Name: An-aptameergebaseerde Sensor voor Unchelated Gadolinium (III) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Leer een fluorescente aptameersensor voor het detecteren van ongechelateerd gadolinium(III) in MRI-contrastmiddelen. Deze methode biedt hoge gevoeligheid en selectiviteit voor toxische ionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Milan N Stojanovic van de Columbia University, New York, NY dankbaar erkennen voor zijn waardevolle wetenschappelijke input. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de California State University East Bay (CSUEB) en de CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C. en A.L. werden ondersteund door het CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

OPMERKING: Moleculaire biologie kwaliteit water wordt gebruikt in alle buffer en oplossing preparaten. Alle disposable buizen (microcentrifuge en PCR) en pipet tips zijn DNase- en RNase-vrij. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) voor alle chemische stoffen voor gebruik. Het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt sterk aanbevolen. 1. Bereiding van de aptameer Voorraadoplossingen <ol><li> Aankoop van 2 strengen van polydeoxynucleotide commercieel. Bestellen beide strengen reinigend via hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Deel 1 (Gd-aptameer): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; Deel 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Ontbinden elke streng in water tot 100 urn individuele aandelen oplossingen van de Gd-aptameer en de QS te maken. </li><li> Bewaar de oplossingen bij -20 ° C. De oplossingen zijn stabiel tot dusver voor 3 jaar. </li><li> Om freez minimaliserene-dooi cycli, slaan de voorraad oplossingen in 10 pi porties. </li></ol> 2. Bereiding van de 2x Gd-sensor Solution <ol><li> Bereid de testbuffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Breng de pH op ~ 7,4 met NaOH en HCl en filteren door middel van steriele fles top filters met 0,2 um PES membraan. Bewaar in steriele flessen. Als gefiltreerd en juiste wijze zijn opgeslagen (bij kamertemperatuur), de buffer stabiel tot dusver voor 2 jaar. </li><li> Verdun 1 pi van het Gd-aptameer voorraadoplossing (uit stap 1.2) en 2 pi van de QS voorraadoplossing (uit stap 1.2) in 497 pi van de assay buffer. Meng goed met behulp van een vortex. De concentratie in de 2x Gd-sensoroplossing zijn 200 nM en 400 nM. Opmerking: Het volume van 2x Gd-sensoroplossing bereide stap 500 pl, wat voldoende is om te testen 6 - 7 verschillende concentraties Gd 3+ voor de ijkcurve het contrastmiddel oplossingen(stap 3). Elk monster zal duplo putten in een 384-wells plaat geven. <ol><li> Het volume van de 2x Gd-sensor oplossing volgens het aantal Gd 3+ oplossingen die getest moet worden. </li></ol></li><li> Breng de 2x Gd-sensor oplossing in 9 PCR buizen met 50 pl in elke buis. Plaats de buisjes in een thermische cycler. </li><li> Stel het programma in de thermische cycler met de oplossing voor de buizen tot 95 ° C verhit, gedurende 5 min en vervolgens langzaam afkoelen van de oplossing tot 25 ° C ~ 15 minuten (met een snelheid van ~ 0,05-0,1 ° C / s). De verwarming en koeling cyclus is om een ​​optimale hybridisatie tussen de Gd-aptameer en de QS garanderen. Gedeeltelijke hybridisatieresultaten in onvolledig harden en een hogere achtergrondfluorescentie van de sensor. Als een thermische cycler niet beschikbaar is, voert deze procedure op een warm waterbad plaats. </li><li> Eenmaal afgekoeld tot 25 ° C, direct gebruik de oplossing, of houd in de thermische cycler (tot ongeveer 2 uur) tot klaar te zijngebruikt. Wanneer een waterbad wordt gebruikt voor het verwarmen, laat de buizen in het bad als het water langzaam afkoelt tot kamertemperatuur. </li></ol> 3. De bouw van de Fluorescentie Calibration Curve