Name: 3D weefselgeengineerde systemen voor regeneratieve benaderingen, geneesmiddelontdekking en toxiciteitsscreening - ADVERTENTIE (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Verken 3D-weefselgeengineerde systemen voor regeneratieve benaderingen en geneesmiddelontdekking. Deze methoden bieden fysiologisch relevantere in vitro-modellen dan traditionele 2D-celkweeksystemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

3D Cultuursystemen
A. 3D Culturen met behulp van hydrogels en scaffolds
Hydrogels bestaan uit netwerken van gecrosslinkte polymeerketens of complexe eiwit- of polysaccharide-achtige moleculen van natuurlijke of synthetische oorsprong. Vanwege hun aanzienlijke watergehalte en reeks instelbare mechanische eigenschappen bezitten hydrogels biofysische kenmerken die vergelijkbaar zijn met natuurlijk weefsel, en dienen als zeer effectieve matrices voor 3D-celcultuur. Hydrogels kunnen worden gebruikt als zelfstandige 3D-matrices, als coating of als een methode om cellen te capsuleren die worden gecombineerd met andere technologieën, zoals vaste scaffolds, doorlaatbare ondersteuningen, cellulaire microarrays, 3D-printen of microfluïdische apparaten. De morfologie, groei en functionaliteit van cellen binnen het hydrogel hangen af van de presentatie van biofysische en biochemische signalen, evenals fysische eigenschappen zoals permeabiliteit en matrixstijfheid.
Natuurlijke Hydrogels en Extracellulaire Matrices (ECM's)
Natuurlijk afgeleide hydrogels voor celcultuur worden meestal gevormd door eiwitten, polysacchariden en ECM-componenten zoals collageen, laminine, fibrine, hyaluronzuur, chitosan of Matrigelä (een gereconstitueerd basaalmembraanextract van Engelbreth–Holm–Swarm muistumoren die een mengsel bevat van laminine, collageen IV, heparinesulfaatproteoglycaan en nidogen/entactin19, Figuur 1). Gels afgeleid van natuurlijke bronnen zijn inherent biocompatibel en bioactief20. Ze bevorderen ook veel cellulaire functies vanwege de aanwezigheid van verschillende endogene factoren, wat voordelig kan zijn voor het ondersteunen van levensvatbaarheid, proliferatie, functie en ontwikkeling van veel celtypen21.
Echter, natuurlijke hydrogels hebben ook enkele nadelen, waaronder hun isolatie uit dierlijke bronnen, en inherente batch-tot-batch variabiliteit in samenstelling. Ook bevatten ze endogene bioactieve componenten zoals groeifactoren die voordelig kunnen zijn voor het creëren van sommige 3D-modellen, maar in andere gevallen kunnen ze het specifieke celgedrag of de respons die onder onderzoek staat, verwarren. Matrigel activeert bijvoorbeeld paden die angiogenese22,23, kankercelmobiliteit24 en drugsgevoeligheid25 controleren, terwijl collageen type 1 de productie van matrix metalloproteïnasen (MMP's), enzymen die ECM-componenten degraderen en tumorcelinvasie26, celgevoeligheid voor anti-kankergeneesmiddelen27, celproliferatie en migratie28,29 verandert.
