Name: Opklaren en Trombus inductie in de oorlel van een Hairless Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer fototoxische trombusinductie in de oorlel van een haarloze muis voor intravitale fluorescentiemicroscopie. Deze methode onderzoekt de invloed van vasoactieve geneesmiddelen op microvasculaire trombusvorming in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen bevestigingen.

Alle in vivo-experimenten (7221.3-1-006 / 15) werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake de bescherming van dieren en de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council). 1. Algemene houden van de dieren <ol><li> Voer de experimenten met mannelijke SKH1-Hr uur muizen van 4 tot 6 weken. Dieren worden gebruikt met een gewicht tussen 20 en 25 g. </li><li> Bewaar de dieren in een pathogeenvrije faciliteit en onder gestandaardiseerde omstandigheden van 24 tot 26 ° C en 60% relatieve vochtigheid, met constante toegang tot water en voedsel ad libitum. </li><li> Blijf op de vijf mannelijke dieren in een kooi. Zorg voor beddengoed en verrijking materiaal tijdens de behuizing van de dieren voor hun welzijn. </li></ol> 2. prearrangement of the Animals <ol><li> Weeg een muis en laadt de respectievelijke geneesmiddel (bijvoorbeeld de cannabinoïde, 5 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) in een insulinespuit. Toedienen van het geneesmiddel 30 minuten voorafgaand aan inductie trombus. </li><li> Door het vasthouden van de nek van de muis tussen duim en wijsvinger en de staart van de muis met de pink, strekken het dier en injecteer het geneesmiddel intraperitoneaal (ip) in de linker kwadrant van de buik. Zet het dier weer in de kooi gedurende 15 min. </li><li> Bereiden anesthesie met ketamine (90 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (25 mg / kg lichaamsgewicht). 15 minuten vóór inductie trombus, verdoven de muis. Zet de muis in de kooi, trek de staart licht, en injecteer de verdoving ip een insulinespuit. </li><li> Zet de muis terug in de kooi tot het begin van de anesthesie. Om voldoende verdoving controleren, knijp de staart met een tang. </li><li> Load 0,05 ml ontdooid fluoresceïne-isothiocyanaat gemerkt dextran (FITC-dextran, 5%, 150 kDa) in een insulinespuit. Het vullen van de injectiespuit zorgen dat er geen luchtbellen achterblijven, omdat zelfs kleine intravenously (iv) -administered luchtbellen dodelijk voor het dier. </li><li> Plaats de verdoofde muis op een verwarmingsplaat in de beneden positie. Pas de verwarmingsplaat op 37 ° C. </li><li> Zet oogzalf op het hoornvlies van de muis. Ontsmet de huid en het gebruik van steriele instrumenten. </li><li> Steek twee hechtingen van polypropeen 7/0 in de craniale en caudale rand van het rechter oor. Leg de steken zo dicht mogelijk bij de rand en dat proximaal aan de basis mogelijk (Figuur 1B). </li><li> Schuif de muis om dorsale positie. Fix alle poten naar acrylglass platform met behulp van plakband. Haak een hechting onder de voortanden en plaats de kop in dorsiflexie door steken de hechtdraad de acrylglass plakstrips. </li><li> Transloceren het dier op het platform in het kader van de operatie stereomicroscoop. Gebruik 16X vergroting. </li></ol> 3. Bereiding van de linker halsader en injectie van FITC-Dextran Opmerking: voor microscopy van het rechter oor, de voorbereiding van de linker halsader. <ol><li> Met behulp van een scalpel, voer een 5-mm incisie in de huid aan de linkerzijde van de nek in een cranio-caudaal. Ontleden het subcutane weefsel met een microforceps en microscissors. Ofwel ligaat kruising schepen met polyester 8/0 hechtingen of met electrocoagulatie. </li><li> Bevrijd de ader van de adventitia met behulp microforceps en microscissors zonder het aanraken van het schip. </li><li> Met de bereide insuline spuit voor het injecteren van de fluorescerende kleurstof. pak voorzichtig de vaatwand met de microforceps, zonder perforeren de ader. Doordringen in de uitgezette vaatwand met de injectiespuit en injecteer FITC-dextran iv. </li><li> Het bloeden te stoppen nadat de injectiespuit via wattenstaafjes onttrekken. Vermijd bloed en vervuiling van het oor verven. </li></ol> 4. Plaatsing van het rechter oor voor intravitale fluorescentiemicroscopie <ol><li> Breng het dier op de verwarmingsplaat een acrylglass construction met een sleuf voor de verwarmingsplaat en een 0,5 cm hoog vlak voor het positioneren van het oor. </li><li> Bevestig het dier naar beneden op de verwarmingsplaat behulp plakstrips. Plaats de relatief sterke en convexe kraakbeen bij de basis van het oor naast het 0,5 cm hoog vlak voor het oor (figuur 1B) zodat het apicale deel van het oor plat worden geplaatst op het vliegtuig. </li><li> Één druppel kamertemperatuur 0,9% NaCl om het acrylglass