en de aanwezigheid van Unchelated Gd 3+ in een oplossing van Gd Contrast Agent <ol><li> Ontbinden GdCl 3 vast in de testbuffer (dezelfde buffer als in stap 2,1). </li><li> Behulp van een seriële verdunning, bereiden 100 pl elk van 6 verschillende Gd 3+ oplossingen microcentrifugebuizen het dubbele van de uiteindelijk gewenste concentratie voor de ijkcurve (2x toegevoegd). <ol><li> Bijvoorbeeld, een kalibratie construct voor 0 (alleen buffer zonder GdCl 3), 50, 100, 200, 400 en 800 nM Gd 3+, worden de oplossingen die 0, 100, 200, 400, 800 en 1600 nM van het ion. Zorg ervoor dat u altijd de &#39;lege&#39; met 0 nM Gd 3+ als de negatieve controle. </li></ol></li><li> Los het contrastmiddel tested in de testbuffer. Bereid 2 of 3 verschillende concentraties van het contrastmiddel oplossingen via seriële verdunning. OPMERKING: Testen 3 verschillende concentraties van het contrastmiddel Aanbevolen wordt. Dat is dat deze concentraties binnen het lineaire bereik. Indien het geteste kan een lineair verband niet weergegeven monsters, de concentratie van het contrastmiddel te verminderen gebruikt. </li><li> Neem de PCR-buizen met de 2x Gd-sensor oplossing uit stap 2.5 van de thermische cycler. </li><li> Voeg 50 ul van elke Gd 3+ oplossing van stap 3.2 in 6 van de 9 PCR buizen met de 2x Gd-sensoroplossing. Meng door en neer te pipetteren. Elke PCR buisje bevat nu de gewenste concentratie Gd3 + te testen, 100 nM Gd-aptameer en 200 nM QS. </li><li> De resterende PCR buizen met de 2x Gd-sensor oplossing, voeg 50 ul van het contrastmiddel oplossingen van stap 3,3. Meng goed door en neer te pipetteren een paar keer. </li><li> Incubeer de solutions in de PCR buisjes gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. Zij kunnen worden gelaten tot 30 minuten staan. </li><li> Transfer 45 pi van elke buis in een 384-wells plaat. Elke PCR-buis zal duplo geven. </li><li> Noteer de fluorescentie van elk putje op een plaat-reader. De fluorofoor (FAM) die in de Gd-sensor ontwerp heeft excitatie en emissie maxima van 495 en 520 nm, respectievelijk, zoals vermeld op de website van de leverancier. Kies geschikte excitatie- en emissiegolflengte of filters naargelang de plaat-lezer of monochromator--filter gebaseerde. </li><li> Plot de grafiek van fluorescentie in willekeurige fluorescentie-eenheden (AFU) tegen de concentratie van Gd 3+. </li><li> Plot de grafiek als fluorescentie-voudige verandering tegen de concentratie van Gd 3+. Bereken de fluorescentie-voudige verandering door de AFU van elke concentratie te delen door de AFU van de &#39;blanco&#39; oplossing (met 0 nM van Gd 3+). De fluorescentie voudige verandering zal zorgen voor de normalization van de resultaten, indien de AFU scherm een aantal periodieke (verschillende dagen, etc.) variaties. </li><li> Vergelijk de fluorescentie-emissie van de oplossing die het contrastmiddel en de &quot;blanco&quot;, dat de oplossing die 0 nM GdCl 3 (alleen buffer). OPMERKING: Een hogere fluorescentie van de oplossing GBCA impliceert de aanwezigheid van unchelated Gd 3+, die verder zuivering van het contrastmiddel noodzakelijk maken. De hoeveelheid unchelated Gd 3+ aanwezig kan worden geschat met behulp van de ijkcurve gebouwd in stap 3.10 of 3.11. </li></ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Met behulp van de aptameergebaseerde Gd-sensor, een toename in fluorescentie-emissie die evenredig is met de concentratie van unchelated Gd 3+ waargenomen. Om de hoeveelheid van het monster gebruikt een minimum te beperken, kan de test worden uitgevoerd in een 384-wells microplaat met een totale steekproef volume van 45 ul per putje. In dit ontwerp, is de keuze van fluoresceïne (FAM) en DABCYL (Dab) voornamelijk gebaseerd op de kosten van de reagentia; de emissiegolflengte een andere koppeling van fluorofoor ...