Om enkele van de problemen die gepaard gaan met dierlijke biomaterialen te omzeilen, zijn matrices ontwikkeld in organismen die diervrij zijn of zijn afgeleid van recombinante nucleïnezuurtechnologie. Hyaluronzuur (hyaluronan of HA) is een steeds populairder wordende polysacharide-gebaseerde biologisch afgeleide matrix30-32. Meeste commerciële kwaliteit HA is van bacteriële oorsprong, en gekenmerkt door hoge zuiverheid en homogene kwaliteit. Deze gels kunnen worden gemodificeerd door de toevoeging van ECM-componenten voor het verbeteren van celbinding en groeigedrag. 
Synthetische Hydrogels en Extracellulaire Matrices
Synthetische hydrogels zijn een optie voor 3D-celcultuurtoepassingen wanneer natuurlijk afgeleide biologische matrices ongeschikt zijn. Synthetische hydrogels bestaan uit puur niet-natuurlijke moleculen33 zoals poly(ethyleenglycol) (PEG)34, poly(vinylalcohol)35 en poly(2-hydroxyethylmethacrylaat)36. Ze zijn biologisch inert, maar bieden structurele ondersteuning voor verschillende celtypen. Ze zijn ook zeer reproduceerbaar, staan een gemakkelijke aanpassing van de mechanische eigenschappen toe, en zijn eenvoudig te verwerken en te vervaardigen.
Synthetische hydrogels kunnen de levensvatbaarheid van gecapsuleerde cellen behouden terwijl ze ECM-afzetting toestaan terwijl het hydrogel afbreekt37, waardoor wordt aangetoond dat synthetische gels kunnen functioneren als 3D-celcultuurplatformen in afwezigheid van integrine-bindende liganden. Als alternatieve benadering kunnen inert synthetische hydrogels worden gemodificeerd met geschikte biologische componenten. Een voorbeeld van een synthetische hydrogel die instelbaar is, is Corning PuraMatrix™ Peptide Hydrogel, een zelf-assemblerend, synthetisch oligopeptide dat nanometer-schaalvezels vertoont (Figuur 2). Synthetische hydrogels kunnen worden aangepast met specifieke peptidesequenties om celbinding, celhomeing en andere gedragingen38 te verbeteren of de hydrogels kunnen worden aangevuld met bioactieve moleculen (bijv. groeifactoren of ECM-eiwitten). Bovendien kunnen apparaten zoals doorlaatbare ondersteuningen (bijv. Transwell® inzetstukken) worden ingebouwd in 3D-cultuurmodellen met hydrogelsubstraten om de interactie tussen verschillende celtypen, oplosbare factoren en het kweekmilieu te bestuderen.
Vaste Scaffolds
Vaste scaffolds voor 3D-celcultuur worden gemaakt van een breed scala aan materialen, waaronder metaal, keramiek, glas en polymeren. Met name polymeren zijn een veelgebruikte keuze voor het genereren van vaste scaffolds van verschillende grootte, variërende structuur, stijfheid, porositeit en permeabiliteit39. Een veelheid van fabricagetechnieken worden gebruikt om vaste scaffolds voor 3D-celcultuur te genereren, waaronder soft-lithography, elektro-spinnen, microarray, bio-printing en vele anderen. De belangrijkste nadelen van het gebruik van vaste scaffolds zijn beperkte mogelijkheden voor celbeeldvorming en moeilijkheden die worden ondervonden bij het herstellen van cellen uit de matrix.
Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van scaffolds voor 3D-celcultuur is de schaal en topografie van de interne structuren binnen de scaffold. In het lichaam biedt de ECM een