vlak om het oor te plaatsen. Leg het rechter oor, de afgesproken hechtingen aan zijn concave ventrale zijde naar beneden op de daling van 0,9% NaCl. Gebruik wattenstaafjes, absorberen de druppel NaCl en laat capillaire krachten bevestig het oor vliegtuig naar het acrylglass. </li><li> Tape de hechtingen aan de acrylglass de positie van het oor vast. </li><li> Één druppel 0,9% NaCl kamertemperatuur aan de convexe dorsale zijde van het oor. Zorgvuldig zet een dekglaasje (0,5 cm diameter) op het oor zonder samendrukken van de basale schepen die the oor. Gebruik wattenstaafjes, verwijder zoveel mogelijk NaCl onder het dekglaasje om de afstand tussen het dekglaasje en het oor doelvaten minimaliseren. </li></ol> 5. intravitale fluorescentiemicroscopie en Trombus Inductie van het rechteroor <ol><li> Stel de intravitale fluorescentiemicroscoop voor FITC-dextran visualisatie (450-490 nm; FT: 510; LP: 520). Met een variabele-100 W kwiklamp als lichtbron. Sluit een hoge resolutie, zwart-wit CCD-camera op een DVD recorder. </li><li> Breng het dier op de acrylglass met de verwarmingsplaat met de vaste ontvoerde oor naar het bureau van de intravitale fluorescentiemicroscoop. </li><li> Gebruik 20X vergroting (20X / 0.95 numerieke apertuur) en 20% lichtintensiteit zoeken naar een veneus vat 50 - 60 urn in diameter en met een voorwaartse bloedstroom van 400-600 um / s. </li><li> Voeg een druppel water op kamertemperatuur om het dekglaasje voor onderdompeling in water van de 63x magnification doelstelling (63X / 0.95 numerieke apertuur). Met een spuit met een 1-mm canule en plaats de druppel op het objectief van de microscoop. Voeg net genoeg water om contact op met de dekglaasje en de doelstelling om met het water te laten vallen. </li><li> Onmiddellijk na het aanbrengen van de waterdruppel, de gegevens van de vat gedurende 20 seconden met 20% lichtintensiteit voor offline meten van de diameter en de bloedstroom. </li><li> Beginnen trombus inductie 5 minuten na de injectie van FITC-dextran. Voor dit doel verhogen de lichtintensiteit tot 100%. </li><li> Bij thrombusvorming inductie, sluit de opening van de microscoop 2 sec binnen 30 s om de bloedstroom te controleren. Bij persisterende bloedstroom, opent de opening weer. Bij gestopt bloedstroom, acht het vat gedurende 30 s. LET OP: Het schip is geclassificeerd als afgesloten wanneer de stroom stil staat gedurende 30 seconden of meer, of indien het bloed stroomt retrograad. Indien de orthograde bloedstroming opnieuw gestart, het diafragma en Contin volledig openen<html> ue de trombus inductie tot vatafsluiting zoals boven bedoeld. Tijdens de vroege trombus inductie waarborgen dat de tijd dat de opening werd gesloten om de bloedstroom te controleren zo kort mogelijk teneinde nagenoeg continue epi-belichting handhaven. Later, tijdens trombus groei, het vat geperfuseerd met minder fluorescerende kleurstof, zodat het kan continu worden waargenomen. </li><li> Selecteer en af ​​te sluiten 5 vaten per oor. Tijdslimiet van trombus inductie onder de microscoop op ongeveer 1 uur na de injectie van FITC-dextran. </li></ol> 6. Follow-up Activiteiten <ol><li> Voer een wond sluiting van de nek met behulp van transcutane polypropyleen 6/0 hechtingen. </li><li> Tijdens het herstel van de anesthesie, zet de muis terug in de kooi en verwarm het dier met infrarood licht. </li><li> Breng de geregistreerde gegevens van de DVD-recorder op software waarmee de meting van de diameter van de vaten en de snelheid van de bloedstroom. </li></ol>_title &quot;&gt; 7. Onderzoek van het linkeroor <ol><li> Liet het dier herstellen en elimineren alle geïnjecteerde FITC-dextran gedurende 48 uur. </li><li> Voer de hierboven beschreven stappen, dit keer de voorbereiding van de rechter halsader en het linker oor. </li></ol> 8. Weefsel Asservation <ol><li> Na intravitale fluorescentiemicroscopie van het linkeroor, monster 0,5 ml bloed uit de ader retrobulbaire plexus van het oog met een glazen capillair. dringen voorzichtig de binnenste palpebrale hoek schroeven bewegingen tot veneus bloed door het capillair stroomt. Verzamel de sonde per ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bloed buis. </li><li> Na bloedafname, offeren het dier door het injecteren van 500 mg / kg lichaamsgewicht ketamine in de staartader. </li><li> Tel de bloedcellen met behulp van een hematologie-analysator voor een kwantitatieve beoordeling van leukocyten, erytrocyten, trombocyten, hemoglobine en hematocriet. </li><li> Centrifugeer de resterende EDTA bloed bij 2500 x g en kamertemperatuur gedurende 10 min. Pipetteer en vries het bloedplasma voor verder onderzoek. </li><li> Met een schaar, knip de oorschelpen en ze op te lossen in 4% formaldehyde voor histologisch onderzoek. </li></ol>

