Het analyseren van Synaptic Modulatie van Drosophila melanogaster Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light
10 februari 2017
Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om synaptische dynamica in een enkele neuron onder verschillende activeringscondities te begrijpen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van synaptische plasticiteit, zoals het onthullen van veranderingen in de moleculaire samenstelling van synapsen bij het rijpen van de neuronactiviteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de semi-automatische analyse van meerdere aspecten van synapsen mogelijk maakt, inclusief hun aantal, verdeling en het niveau van verrijking van moleculaire componenten na synapsen.
Verzamel voor dit experiment de vliegen in normale flesjes binnen zes uur na het uitkomen. Laad de verzamelflesjes in een transparante acryl rek. Positioneer het rek in een kleine incubator ingesteld op 25 graden Celsius op een nauwkeurige afstand van een LED-paneel waar de lichtblootstelling gemiddeld 1000 lux is.
Kweek vervolgens vliegen voor een tot drie dagen onder een van de volgende omstandigheden, namelijk constante duisternis, 12 uur licht gevolgd door 12 uur duisternis, of constant licht. Later, ontleed en kleuren de hersenen met standaardtechnieken. Om de vliegenhersenen te plaatsen, laad een micropipet met montagemedium en deponeer twee druppels van 2 microliter in het midden van een microscoopglasplaat op ongeveer 2 cm afstand.
Plaats een dekglas op elke druppel en de opening ertussen van ongeveer 0,2 mm. Deponeer vervolgens 15 microliters montagemedium over de dekglazen en in de opening. Onder een dissectiemicroscoop, plaats de hersenen in de opening vanuit de micropipet.
Positioneer vervolgens de hersenen, ventrale kant omhoog. Bevestig tenslotte een dekglas en verzegel het langs de randen met heldere nagellak. De hersenen kunnen vervolgens worden afgebeeld met behulp van standaardtechnieken om 3D-beelden te reconstrueren.
In dit geval wordt GFP-luminiscentie gedocumenteerd in cellen met actieve Brp-expressie met behulp van de stermethode. Ook in dit voorbeeld werden R7 en R8 fotoreceptoraxonen geïmmunolabileerd met anticiaoptin, dat werd bekeken met behulp van RFP-gelabelde secundaire antilichamen. Om het aantal, de verdeling en het delocatieniveau van de Brp GFP-puncta te kwantificeren, laadt u eerst gereconstrueerde 3D-beelden van de hersenen opgemaakt uit beeldstacks.
Brp-puncta worden in wit weergegeven. Zoek nu het gebied van belang. In dit geval worden de terminalen van de R8-axon gevonden door het verdunnen van de anticiaoptin-positieve axonen bij het ingangspunt in de M3-medullalaag te volgen.
Bij elke R8-axonterminaal identificeert u de Brp GFP-puncta met behulp van de module voor spotdetectie. Selecteer 'nieuwe spots toevoegen' en selecteer vervolgens 'alleen gebied van belang segmenteren' in de algoritme-instellingen. Zodra het analysegebied is gedefinieerd, stelt u het bronkanaal in op Brp GFP en stelt u vervolgens de geschatte XY-diameter in op 0,35 micron.
En schakel vervolgens achtergrondsubtraksie uit in de spotdetectie. Selecteer vervolgens 'kwaliteit' als filtertype, en de puncta worden automatisch gefilterd. Voltooi deze stap door op 'klaar' te klikken.
Herhaal de spotdetectiemethode voor alle R8-axonen in de dataset. Het volgende gebied om te identificeren is het axon-cytoplasma. Genereer eerst oppervlakteobjecten met de oppervlaktefunctie.
Selecteer vervolgens 'nieuwe oppervlakken toevoegen' en schakel onder de algoritme-instellingen 'alleen gebied van belang segmenteren' in. Selecteer nu handmatig het gebied van belang. Stel vervolgens de berekeningsperimeteren in.
Om het fotoreceptorkanaal als bron te vinden, selecteert u de optie 'glad'. Voor de drempelwaarde selecteert u 'absolute intensiteit'. Schakel de optie 'aanraakobjecten splitsen' in.
Stel de diameter van de stootpunten in op 0,5 micron en gebruik de standaardfilterinstellingen voor kwaliteit en aantal voxels. De filter wordt vervolgens automatisch toegepast. Ga nu naar 'bewerken' en verwijder de stukken oppervlakte die buiten het gebied van belang zijn gegenereerd.
In dit geval de andere axonen. Na het herhalen van de axonregiodetectie voor alle R8-axonen in de dataset, worden alle Brp-puncta en R8-axonen geïdentificeerd als een set spotobjecten. En de overeenkomstige cytoplasmatische regio's worden geïdentificeerd als oppervlakteobjecten.
Ga nu verder door elk axon handmatig te definiëren in oriëntatie en ruimte. Dit is belangrijk voor latere kwantificering van Brp GFP-dichtheid langs elke neuron in de neuropil van de medulla. Om dit te doen, definieert u eerst hun start- en eindpunten.
Selecteer 'nieuwe meetpunten toevoegen', selecteer vervolgens 'bewerken' gevolgd door 'oppervlak van object' om met de bovenkant van de oppervlakteobjecten te werken. Om de startpunten te definiëren, plaatst u meetpunten op alle oppervlakteobjecten van de R-axonen in de M1-laag. Plaats deze punten in een systematische, reproduceerbare volgorde.
Definieer vervolgens de eindpunten. Selecteer 'nieuwe meetpunten toevoegen', 'bewerken' en 'oppervlak van object' opnieuw. Plaats vervolgens, het herhalen van dezelfde systematische volgorde, meetpunten op de onderkant van de R-axonen in de M3-laag.
