Het analyseren van Synaptic Modulatie van

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de synaptische dynamiek in één enkel neuron onder verschillende activeringsomstandigheden te begrijpen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van synaptische plasticiteit, zoals het onthullen van veranderingen in de moleculaire samenstelling van synapsen bij de rijping van de neuronale activiteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de semi-geautomatiseerde analyse mogelijk maakt van meerdere aspecten van synapsen, waaronder hun aantal, distributie en het verrijkingsniveau van moleculaire componenten na de synapsen.

Verzamel voor dit experiment de vliegen in normale vials binnen zes uur na het uitkomen. Plaats de verzamelvials in een transparant acrylrek. Positioneer het rek in een kleine incubator die is ingesteld op 25 °C op een nauwkeurige afstand van een LED-paneel waarbij de lichtblootstelling gemiddeld 1000 lux bedraagt.

Kweek de vliegen vervolgens gedurende één tot drie dagen onder een van de volgende omstandigheden: constante duisternis, 12 uur licht gevolgd door 12 uur duisternis, of constant licht. Dissecteer en kleur later de hersenen met behulp van standaardtechnieken. Om de hersenen van de vliegen te monteren, vult u een micropipet met monteermedium en plaatst u twee druppels van 2 µL in het midden van een microscoopglaasje, met ongeveer 2 cm tussenruimte.

Plaats op elke druppel een dekglas waarbij de opening ongeveer 0.2 mm bedraagt. Breng vervolgens 15 µL monteermedium aan over de dekglazen en in de opening. Breng onder een dissectiemicroscoop de hersenen met een micropipet in de opening aan.

Positioneer vervolgens de hersenen met de ventrale zijde naar boven. Bevestig tot slot een dekglas en verzegel dit langs de randen met transparante nagellak. De hersenen kunnen vervolgens worden afgebeeld met standaardtechnieken om 3D-beelden te reconstrueren.

In dit geval wordt GFP-luminescentie gedocumenteerd in cellen met actieve Brp-expressie met behulp van de star-methode. Ook in dit voorbeeld werden R7- en R8-fotoreceptoraxonen immunogelabeld met anticiaoptine, wat werd gevisualiseerd met RFP-gelabelde secundaire antilichamen. Om het aantal, de distributie en het delocalisatieniveau van de Brp GFP-puncta te kwantificeren, laadt u eerst gereconstitueerde 3D-beelden van de hersenen die zijn gemaakt van beeldstacks.

Brp-puncta worden in het wit weergegeven. Bepaal nu het gebied van interesse. In dit geval worden de terminals van het R8-axon gelokaliseerd door de versmalling van de anticiaoptine-positieve axonen te volgen bij het instappunt in de M3-medullalaag.

Identificeer bij elke R8-axonterminal de Brp GFP-puncta met behulp van de module voor spotdetectie. Selecteer 'add new spots' en kies vervolgens 'segment only region of interest' in de algoritme-instellingen. Zodra het analysegebied is gedefinieerd, stelt u het bronkanaal in op Brp GFP en zet u de geschatte XY-diameter op 0,35 microns.

Vink vervolgens achtergrondsubtractie aan bij de spotdetectie. Selecteer daarna 'quality' als filtertype, waarna de puncta automatisch worden gefilterd. Voltooi deze stap door op finish te klikken.

Herhaal de methode voor spotdetectie voor alle R8-axonen in de dataset. De volgende regio die geïdentificeerd moet worden, is het axoncytoplasma. Genereer eerst oppervlakte-objecten met de surface-functie.

Select vervolgens 'add new surfaces' en schakel onder de algoritme-instellingen 'segment only region of interest' in. Selecteer nu handmatig het interessegebied. Stel vervolgens de berekeningsparameters in.

Selecteer de optie 'smooth' om het fotoreceptor-kanaal als bron te gebruiken. Selecteer 'absolute intensity' voor de drempelwaarde. Schakel de optie 'split touching objects' in.

Stel de diameter van de seat points in op 0.5 microns en gebruik de standaard filterinstellingen voor de kwaliteit en het aantal voxels. Het filter wordt vervolgens automatisch toegepast. Ga nu naar bewerken en verwijder de delen van het oppervlak die buiten het interessegebied zijn gegenereerd.

In dit geval de overige axonen. Na het herhalen van de detectie van de axonregio voor alle R8 axonen in de dataset, worden alle Brp puncta en R8 axonen geïdentificeerd als een set spot-objecten. En de overeenkomstige cytoplasmatische regio's worden geïdentificeerd als oppervlakte-objecten.