<ol><li>White, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12814979">The epidemiology of venous thromboembolism.</a> Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).</li>
<li>Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2646590/">The hairless mouse in skin research.</a> J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).</li>
<li>Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+endogenous%2C+phyto+and+synthetic+cannabinoids+on+thrombogenesis+and+platelet+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity.</a> Biofactors. , (2016).</li>
<li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).</li>
<li>Barker, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hairless+mouse+ear+for+in+vivo+studies+of+skin+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation.</a> Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).</li>
<li>Goertz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+polihexanide-preserved+wound+covering+gel+on+dermal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing.</a> Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).</li>
<li>Goertz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microcirculatory+changes+and+angiogenesis+in+a+model+of+frostbite+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo.</a> J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).</li>
<li>Roesken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+quantitative+in+vivo+microscopic+analysis+of+thrombus+formation+and+vascular+recanalisation%3A+the+ear+of+the+hairless+%28hr%2Fhr%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse.</a> Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).</li>
<li>Sorg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithrombin+is+as+effective+as+heparin+and+hirudin+to+prevent+formation+of+microvascular+thrombosis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemos%22%5BJournal%5D)">Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model.</a> Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).</li>
<li>Sorg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antithrombin+in+the+prevention+of+microvascular+thrombosis+during+endotoxemia%3A+an+intravital+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study.</a> Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).</li>
<li>Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings%3A+Improved+technique+to+produce+endothelial+injury+by+laser+beam+without+direct+damage+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Diath+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells.</a> Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331(1975).</li>
<li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+skinfold+chamber%3A+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mat%22%5BJournal%5D)">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).</li>
<li>Grambow, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrogen+sulfide+donor+GYY4137+on+platelet+activation+and+microvascular+thrombus+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice.</a> Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).</li>
<li>Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+accumulation+by+spontaneous+rolling+and+adhesion+in+the+exteriorized+rabbit+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microcirc+Clin+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery.</a> Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).</li>
<li>Harder, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-specific+ischemic+tissue+tolerance+in+critically+perfused+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks.+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin.</a> Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).</li>
<li>Langer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyvinylpyrrolidone-iodine+liposomal+hydrogel+on+wound+microcirculation+in+SKH1-hr+hairless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice.</a> Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).</li>
<li>Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall+injury+and+arterial+thrombosis+induced+by+a+photochemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction.</a> Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).</li>
<li>Herrmann, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+induced+in+the+hamster+cheek+pouch+by+a+photochemical+process+with+excited+fluorescein+isothiocyanate-dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran.</a> Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+thrombosis+models+in+venules+and+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo.</a> Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).</li>
<li>Lee, W. M., Lee, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+coronary+atherosclerosis+in+swine+produced+by+combination+of+balloon-catheter+injury+and+cholesterol+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding.</a> Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).</li>
<li>Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+and+thrombus+thresholds+to+unipolar+stimulation+of+small+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angiology%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels.</a> Angiology. 11, 35-39 (1960).</li>
<li>Rosen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+noninvasive+vascular+injury+models+in+mice+generate+platelet-+and+coagulation-dependent+thrombi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi.</a> Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).</li>
<li>Agero, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mutalysin+II+on+vascular+recanalization+after+thrombosis+induction+in+the+ear+of+the+hairless+mice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model.</a> Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).</li>
<li>Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14518203">Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels.</a> Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).</li>
<li>Bilheiro, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombolytic+action+of+a+proteolytic+fraction+%28P1G10%29+from+Carica+candamarcensis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis.</a> Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).</li>
<li>Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-thrombotic+effect+of+hydrogen+sulfide+is+partly+mediated+by+an+upregulation+of+nitric+oxide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases.</a> Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn een aantal cruciale stappen voor de succesvolle trombus inductie in de oorlel van SKH1-Hr hr muizen. Voor het oplossen van problemen, worden de respectievelijke stappen van het protocol aangegeven tussen haakjes. Onderzoek omstandigheden zijn ideaal bij jonge dieren op de leeftijd van 4-6 weken en met een lage verhoorning van de opperhuid. Bij oudere dieren, de kwaliteit van visualisatie van de vaten slechter en meer vergelijkbaar vanwege de hogere afstand tussen het huido...