Geen belangenconflicten verklaard.

De constructie van fysiologisch relevante 3D-weefsels is een veelzijdig onderzoeksinitiatief waarbij de resulterende weefsels voor vele toepassingen kunnen worden gebruikt. Aangezien 3D-celcultuursystemen een nauwkeurigere omgeving bieden voor celgroei, weefselmorfogenese en stamceldifferentiatie, hebben ze het potentieel om te worden gebruikt voor het modelleren van weefselontwikkeling, ziekteprogressie en voor implantatie in situ voor grote weefseldefecten. 3D-celcultuurmodellen zijn ook geschikt om de kloof te overbruggen tussen conventionele 2D-preklinische modellen voor geneesmiddel- en toxiciteitsscreening en in vivo klinische studies bij mensen. Verbeterde 3D-preklinische modellen zullen pathobiologische processen die ten grondslag liggen aan ziekten van specifieke weefsels en organen bij mensen beter weergeven en ook nauwkeuriger fysiologische reacties op therapeutische stoffen kunnen voorspellen.
Er zijn de afgelopen decennia al grote vorderingen gemaakt op dit gebied, maar er zijn nog veel praktische beperkingen voordat 3D-celcultuurmodellen op grote schaal in veel toepassingen kunnen worden geïmplementeerd. Om te beginnen zijn veel van de 3D-modellen nieuw, en gegevens die met deze methoden worden gegenereerd, moeten worden gevalideerd tegen gevestigde in vivo-reacties voor calibratie. Bovendien kan het resultaat van 3D-assays sterk variëren vanwege een gebrek aan gestandaardiseerde protocollen en het gebruik van heterogene en soms meerdere celpopulaties. Niet-destructieve gegevensanalysetechnieken (afgescheiden factoren, morfologische veranderingen en/of niet-invasieve functionele markers) zijn daarom essentieel voor het volgen van hetzelfde 3D-construct tijdens de cultuur. Ook hebben sommige 3D-matrices een beperkte permeabiliteit of slechte diffusiedynamiek en moeten daarom perfusiesystemen bevatten om de levensvatbaarheid en functie te handhaven. Verder kunnen celherstel en visualisatie in bepaalde 3D-schalmen beperkt zijn. Een andere belangrijke beperking is dat veel van de 3D-cultuurmodellen niet gemakkelijk kunnen worden geautomatiseerd of opgeschaald voor hoogdoorlaatscreening.
Deze beperkingen worden echter overwonnen met opkomende technologieën en nieuwere 3D in vitro-assays. In vitro 3D-celcultuurmodellen zijn vooruitgegaan in het ondersteunen van celgroei, weefselmorfogenese, stamceldifferentiatie, ziektemodellering, geneesmiddelontdekking en toxiciteitstesten. Het is ook duidelijk dat verschillende 3D-modellen met verschillende kenmerken vereist zijn om aan de behoeften van specifieke celtypen of toepassingen te voldoen. Het combineren van nieuwere technologieën zoals microarrays op een chip, microfluidiek of bio-printing met biologisch relevante matrices zou kunnen helpen om enkele van deze complexe 3D-celcultuurmodellen op te schalen en te drijven tot zeer voorspellende en relevante geneesmiddelscreeningsassays en toxiciteitstests, evenals nieuwe systemen voor regeneratief onderzoek te bieden.

In vitro zoogdiercelcultuur is al enkele decennia een onschatbaarbaarbare tool in de celbiologie. Klassiek werden monolaagculturen van aderente cellen gekweekt op platte en stijve tweedimensionale (2D) substraten, zoals polystyreen of glas. Echter, wanneer veel cellen, wanneer geïsoleerd uit weefsels en geplaatst op stijve vlakke 2D celcultuuroppervlakken, zoals weefselkweekplastic, progressief platter worden, abnormaliter delen en hun gedifferentieerd fenotype verliezen1,2. Hoewel deze tweedimensionale celcultuurstudies een cruciale rol hebben gespeeld in het bevorderen van ons begrip van vele biologische processen, emuleren ze niet de in vivo omstandigheden.
In het lichaam bevinden cellen zich in een complexe extracellulaire matrix (ECM) die bestaat uit een driedimensionale (3D) architectuur die directe interacties mogelijk maakt met naburige cellen en matrixmoleculen via biochemische en mechanische signalen. Cel-cel en cel-ECM interacties vestigen een 3D communicatienetwerk vast dat de specificiteit en homeostase van het weefsel onderhoudt3. Daarom is het niet verrassend dat fundamentele verschillen in de micro-omgeving van 2D en 3D celcultuursystemen verschillende cellulaire gedragingen beïnvloeden, inclusief de manier waarop cellen zich hechten, verspreiden en groeien, hun morfologie en polariteit, gen- en eiwitexpressie, levensvatbaarheid, proliferatie, mobiliteit, differentiatie, respons op stimuli, cellulaire metabolisme, en algemene functie1,2,4-16.
De 3D ECM die een cel omringt vervult verschillende cruciale functies. Om te beginnen, biedt het een complexe, nanoschaal architectuur van structurele eiwitten zoals collageen, laminine, fibronectine en glycosaminoglycanen om de mechanische eigenschappen in de cellulaire micro-omgeving te vestigen17,18. Cellen detecteren deze mechanica door hun celoppervlakte integrinen en binden aan specifieke adhesie motieven die aanwezig zijn op de ECM eiwitten en glycosaminoglycanen. Verder is de ECM vitaal voor het opslaan van oplosbare biomoleculen en groeifactoren, en het vrijgeven van deze signaalmoleculen met ruimtelijk-temporele controle om processen te leiden zoals celmigratie, matrixdegradatie en depositie17,18. Daarom, om de native ECM echt na te bootsen, is het noodzakelijk om 3D cultuurmodellen te ontwikkelen die de mechanische en chemische eigenschappen van de ECM vertonen, niet alleen in het beginstadium van het zaaien van de cellen, maar eerder, op een dynamische en aanpasbare manier terwijl de cellen groeien en zich ontwikkelen. Om te voldoen aan de vereisten van verschillende celtypen en toepassingen in het lichaam, is een uitgebreid scala aan materialen en fabricagetechnieken gebruikt om 3D micro-omgevingen met verschillende fysische, biologische en mechanische kenmerken te ontwikkelen. Elk model komt met zijn eigen set voordelen en beperkingen, en één uniek model is niet geschikt voor alle toepassingen.

