Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs

Het algemene doel van deze procedure is om de potentie van immunomodulerende geneesmiddelen te evalueren met behulp van een geautomatiseerde celteller door de blastogenese of blasttransformatie van T-lymfocyten te meten. Deze test biedt een snelle methode voor het kwantificeren van de activering van T-lymfocyten met behulp van een geautomatiseerde celteller die is uitgerust om celdiameters te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de snelle eenvoudige en directe meting van enkele cellen mogelijk maakt, in tegenstelling tot gebruikelijke T-lymfocyt-proliferatie-assays.

Het behandelen van lymfocyten met immunomodulerende geneesmiddelen zal de snelheid en mate van cellulaire blastogenese verhogen of verlagen. Met behulp van de celteller-assay kan de mate van deze blastogenese in ongeveer vier minuten per monster worden gemeten. Binnen tien minuten na het opofferen, spuit u de buik van de muis met 70 procent ethanol en maakt u met een schaar een insnijding in het haar en de huid aan de linkerkant van het dier.

Houd de huid uit elkaar en naar achteren om het peritoneum te onthullen. Breng vervolgens een vier procent chlorhexidine aan op de incisieplaats. Gebruik een tweede set scharen en pincetten om een snede van twee tot drie centimeter langs de centrale buik te maken om het peritoneum te openen.

Verwijder vervolgens de viscerale aanhechtingen en overtollig vet rond de milt en breng het weefsel over in een vat met DPBS. Voeg vervolgens tien milliliter compleet RPMI 1640-medium toe aan een tien centimeter kweekschaal en verpletter de milten tussen twee gesteriliseerde matglasplaten. Filter de weefselslurry door een steriele 40 micron nylon celstrainer in een nieuwe tien centimeter kweekschaal om het bindweefsel en puin te verwijderen en breng de enkele celsuspensie over in een 50 milliliter kegelbuis voor centrifugatie.

Resuspendeer het pellet in 20 milliliter erytrocytlysebuffer. Na tien minuten op kamertemperatuur met zacht schudden, verzamel de cellen met een andere centrifugatie en resuspendeer het pellet in tien milliliter vers medium. Centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw voor resuspendering in twee milliliter volledig medium van 37 graden Celsius.

Om de T-cellen te zuiveren, was u eerst één tot twee nylonwolkolommen per milt twee keer met vijf milliliter compleet RPMI en plaats de kolommen in een celcultuurincubator van 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide gedurende één uur. Aan het einde van de incubatie, laadt u twee milliliter van de geïsoleerde splenocytensuspensie op de bovenkant van elke kolom en laat u de cellen door de kolom passeren totdat de vloeistof de bovenkant van de wol bereikt. Voeg vervolgens twee milliliter vers volledig medium van 37 graden Celsius toe aan de bovenkant van de kolommen en laat het medium door de nylonwol passeren totdat de vloeistof aan de bovenkant van de kolom de bovenkant van de wol bereikt.

Bedek nu de wol met drie milliliter volledig medium van 37 graden Celsius en breng de kolom terug naar de celcultuurincubator om alle B-cellen, fibroblasten en accessoirecellen aan de wolvezels te laten hechten. Na een uur, was de kolom in een nieuwe 50 milliliter kegelbuis twee keer met vijf milliliter vers compleet medium om de niet-aangehechte T-cellen te elueren. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie.

Nadat de T-cellen eenmaal zijn gewassen met tien milliliter compleet medium, resuspendeer het pellet in twee milliliter vers compleet medium. Tel vervolgens de cellen en verdun de suspensie tot een concentratie van 0,5 keer tien tot zes cellen per milliliter in vers compleet medium voor het zaaien in een zes- of 24-putjes celkweekplaat, zoals experimenteel passend. Binnen 24 uur na hun isolatie, activeer de met nylonwol geïsoleerde T-cellen met de juiste stimulus en het experimentele geneesmiddel van belang.

Na 12 tot 72 uur, gebruikt u een pipet van één milliliter om de geactiveerde behandelde cellen voorzichtig te mengen om eventuele klonten te verwijderen. Om de celdiameters met de geautomatiseerde celteller te meten, brengt u één milliliter van de behandelde cellen uit elke put over in individuele monsterbekers en plaatst u de monsterbekers in de monstercarrousel van de geautomatiseerde celteller. Voer de monster-ID en celtype-informatie in om de monsters te loggen en begin met het uitvoeren van de monsters.

Na het mengen van trypanblauw met de celsuspensie, worden de cellen over een beeldveld gevoerd totdat er ongeveer 100 celbeelden van elk monster zijn verzameld. De software tekent een cirkel rond elke gedetecteerde trypanblauw gekleurde en ongekleurde cel om de celdiameter te bepalen. Wanneer alle cellen zijn gemeten, worden de gegevens geëxporteerd naar een spreadsheet die de resultaten weergeeft als de totale en levensvatbare celtelling voor elke gemeten diameter.

De gegevens kunnen vervolgens worden gepresenteerd als histogrammen. Na twee dagen stimulatie met PMA en ionomycine, wordt een significante verschuiving in de mediaan van de frequentieverdeling naar grotere celdiameters waargenomen, waarbij het aantal T-cellen met kleinere diameters dienovereenkomstig wordt verminderd. Bij een vaste ionomycineconcentratie van 250 nanomolair, wordt het PMA-effect niet significant veranderd door de concentratie van de activeringsstimulus te verhogen van twee naar 250 nanogram per milliliter.

Er is ook geen merkbare verschil in de T-celproliferatie waargenomen. Calcineuarine remmer geneesmiddelen onderdrukken gedeeltelijk zowel de T-cel blastogenese als proliferatie. T-celbehandeling met immunosuppressieve verbindingen die zich richten op de calcineurine nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, remmen de blastogene respons met bijna 72 procent.

Rapamycine en FTY720 vertonen matige maar statistisch significante effecten op blastogenese. Terwijl TRAM34 blijkbaar de muis T-celproliferatie niet beïnvloedt, zelfs niet bij 700 nanomolair concentraties. Wanneer rapamycine en cyclosporine A samen worden gebruikt, wordt blastogenese volledig geremd.

Vergelijkbare resultaten worden waargenomen met muis T-cellen geactiveerd met anti-CD3 en anti-CD28 geconjugeerde magnetische kralen. Deze test kan worden gebruikt om de effecten van verschillende immunomodulerende geneesmiddelen met succes te kwantificeren, waardoor een betere beoor