Het doel van dit artikel is de techniek van intravitale microscopie toegepast op de oorschelp van de haarloze muis voor de directe observatie en analyse van microcirculatie, trombusvorming en trombus evolutie beschrijven. Met een incidentie van 1 op 1000, veneuze trombose nog steeds een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit. Hoewel diagnostiek, preventiestrategieën en therapieën zijn in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een derde van de veneuze trombose manifesteert zich als een longembolie 1. Arteriële trombose speelt een cruciale rol in hart- en vaatziekten, die de meest voorkomende doodsoorzaak in geïndustrialiseerde landen zijn. Arteriële trombose op basis van de breuk van atherosclerotische plaques is betrokken bij hartaanvallen, mesenteriale infarcten, en beroerte. Elke operatie bloot subendotheliale structuren bloedcomponenten, verandert de dynamiek van de bloedstroom, en immobiliseert de patiënt. In endoprosthetische operatie aan de onderste ledematen, orgel transplantation en flap chirurgie trombose zijn frequente oorzaken van complicaties. Microvasculaire trombose in het bijzonder veroorzaakt vaak onherstelbare schade, als gevolg van het gebrek aan klinische symptomen. Ook microvasculaire trombose speelt een cruciale regel in verschillende ziekten, waaronder trombotische trombocytopenische purpura, sepsis, diffuse intravasale stolling, antifosfolipidensyndroom en veneuze insufficiëntie, onder anderen. Verschillende nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling en preventie van trombose werden ontwikkeld in de afgelopen jaren, maar antiplatelet drugs en antistollingsmiddelen hebben nog steeds bijwerkingen, gebrek antagonisten, en zijn voorzien van lange duur effecten. Deze tekortkomingen leiden tot problemen in dringende medische zorg. Aldus is meer onderzoek nodig om de complexe processen die optreden tijdens trombose, die nauwelijks kan worden gesimuleerd in vitro bloot te leggen. De haarloze SKH1-Hr hr muis werd ontdekt 1926 in een dierentuin in Londen.Vanwege een gendefect op chromosoom 14, het dier verliest zijn vacht na postnatale dag 10. Dit geeft een goed gevasculariseerde auricula toegankelijk intravitale microscopie van de vaten. De gemiddelde dikte van het oor is 300 urn. Het bestaat uit twee lagen van de dermis, die worden gescheiden door kraakbeen. Aan de convexe dorsale zijde van het kraakbeen, 3 vaatbundels voert de oorlel. Apicale vasculaire bogen en basale shunts sluit de drie bundels. De venules hebben diameters tussen 200 urn (basaal) en 10 urn (apicale). Fijnmazig haarvaten rond de lege haarzakjes 2. De anatomie van de haarloze SKH1-Hr hr muis maakt de oorschelp een krachtige en kosteneffectieve model voor trombose onderzoek.