Om de achtergrondintensiteit van Brp te kwantificeren, analyseert u de cytoplasmatische regio's van twee R7-axonen. Selecteer 'nieuwe oppervlakken toevoegen' en definieer handmatig de regio van een R7-axon zoals gedaan voor de R8-axonen. Gebruik identieke instellingen, maar schakel de optie 'aanraakobjecten splitsen' niet in.
Laat dit uit. Voeg vervolgens een dummy-spotobject toe binnen een gedefinieerde R7-axonregio. Selecteer 'nieuwe spots toevoegen' en selecteer 'automatische creatie overslaan' en handmatig bewerken.
Selecteer vervolgens 'centrum van object' en klik op het oppervlakteobject om het dummy-spotobject binnen de R7-axon te plaatsen. Herhaal nu de oppervlakte- en spotdetectiestappen voor een tweede R7-axon. Definieer vervolgens de start- en eindterminalpunten van de R7-axonen zoals ged
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode om het aantal en de ruimtelijke distributie van synaptische actieve zones in fotoreceptoren van Drosophila melanogaster te kwantificeren. De techniek maakt gebruik van een genetisch gecodeerde moleculaire marker om synapsen te visualiseren en onderzoekt de modulatie ervan na langdurige blootstelling aan licht.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Synaptische Plasticiteit
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische dynamiek is cruciaal voor inzichten in de neuronale functie.
- Veranderingen in de synaptische samenstelling kunnen optreden bij de rijping van de neuronale activiteit.
- Het kwantificeren van synaptische kenmerken helpt bij het bestuderen van synaptische plasticiteit.
- Drosophila melanogaster dient als modelorganisme voor dergelijke studies.
Doel van de studie
- Om synaptische actieve zones in fotoreceptoren te kwantificeren.
- Om de effecten van lichtblootstelling op synaptische modulatie te analyseren.
- Om het begrip van synaptische dynamiek in neuronen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van Drosophila melanogaster vliegen kort na het uitkomen.
- Gebruik van transparante acrylrekken voor de huisvesting van de vliegen.
- Gecontroleerde lichtblootstelling met behulp van een LED-paneel ingesteld op 1000 lux.
- Semi-geautomatiseerde analyse van synaptische kenmerken.
Belangrijkste Resultaten
- De kwantificering van synaptische actieve zones is succesvol uitgevoerd.
- De ruimtelijke distributie van synapsen is effectief in kaart gebracht.
- Modulatie van synaptische kenmerken werd waargenomen bij blootstelling aan licht.
- De methode maakt een uitgebreide analyse van de synaptische dynamiek mogelijk.
Conclusies
- Deze techniek biedt waardevolle inzichten in synaptische plasticiteit.
- Inzicht in synaptische veranderingen kan bredere neurowetenschappelijke onderzoeken informeren.
- De methode kan worden toegepast op andere neuronale studies in Drosophila.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling van synaptische plasticiteit in een genetisch hanteerbaar model mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie bij de ontwikkeling van neurowetenschappelijke geneesmiddelen. Door de remodellering van de actieve zone als reactie op omgevingsstimuli te meten, biedt het mechanistische inzichten in neuronale adaptatiepaden. De aanpak helpt bij het verminderen van risico's voor targets die betrokken zijn bij de synaptische functie en sensorische verwerking.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de dynamiek van synaptische eiwitten in fotoreceptorneuronen.
- Operationele waarde: Verduidelijkt veranderingen in de moleculaire samenstelling bij presynaptische actieve zones onder gedefinieerde stimulatiecondities.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de biologische risicoanalyse van targets die betrokken zijn bij activiteitsafhankelijke synaptische remodellering.
Screening en assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening in programma's voor neurodegeneratie.
- Kwantitatieve output: Maakt gestandaardiseerde meting mogelijk van het aantal synaptische puncta, de distributie en de delocalisatie.
- Nut van het platform: Faciliteert reproduceerbare evaluatie van compounds via semi-geautomatiseerde workflows voor beeldanalyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert activiteitsafhankelijke synaptische veranderingen die relevant zijn voor sensorische verwerkingsstoornissen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie van synaptische modulatoren.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert verdere ontwikkeling op basis van meetbare synaptische functionele outputs.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows en ondersteunt hypothesetesten en lead-identificatie via kwantificeerbare synaptische fenotypes.
- Ontdekkingsbiologie: Test hypothesen over het transport van synaptische eiwitten en de stabiliteit van de actieve zone.
- Screening: Levert assay-klare resultaten over synaptische dichtheid en ruimtelijke organisatie.
- Analytics: Genereert gegevens over de ruimtelijke distributie langs axonen om condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Koppelt structurele synaptische veranderingen aan functionele uitkomsten in neurale circuits.
- Hergebruik binnen organisaties: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van synaptische plasticiteit in verschillende neuronale subtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in de synaptische functie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van synaptische fenotypering over verschillende experimentele condities.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de effecten van target-engagement op de synaptische structuur te kwantificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen die synaptische pathways moduleren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, neuroanatomie en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van confocale beeldvormingssystemen en software voor spotdetectie voor de analyse van puncta.
- Maakt standaardisatie van axon-tracing en definities van regio's van interesse (ROI) tussen gebruikers noodzakelijk.
- Houdt rekening met aanpassingen bij toepassing op andere neuronale typen of ziektemodellen.
- Wordt beperkt door de noodzaak van genetische labeling van synaptische componenten en handmatige stappen voor axon-tracing.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Treatment of Flies and Imaging Brains
2:54
Image Analysis: Generating the Spots, Surface Objects, Start-points, and End-points
8:04
Image Analysis: Calculating the Number of Spots, Distribution of Spot Frequency and Enrichment Level of Brp-GFP
9:48
Results: Brp-GFP Expression in R8 Synapses of the Medulla
11:02
Conclusion