Definieer nu handmatig de oriëntatie en ruimte van elk axon. Dit is belangrijk voor de latere kwantificering van de Brp GFP-dichtheid langs elk neuron in het neuropil van de medulla. Definieer hiervoor eerst hun start- en eindpunten.

Selecteer 'add new measurement points', selecteer vervolgens 'edit' en daarna 'select surface of object' om met de bovenzijde van de oppervlakte-objecten te werken. Om de startpunten te definiëren, plaatst u meetpunten op alle oppervlakte-objecten van de R-axonen in de M1-laag. Plaats deze punten in een systematische, reproduceerbare volgorde.

Definieer vervolgens de eindpunten. Selecteer 'add new measurement points', 'edit' en opnieuw 'surface of object'. Plaats vervolgens, in dezelfde systematische volgorde, meetpunten op de onderkant van de R-axonen in de M3-laag.

Om de achtergrondintensiteit van Brp te kwantificeren, analyseert u de cytoplasmatische regio's van twee R7-axonen. Selecteer 'add new surfaces' en definieer handmatig de regio van een R7-axon, zoals is gedaan voor de R8-axonen. Gebruik identieke instellingen, behalve dat u de optie 'enable split touching objects' niet inschakelt.

Laat dit uitstaan. Voeg vervolgens een dummy-spots-object toe binnen een gedefinieerde R7-axonregio. Selecteer 'add new spots', selecteer 'skip automatic creation' en bewerk handmatig.

Select vervolgens het centrum van het object en klik op het oppervlakteobject om het dummy-spots-object in het R7-axon te plaatsen. Herhaal nu de stappen voor oppervlakte- en spotdetectie voor een tweede R7-axon. Definieer vervolgens de begin- en eindterminale punten van de R7-axonen, zoals is gedaan bij de R8-axonen.

Zorg ervoor dat voor deze analyse de juiste software is geïnstalleerd. Open de dataset die de spotgegevens, oppervlaktegegevens en twee objecten met meetpunten bevat, waarbij elk object hetzelfde aantal meetpunten bevat. Inspecteer de gegevens.

Beide meetpuntobjecten moeten hetzelfde aantal meetpunten hebben om de berekeningen mogelijk te maken. Zodra de spots, axonregio's en de start- en eindpunten zijn gedefinieerd, start u de plugin. Controleer eerst de metadata, in het bijzonder de voxelgrootte.

Open de afbeeldingseigenschappen via bewerken en controleer vervolgens de 3 dimensies van de voxel en de microns onder coördinaten in geometrie. Selecteer daarna een kanaal voor de intensiteitsanalyse. In dit geval is het kanaal dat Brp GFP weergeeft geselecteerd.

Definieer vervolgens de bestandsnaam voor de resultaten. Stel daarna het aantal bins in op 10 en zet de axonlengte op 100%. Definieer vervolgens de regio's van de puncta door de spotradius in te stellen op 0,35 microns en de omringende cytoplasmatische regio op 50 microns. Voer tot slot het commando voor synapsdetectie uit en analyseer later de output statistisch.

Volgens de beschreven protocollen werden Brp GFP puncta geanalyseerd in de R8-synapsen van vliegen die waren blootgesteld aan constant donker, constant licht of een normale licht/donkercyclus. Het aantal Brp puncta was significant verminderd in de R8-fotoreceptoren van vliegen die in constant licht werden gehouden. De distributie van de puncta werd berekend met behulp van een aangepaste plug-in.

R8-synapsen waren over de gehele lengte van de axonale schacht verdeeld van de M1- tot de M3-laag, maar hun dichtheid was hoger bij de M1- en M3-lagen. Op dezelfde manier werden de delocalisatieniveaus van de puncta berekend. Deze waren in alle condities ongewijzigd; de delocalisatieniveaus van Brp GFP verschilden echter van andere reporters, zoals Brp-short-cherry, dat onder constant licht duidelijk diffuus wordt.

Het is mogelijk dat er een onjuiste verwerking plaatsvindt van het korte Brp-fragment na dissociatie van de AZ. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe synaptische plasticiteitseigenschappen in een enkel neuron geanalyseerd kunnen worden. Dergelijke plasticiteitseigenschappen omvatten het aantal synapsen, hun distributie en de verrijking van een specifiek moleculair component na de synapsen.