<table><tbody><tr><td>SKH-1/hr muizen</td><td>Charles River</td><td>477</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>standaard laboratoriumvoer</td><td>ssniff Spezialdiaeten</td><td>V1594-0&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>operatie stereomicroscoop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M651/M655&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>intravitale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axiotech Vario 100&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>objectief (20X/0.95)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>objectief (63X/0.95)</td><td>Zeiss</td><td>63x/0,95 W; ACHROPLAN&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>zwart-wit CCD-camera&nbsp;</td><td>Pieper&nbsp;</td><td>FK 6990 IQ-S&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>DVD-recorder</td><td>Panasonic</td><td>DMR-EX99V&nbsp;</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>natriumchloride</td><td>Braun</td><td>5/12612055/1011</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>Bela pharm</td><td>F3901-6</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC-dextran 5%</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>46945-100MG-F</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>dexapanthenol 5% oogzalf</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehyde 4%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>coverslips 5 x 5 x 1 mm</td><td>Menzel</td><td>L4339</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>Hechtstrips</td><td>Leukosilk</td><td>4683400</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>CLGS 15</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>hematologie analyzer</td><td>Sysmex</td><td>KX-21 A6980</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-bloedbuis</td><td>Sarstedt</td><td>201,341</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>wattenstaafjes</td><td>Sanyo</td><td>604-A-1</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>infraroodlicht</td><td>Beurer</td><td>5/13855</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>eenmalig gebruik spuit</td><td>Braun&nbsp;</td><td>2020-08</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>insulinespuit</td><td>Braun</td><td>9161502</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>wegwerp hypodermische naalden</td><td>Braun</td><td>465 7640</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>eind-tot-eind capillair</td><td>Sarstedt</td><td>19,447</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>verwarmingsplaat</td><td>Klaus Effenberg</td><td>OP-T 185/03</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>schaar 14,5 cm</td><td>Aesculap</td><td>BC259R</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>naaldhouder</td><td>Aesculap</td><td>BM081R</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>microforceps</td><td>Aesculap</td><td>BD331R</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>microschaar</td><td>Aesculap</td><td>OC496R</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>scalpel 21</td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.511</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>Prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td>XNEH7470</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8706.P33</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>elektrocauterisatie</td><td>Servoprax</td><td>H40140</td><td>kan worden gekocht bij andere leveranciers&nbsp;</td></tr><tr><td>acrylglas pad</td><td></td><td></td><td>geïntegreerde verwarming, 0,5&nbsp;cm hoge vlakte</td></tr></tbody></table>

