Isolatie van Mouse Endometrial epitheliale en stromale cellen voor

De algemene doelen van deze procedure zijn het isoleren en kweken van primaire muis endometriumstromale en epitheliale cellen voor co-kweek ten behoeve van de studie naar in vitro decidualisatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de reproductieve geneeskunde, zoals wat de paracriene signalering is tussen epitheliale en stromale cellen tijdens belangrijke processen zoals decidualisatie en trofoblastinvasie, en hoe deze signaleringsroute wordt gereguleerd. Deze technieken kunnen worden gebruikt om het proces van decidualisatie te bestuderen in een co-kweeksysteem van epitheliale en stromale cellen.

Met behulp van dit systeem kunt u evalueren of signaleringsmoleculen die worden uitgescheiden door een van de twee cellen dit proces kunnen beïnvloeden. Voer vóór het oogsten van de uterus een vaginaal uitstrijkonderzoek uit om de cyclusfasen van de dieren te controleren, om zo alleen muizen in de oestrusfase te selecteren.

Gekenmerkt door de aanwezigheid van corneale epitheelcellen in het vaginale spoelvocht. Gebruik vervolgens een pincet en een schaar om de buikholte van het eerste dier in oestrus te openen en schuif de darmen opzij om beide uterine hoorns zichtbaar te maken. Pak één hoorn aan het meest distale uiteinde, onder de eileider, en disseceer het uterine weefsel van de eileider met een dissectiepincet en een Dumont nummer vijf pincet om het vet- en bindweefsel te verwijderen.

Verwijder vervolgens de hoorn aan het distale uiteinde, boven het corpus uteri. Plaats de baarmoederhoorns na verwijdering in een Petrischaal van 35 millimeter met drie milliliter HBSS. Wanneer alle baarmoederhoorns zijn verzameld, wordt de schaal onder een stereomicroscoop geplaatst en wordt met een pincet elk resterend vet- en bindweefsel verwijderd.

Open vervolgens de uterine hoorns in de lengterichting met een Dumont nummer vijf pincet, dissectiepincetten en kleine veerschaartjes om de lumina bloot te leggen, en spoel de weefsels in een nieuwe Petrischaal met vers HBSS. Breng nu alle hoorns over naar een buis van 15 milliliter met pancreatine en trypsine. Incubeer de weefsels vervolgens horizontaal gedurende 60 minuten bij 4 °C en 50 rpm op een orbitale schudder.

Na een uur wordt de buis overgeplaatst naar de werkbank voor een horizontale incubatie van 45 minuten zonder schudden, gevolgd door een horizontale incubatie van 15 minuten zonder schudden in een waterbad van 37 °C. Aan het einde van de incubatie in het waterbad wordt het supernatant voorzichtig weggegoten en worden de uteri gedurende vijf minuten overgebracht naar een Petrischaal met koud muis endometriaal epitheelcelmedium om de trypsine-activiteit te inactiveren. Vervolgens worden de weefsels overgebracht naar een buis van 15 ml met drie ml koud HBSS, waarna de weefsels 10 seconden worden gevortexd om de epitheellaag los te maken.

Spoel vervolgens de uteri in een nieuwe Petrischaal met 3 mL verse HBSS en verzamel nog twee suspensies van epitheelsheets in twee nieuwe 15 mL buizen, zoals zojuist gedemonstreerd. Na de derde vortexbehandeling van het weefsel worden de uteri overgebracht naar een conische 15 mL buis met een digestiemengsel voor muis endometriale stromale cellen voor een incubatie van 30 minuten bij 37 °C en 200 rpm. Herstel de epitheelsheets door de drie celsuspensies voorzichtig door een nylon mesh van 100 µm te pipetteren om weefselresten te verwijderen, gevolgd door centrifugatie van de resulterende celsuspensie.

Resuspendeer het pellet in 12 milliliter medium voor endometrische epitheelcellen van muizen onder grondige menging en laat de oplossing vervolgens vijf minuten bezinken om de resterende stromale cellen van het muisendometrium door zwaartekracht te scheiden. Gebruik na de sedimentatie een pipet van vijf milliliter om voorzichtig de bovenste twee milliliter van het supernatant te verwijderen en centrifugeer de verzamelde cellen. Resuspendeer vervolgens het epitheelpellet van de muis in epitheelmedium door voorzichtig te pipetteren.

En zaai de cellen uit op met collageen gecoate dekglasjes met de juiste dichtheid voor de geplande downstream analyse. Ga na de isolatie van de epitheelcellen verder met de stromale cellen en haal de digestiebuis met de muisstromale cellen en de uteri uit de incubator. Na een incubatie van 30 minuten, zoals zojuist gedemonstreerd, schudt u de buis voorzichtig 10 seconden met de hand en brengt u de uteri over naar een Petrischaal met 3 mL HBSS van 4 °C.

Spoel de weefsels goed af, voeg vervolgens drie milliliter stromaal celmedium toe aan de digestiebuis om de trypsinactiviteit te inactiveren, en breng de uteri over naar een conische buis van 15 milliliter die drie milliliter vers muis endometriaal stromaal celmedium bevat. Schud de buis met weefsel voorzichtig gedurende 10 seconden. Breng de uteri vervolgens over naar een schaaltje met koud HBSS, gevolgd door een overplaatsing naar een nieuwe buis van 15 milliliter met stromaal celmedium.

Na een derde spoeling van het weefsel en overdracht, worden de baarmoedertweefsels gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd in een verse digestiemix voor muis endometriumstromale cellen. Aan het einde van de digestie worden de celsuspensies uit buis één tot en met drie en de trypsinebuis door een nylon gaas van 40 micron geleid, waarna het gaas wordt gespoeld met nog eens 5 mL medium voor muis endometriumstromale cellen. Vervolgens worden de cellen door middel van centrifugatie verzameld.

Resuspendeer de pellet in vers medium voor muis endometriumstromale cellen voor het uitplaten op met polylysine gecoate dekglasjes bij de juiste dichtheid voor de geplande downstream-analyse. De zuiverheid van de primaire celculturen kan worden beoordeeld aan de hand van de verschillen in vimentine- en cytokeratine-expressie, aangezien de vimentineniveaus hoog zijn in muis endometriumstromale cellen en laag in muis endometriumepitheelcellen. Daarentegen zijn de cytokeratineniveaus hoog in muis endometriumepitheelcellen en laag in muis endometriumstromale cellen.

De dubbelkleuring voor mentine/cytokeratine illustreert verder de expressie van mentine door stromale cellen, evenals de exclusieve expressie van cytokeratine door de epitheelcellen. De inductie van decidualisatie in de stromale celculturen door de toediening van cyclisch adenosinemonofosfaat en MPA, onthult dat de prolactine mRNA-niveaus na vijf dagen behandeling drastisch zijn verhoogd in vergelijking met controle-stromale celculturen. Aangezien de epitheelcellen moeilijk te visualiseren zijn in cellculture-inserts, kon direct na een vijfdaagse simulatie van de decidualisatie een viabiliteitsassay worden uitgevoerd, waarbij een kleurverschuiving van blauw naar helderroze duidde op de aanwezigheid van levensvatbare epitheelcellen.

Na deze techniek kunnen andere methoden, zoals blastocyst-adhesie-assays, worden uitgevoerd om te evalueren of factoren die door de epitheelcellen worden uitgescheiden in de aanwezigheid van een blastocyst, decidualisatie van stromale cellen kunnen induceren.