3d weefselgeengineerde systemen voor regeneratieve benaderingen, geneesmiddelontdekking en toxiciteitsscreening - advertentie

3D Tissue Engineered Systems for Regenerative Approaches, Drug Discovery, and Toxicity Screening - ADVERTISEMENT

In vitro kweek van zoogdiercellen is al tientallen jaren een onschatbare tool in de celbiologie. Klassiek gezien werden monolaagculturen van aderente cellen gekweekt op platte en stijve tweedimensionale (2D) substraten, zoals polystyreen of glas. Echter, veel cellen worden, wanneer ze geïsoleerd zijn uit weefsels en op stijve vlakke 2D celkweekoppervlakken worden geplaatst, zoals weefselkweekplastic, progressief platter, delen zich abnormaliter en verliezen hun gedifferentieerde fenotype1,2. Hoewel deze tweedimensionale celkweekstudies een cruciale rol hebben gespeeld in het bevorderen van ons begrip van vele biologische processen, emuleren ze niet de in vivo omstandigheden.

<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. In vitro ontwikkelde endometriale klieren vertonen epitheliale apicobasale polariteit. Dubbele immunokleuring van in vitro ontwikkelde klieren gekweekt gedurende 8 dagen in BIE-medium (A–E) of cryostaatsecties verkregen uit muis endometrium (F–I). A en F: Cytokeratine (groen) en vimentine (rood). B en G: Lamine (groen) en ftaloidine (rood). C en I: GM130 (groen) en ftaloidine (rood). D en H: ZO-1 (groen) en E-cadherine (rood). E: ZO-1 (groen) en b-catenine (rood). Witte schaalbalk = 20 mm. BIE-medium = basaal medium gesupplementeerd met 5ng/mL EGF en 1:100 verdunning van ITS-supplement en 3% vers Matrigel™ Matrix; EGF = epidermale groeifactor; ITS = insuline transferrine selenium (Eritja et al., 2010)89.
Figuur 1 beschrijving - Organisatie, signalering en secretie van glandulaire epitheliale cellen lijken meer op de eigenschappen die in vivo worden waargenomen wanneer gekweekt in een 3D-omgeving, in tegenstelling tot het gedrag dat optreedt op 2D-oppervlakken 10,11. Een 3D in vitro model voor endometriale klieren wordt getoond in Figuur 1. In dit model werden endometriale epitheliale cellen gedurende 7-8 dagen gekweekt in medium met Matrigel™ Matrix, gevolgd door immunofluorescentiekleuring van verschillende polariteitsmarkers. Markerexpressieanalyse bevestigde dat de glandulaire structuren uitsluitend bestonden uit cellen van epitheliale oorsprong (1A en 1F). Verder vertoonden sferoïden die endometriale klieren vertegenwoordigen correcte apicale-basolaterale polariteit (1B en 1G), positionering van Golgi-apparaat (1C en 1I), adhesie-verbindingen (ID en IH) en tight junctions (IE). 
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Proliferatie en differentiatie in 3D-scaffold. (A + B) Transmissielichtafbeelding van proliferende cellen in PuraMatrix met 0,25% laminine (PML) en differentiërende cellen in PML 0,25% (C + D). Scannen elektronenmicroscoopbeeld van proliferende cellen en gedifferentieerde cellen in PML 0,25%. (B + D) Bij inductie van differentiatie observeert men de ontwikkeling van een dicht 3-dimensionaal netwerk van processen. (E) Immunocytochemie voor bIII-tubuline en TH van niet-geïnduceerde cellen in PML 0,25% en (F) Cellen na 7 dagen differentiatie toonden een dicht netwerk van bIII-tubuline positieve cellen. TH+ cellen bleken processen te bezitten, maar zonder een dicht netwerk op te bouwen (Ortinau et al. 2010)90.