opklaren en trombus inductie in de oorlel van een hairless mouse

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Trombotische complicaties van vasculaire ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de geïndustrialiseerde landen. Vanwege de complexe interacties tussen cellulaire en niet-cellulaire bloedcomponenten bij thrombusvorming, kan betrouwbare studies van de fysiologie en pathofysiologie van trombose alleen worden uitgevoerd in vivo. Daarom worden in dit artikel een oor model in haarloze muizen en richt zich op de in vivo analyse van de microcirculatie, trombusvorming en trombus evolutie. Via intravitale fluorescentiemicroscopie en intraveneuze (iv) toepassing van de respectieve fluorescerende kleurstoffen, kan een herhaalde analyse van de microcirculatie in de oorschelp gemakkelijk worden uitgevoerd, zonder de noodzaak van chirurgische voorbereiding. Bovendien kan dit model worden aangepast voor in vivo studies van verschillende zaken, zoals wondgenezing, reperfusieletsel, of angiogenese. Kortom, het oor van haarloze muizen is een ideaal model voor de in vivo onderzoek microcirculatie in fysiologische of pathofysiologische aandoeningen en de evaluatie van de reactie op andere systemische of topische behandelingen.

Effecten van Cannabinoid Treatment thrombogenese Na injectie van 0,05 ml FITC-dextran, fototoxisch trombus inductie leidt tot een endotheliale laesie en de vorming van een pariëtale plaatjesprop (figuren 2 en 3). In deze studie thrombus-inductie na ip injectie van cannabinoïden (5 mg / kg lichaamsgewicht) of vehikel tot een trombotische occlusie vat alle venules (figuur 4). Bij m...

Het oor model van de kale SKH1-Hr uur muis maakt intravitale fluorescentiemicroscopie microcirculatie en fototoxische trombus inductie zonder voorafgaande chirurgische preparaten in de onderzochte microvasculaire bed. Daarom is het oor van de haarloze muis is een uitstekend in vivo model voor de complexe interacties te bestuderen tijdens microvasculaire trombusvorming, trombus evolutie, en trombolyse.

