpt bij het beoordelen van de langetermijneffecten van stralingsblootstelling.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Detection of stable chromosomal aberrations in irradiated bone marrow cells provides critical data for assessing long-term genetic risks in preclinical radiation safety studies. The mFISH and SKY techniques enable visualization of inter-chromosomal translocations that persist across cell generations, supporting mechanistic de-risking in target validation pipelines. This approach enhances predictive confidence by linking radiation exposure to stable genomic alterations relevant to carcinogenesis and therapeutic response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of radiation-induced genomic instability as a biomarker for DNA repair pathway efficacy.
- Operational Value: Provides a reproducible method to detect stable aberrations that may correlate with oncogenic transformation risk.
- Predictive Value: Supports assessment of compound-induced genotoxicity by visualizing chromosomal translocations in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of stable aberration frequency per cell, enabling dose-response modeling.
- Operational Value: Standardized chromosome painting protocols allow inter-laboratory comparability in genotoxicity screening.
- Scalability: Metaphase spread preparation and hybridization steps can be adapted for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks propagation of stable aberrations through multiple cell divisions, informing clonal evolution models.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of genetic damage in bone marrow-derived cell populations.
- Translational Continuity: Aberration patterns observed in mice can inform human-relevant radiation biodosimetry frameworks.
Pipeline & Workflow Integration
The mFISH and SKY methods integrate into preclinical safety assessment workflows following in vivo irradiation studies, bridging phenotypic observation with molecular cytogenetic analysis. These techniques are positioned post-exposure and pre-analytical validation to confirm genomic integrity of bone marrow-derived cells used in downstream functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding radiation-induced chromosomal rearrangements and their persistence in stem/progenitor cell compartments.
- Screening: Delivers assay-ready metaphase spreads with quantifiable aberration counts for compound library profiling.
- Analytics: Generates karyotype-specific imaging data and DAPI counterstained images enabling automated translocation scoring.
- Translational Research: Connects murine cytogenetic endpoints to human-relevant biomarkers of genomic instability in radiation-exposed tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytogenetic platform for evaluating genotoxic potential across radiation modifiers, radioprotectors, and DNA damage response inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing stable inter-chromosomal exchanges undetectable by conventional staining.
- Operational Value: Enables standardization of chromosome preparation, hybridization, and imaging across multiple sites.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing evidence of chromosomal translocations that may indicate leukemogenic risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on low-aberration profiles in irradiated bone marrow models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome spreading, fluorescence microscopy, and spectral imaging analysis.
- Dependent on access to mFISH/SKY probe sets, epifluorescence or spectral microscopy systems, and antifade mounting reagents.
- Necessitates standardization of bone marrow isolation, metaphase arrest, and slide preparation across user groups.
- Adaptation to alternative tissue types (e.g., spleen, lymph nodes) may require optimization of hypotonic treatment and fixation steps.
- Limited to proliferating cells; quiescent or non-dividing populations require alternative methods to assess stable aberrations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Isolation of Bone Marrow Mononuclear Cells by Density Gradient Centrifugation and Preparation of Metaphase Cell Spreads
3:04
Mouse Chromosome Painting by mFISH
6:07
Spectral Karyotyping of Mouse Chromosomes
7:45
Results: Inter-chromosomal Stable Aberration Analysis by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization and Spectral Karyotyping
9:02
Conclusion