Figuur 2 beschrijving – In deze studie gebruikten Ortinau en collega's een synthetische hydrogel, PuraMatrix™ gesupplementeerd met laminine (PML 0,25%) voor neuronale differentiatie van menselijke neurale voorlopercellen90. Met behulp van transmissielichtmicroscopie (FIGUUR 2A + B) en scanning elektronenmicroscopie (FIGUUR 2C + D) toonden de onderzoekers aan dat neurale voorlopercellen zich kunnen ontwikkelen tot een dicht netwerk van neuronale processen (FIGUUR 2B + D). Verder onthulde immunocytochemie dat na 7 dagen differentiatie de neuronale voorlopercellen begonnen neuronale markers (bIII-tubuline en tyrosine hydroxylase (TH)) te vertonen (FIGUUR 2E + F). Deze waarnemingen demonstreren hoe functionarisering met geschikte biologische factoren inerte synthetische matrices kan omzetten in nuttige in vitro modellen voor het ondersteunen van differentiatie van stam- en voorlopercellen.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figuur 3"> 
Fig. 3. Organoïden herhalen voorloperuitbreiding en georganiseerde differentiatie.
(A-E) Immunohistochemie op secties van 7-daagse organoïdën waaruit blijkt dat (A) alle cellen (DRAQ5, rode kernen) epitheliaal zijn (E-cadherine) en dat veel prolifereren [fosfo-histone H3 (pHH3)] en (B, C) pancreasmarkers PDX1, SOX9 en HNF1B behouden. (C) Cellen polariseren en vormen buizen bekleed met mucine 1. (D) Exocriene differentiatie (amylase) wordt gezien aan de periferie. (E) Endocriene differentiatie (insuline) wordt gedetecteerd in het centrum. De sectie in B is dicht bij die in A, en de sectie in D is dicht bij die in C. (F) Experimenteel schema om endocrijn differentiatie te testen na terugtransplantatie van cellen gekweekt in organoïd in een pancreatische niche. WT, wild type. (G-J) De cellen die eerst in vitro werden gekweekt, integreren in het gastheerepitheel (wit in G en groen in H- J). Sommige blijven voorlopers (G; HNF1B), sommige worden acinar (H; amylase) of ductaal (I; DBA) en anderen worden endocriene (glucagon of insuline). Inlays zijn vergroting van de gestippelde vakken. Schaalbalk: 50 μm (Greggio et al., 2013)53.
Figuur 3

In vitro kweeksels van zoogdiercellen zijn al tientallen jaren een onschatbare hulpmiddel in de celbiologie. Klassiek werden monolaag-culturen van aanhechtende cellen gekweekt op platte en stijve tweedimensionale (2D) substraten, zoals polystyreen of glas. Echter, veel cellen worden, wanneer ze geïsoleerd zijn uit weefsels en op stijve vlakke 2D celkweekoppervlakken worden geplaatst, zoals weefselkweekplastic, progressief platter, delen zich abnormaal en verliezen hun gedifferentieerde fenotype1,2. Hoewel deze tweedimensionale celkweekstudies een cruciale rol hebben gespeeld bij het bevorderen van ons begrip van vele biologische processen, emuleren ze niet de in vivo omstandigheden.

3D weefselgeengineerde systemen voor regeneratieve benaderingen, geneesmiddelontdekking en toxiciteitsscreening - ADVERTENTIE

In vitro mammalian cell culture has served as an invaluable tool in cell biology for several decades. Classically, monolayer cultures of adherent cells ...

3d-tissue-engineered-systems-for-regenerative-approaches-drug

Without Section

Verken 3D-weefselgeengineerde systemen voor regeneratieve benaderingen en geneesmiddelontdekking. Deze methoden bieden fysiologisch relevantere in vitro-modellen dan traditionele 2D-celkweeksystemen.

3D weefselgeengineerde systemen voor regeneratieve benaderingen, geneesmiddelontdekking en toxiciteitsscreening - ADVERTENTIE

Meer video's verkennen