Opklaren en Trombus inductie in de oorlel van een Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Het algemene doel van dit experiment is om de invloed van potentiële vasoactieve geneesmiddelen op microvasculaire trombusvorming in vivo te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over trombusvorming, zoals het identificeren van nieuwe antithrombotische stoffen die kunnen helpen bij het voorkomen van microvasculaire trombusvorming, wat een van de belangrijkste complicaties is bij sepsis en tijdens weefseltransplantatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het oormodel van de haarloze muis intravitale fluorescentiemicroscopie en fototoxische trombusinductie mogelijk maakt zonder voorafgaande chirurgische preparatie in het onderzochte microvasculaire bed.Begin met het wegen en het noteren van het gewicht van de muis. Vul vervolgens het juiste volume van de teststof in een insulinespuit. Dien het geneesmiddel 30 minuten vóór de inductie van de trombus toe.Nadat de muis 15 minuten vóór de inductie van de trombus is genarceerd, plaatst u de muis terug in de kooi tot het begin van de anesthesie. Om voldoende anesthesie te verifiëren, knijpt u met een pincet in de staart en stelt u vast dat er geen reactie optreedt. Vul vervolgens een insulinespuit met 0,05 ml ontdooid 50 Dextran.Zorg er na het vullen van de spuit voor dat er geen luchtbellen achterblijven, omdat zelfs kleine intraveneus toegediende luchtbellen dodelijk kunnen zijn voor het dier. Plaats de geanestheseerde muis in buikligging op een acroglass-mat met een geïntegreerde warmteplaat. Stel de warmteplaat in op 37 °C.Bedek de hoornvliezen van de muizenogen met oogzalf. Zet vervolgens twee hechtingen van polypropyleen 7.0 in de craniale en caudale rand van het rechteroor. Plaats de hechtingen zo dicht mogelijk bij de rand en zo proximaal mogelijk ten opzichte van de basis.Plaats de muis in rugligging. Fixeer alle poten aan het platform met behulp van hechtpleister. Haak een hechtdraad onder de voortanden en breng de kop in dorsiflexie door de hechtdraad met hechtpleister aan het platform te bevestigen.Plaats het dier op het platform onder de stereomicroscoop. Gebruik een 10X vergroting. Voor microscopie van het rechteroor wordt de linker jugulaire vene geprepareerd door eerst een incisie van 5 mm in de huid van de nek te maken in craniocaudale richting.Gebruik vervolgens micro-pincetten en microscharen om het subcutane weefsel te dissekeren. Bevrijd daarna de vene van de adventitia zonder het vat aan te raken. Gebruik nu de eerder voorbereide insulinespuit voor de injectie van de fluorescerende kleurstof.Pak de vaatwand voorzichtig vast met de micro-pincet zonder de vene te perforeren. Doorboor de uitgezette vaatwand met de injectienaald en injecteer 50 Dextran intraveneus. Trek de naald eruit en stop het bloeden met wattenstaafjes.Voorkom bloed- en kleurstofcontaminatie van het oor. Verplaats het dier op de warmteplaat naar een constructie van acroglas met een gleuf voor de warmteplaat en een vlak van 0,5 cm hoog voor het positioneren van het oor. Fixeer het dier in buikligging op de warmteplaat met behulp van een hechtpleister.Plaats het convexe kraakbeen aan de basis van het oor naast het vlak voor het oor, zodat het apicale deel van het oor plat op het vlak kan worden gepositioneerd. Voeg één druppel aqua op kamertemperatuur toe aan de acro-glasplaat. Absorbeer de druppel aqua met wattenstaafjes en laat capillaire krachten het oorvlak aan het acro-glas bevestigen.De oorschelp moet zo plat mogelijk worden geplaatst, ondanks dat het kraakbeen de oorschelp een convexe vorm geeft. Daarom moet alleen het meer flexibele distale deel van de oorschelp op de acryglasplaat worden geplaatst. Om weefselbeschadiging en extravasatie van vloeistoffen en kleurstof te voorkomen, moet het oor zo min mogelijk met de pincet worden aangeraakt.Voeg vervolgens een druppel aqua toe aan de convexe dorsale zijde van het oor. Plaats voorzichtig een dekglas op het oor zonder de basale vaten die het oor binnenkomen samen te drukken. Gebruik wattenstaafjes om zoveel mogelijk aqua van onder het dekglas te verwijderen om de afstand tussen het dekglas en de doelvaten in het oor te minimaliseren.Begin met het afstellen van de intravitale fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van 50 Dextran. Plaats het voorbereide dier op het platform van de intravitale fluorescentiemicroscoop. Zoek met een vergroting van 5X, 10X en 20X en een lichtintensiteit van 20% naar een veneus vat met een diameter van 50 tot 60 microns en een anterograde bloedstroom.Voeg één druppel water op kamertemperatuur toe aan het dekglas voor waterimmersie van het objectief met 63X vergroting. Begin direct na het aanbrengen van de waterdruppel met het opnemen van het vat gedurende 20 seconden voor de baseline-beoordeling van de diameter en de bloedstroom. Start de trombusinductie vijf minuten na de injectie van 50 Dextran.Verhoog hiervoor de lichtintensiteit naar 100%. Sluit tijdens de fototoxische trombusinductie de diafragmabukaan van de microscoop gedurende twee seconden binnen een periode van 30 seconden om te controleren op occlusie van de bloedstroom. Als de bloedstroom aanhoudt, open dan de diafragmabukaan opnieuw. Het vat wordt als geoccludeerd geclassificeerd als de stroom 30 seconden of langer stilstaat, of als de bloedstroom retrograde is.Selecteer en occludeer vijf vaten per oor binnen een tijdsbestek van één uur na injectie van 50 Dextran. Hier werden de dieren behandeld met een vehikel of met cannabinoiden, anandamide, WIN 155, 212-2 of cannabidiol vóór injectie van 50 Dextran voorafgaand aan de inductie van de trombus. Anandamide, maar niet CBD en WIN 155, 212-2, versnelde de trombusgroei na een eenmalige behandeling significant in vergelijking met de vehikelcontrole.In een andere setting werd anandamide gecombineerd met indomethacine om de impact van cyclooxygenase-afhankelijke producten op trombusvorming via anandamide te beoordelen. Co-administratie met indomethacine neutraliseerde het pro-trombotische effect van anandamide. Daarom veroorzaakt acute blootstelling aan anandamide in vivo een cyclooxygenase-afhankelijk pro-trombotisch effect.Zodra de techniek onder de knie is, kan de inductie van trombi in nauwe vaten in 90 minuten worden uitgevoerd, inclusief de voorbereiding. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de auricula telkens zeer voorzichtig te hanteren om extravasatie van de vloeistoffen en kleurstof te voorkomen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in trombusvorming, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals wondgenezing, flapfalen en angiogenese.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de intraveneuze applicatie van fluorescerende kleurstoffen, de positie van de oorschelp en de verlichting van specifieke vaten om intravitale fototoxische trombusinductie uit te voeren.

intravital-microscopy-thrombus-induction-earlobe-hairless

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

This video demonstrates the procedure to generate photothrombotic stroke in a mouse model by laser illumination of an intact skull following administration of photosensitive dye.

Modeling Photothrombotic Stroke in Mouse Model: A Laser Illumination Technique Through Mouse Skull Following Photosensitive Dye Administration to Induce Photothrombosis

This video demonstrates the intravital fluorescence microscopy technique to study thrombus formation in a mouse model. The mouse is injected with a fluorophore-labeled polysaccharide to monitor blood circulation. Upon illumination with a high-intensity light, the phototoxic induction of an injury in the microvasculature of the ear leads to the formation of a thrombus, which is confirmed by visualizing the obstruction in the blood flow.

Intravital Fluorescence Microscopy to Study Microvascular Thrombus Formation

Source: Kim, D., et. al. Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates visualization of cerebral thrombus in mice using micro-computed tomography (micro-CT) imaging. A cerebral thrombus mouse model is injected with fibrin-targeted gold nanoparticles acting as a contrasting agent. The mouse is placed on the bed of a micro-CT machine, and images are acquired from multiple angles.

Visualization of a Cerebral Thrombus in a Mouse Using Micro-Computed Tomography Imaging

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Wij rapporteren een verfijnde procedure van de ijzerchloride (FeCl3) geïnduceerde trombose modellen op de halsslagader en mesenterica evenals ader, efficiënt gekarakteriseerd met behulp van intravitale microscopie tot tijd om trombi vorming occlusief bewaken.

IJzer-Chloride geïnduceerde Murine Trombose Models

Dit protocol beschrijft de inductie van een ischemie-reperfusie (IR) model op de muis oor huid met behulp van magneet klemmen. Met behulp van een custom-built intravitale imaging model, bestuderen we in vivo ontstekingsreacties post-reperfusie. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is om te begrijpen hoe leukocyten reageren op huid IR schade verlengen.

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Leer fototoxische trombusinductie in de oorlel van een haarloze muis voor intravitale fluorescentiemicroscopie. Deze methode onderzoekt de invloed van vasoactieve geneesmiddelen op microvasculaire trombusvorming in vivo.

Opklaren en Trombus inductie in de oorlel van een Hairless Mouse

Meer video's verkennen