Het toenemende belang van magnetic resonance imaging (MRI) in klinische diagnose, die wordt begrensd door de inherente gevoeligheid van de techniek heeft geleid tot de snelle groei van het onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe gadolinium gebaseerde contrastmiddelen (GBCAs) 1. GBCAs zijn moleculen die worden toegediend om de beeldkwaliteit te verbeteren, en zij hebben meestal de chemische structuur van een trivalent ion gadolinium (Gd 3+) gecoördineerd aan een meertandige ligand. Dit complexatie is van cruciaal belang als unchelated Gd 3+ is giftig; Het is betrokken bij de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose bij sommige patiënten met nierziekte of mislukking 2. Bijgevolg, het detecteren van de waterige vrije ion is behulpzaam bij het waarborgen van de veiligheid van GBCAs. De aanwezigheid van unchelated Gd 3+ in GBCA oplossingen vaak het gevolg van een onvolledige reactie tussen het ligand en de ionen dissociatie van het complex, of displacement door andere biologische metaalkationen 3. Onder de verschillende technieken die momenteel gebruikt om de aanwezigheid van Gd 3+, die berusten op chromatografie en / of spectrometrie hoogste rang qua veelzijdigheid en toepasbaarheid 4. Onder hun sterke punten zijn hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid, de mogelijkheid om verschillende matrices (inclusief humaan serum 5, urine en haren 6, 7 afvalwater en contrastmiddel formuleringen 8) en de gelijktijdige kwantificering van meervoudige Gd 3+ complexen een bedrijf ervan ( van studies voorafgaand aan 2013 wordt beschreven in een algehele herziening van Telgmann et al.) 4. Het enige nadeel is dat een aantal van deze methoden vereisen instrumentatie (bijvoorbeeld inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie) 4 dat sommige laboratoria geen toegang kunnen krijgen. In het kader van nieuwe GBCA ontdekking in het onderzoek en de proof-of-concept niveau, arelatively gemakkelijker, sneller en kosteneffectieve spectroscopische gebaseerde methode (zoals UV-Vis absorptie of fluorescentie) kan dienen als een waardevol alternatief. Met deze toepassingen in het achterhoofd, een fluorescent-aptameergebaseerde sensor voor waterige Gd 3+ werd ontwikkeld 9. De aptameer (Gd-aptameer) is een 44-base lange enkelstrengs DNA-molecuul met een specifieke sequentie van basen die werd geïsoleerd door het proces van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) 9. De aptameer te vormen tot een fluorescerende sensor, wordt een fluorofoor aan het 5&#39;-uiteinde van de streng, die vervolgens gehybridiseerd met een quenching streng (QS) via 13 complementaire basen (figuur 1) bevestigd. Het QS is gelabeld met een donkere quenchermolecuul op de 3 &#39;terminus. Aangezien Gd 3+, de sensor (Gd-sensor), bestaande uit een 1: 2 respectievelijk molverhouding van Gd-aptameer en QS, zal een minimale fluorescentie-emissie als gevolg to energieoverdracht van de fluorofoor naar de onderdrukker. De toevoeging van waterig Gd 3+ zal de QS verplaatsen van de Gd-aptameer, resulterend in een toename in fluorescentie-emissie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> Figuur 1. De sensor (Gd-sensor), die bestaat uit de 44-voet lange aptameer (Gd-aptameer) getagged met fluoresceïne (een fluorofoor) en de 13-voet lange blussen streng (QS) getagged met DABCYL (een donkere quencher) . Aangezien unchelated Gd3 + de fluorescentie van de sensor is minimaal. Onder toevoeging van Gd 3+, verplaatsing van de QS optreedt en een toename in fluorescentie-emissie waargenomen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Er is op dit moment, een veelgebruikte-spectroscopische methode voor het detecterening waterige Gd 3+. Deze test maakt gebruik van het molecuul xylenol oranje, die een verschuiving van de maximale absorptiegolflengte 433-573 nm bij chelatie het ion 10 ondergaat. De verhouding van deze twee absorptiemaxima kan worden gebruikt om de hoeveelheid unchelated Gd 3+ kwantificeren. De aptameer sensor een alternatief (ook complementair zijn) aan de xylenol oranje assay, zoals de twee methoden hebben verschillende reactiecondities (zoals pH en samenstelling van de bufferoplossingen gebruikt), doel selectiviteit, lineaire reeksen van kwantificering en detectie voorwaarden 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence en fluorofore modificatie in het bestelformulier</td><td>Een fluorofoor met een andere emissiegolflengte kan worden gebruikt. De aptamer kan ook bij een andere leverancier worden besteld.</td></tr><tr><td>Quenching strand</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence en quencher modificatie in het bestelformulier</td><td>Een andere quencher voor optimale energieoverdracht van de fluorofoor kan worden gebruikt. De aptamer kan ook bij een andere leverancier worden besteld.</td></tr><tr><td>Moleculair biologie kwaliteit water</td><td></td><td></td><td>Geen specifieke fabrikant, zowel DEPC of niet-DEPC behandeld werkt even goed</td></tr><tr><td>Gadolinium(III) chloride anhydrisch</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride anhydrisch</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td>Corrosie</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Toxisch en corrosief</td></tr><tr><td>384-well zwarte platte bodempolystyreen NBS platen met lage rand</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Platen die geschikt zijn voor fluorescentiemeting zijn vereist.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow steriele wegwerp flesdop filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>De flesdop is voorzien van 0,2 micron PES membraan</td></tr><tr><td>Steriele wegwerpflessen 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>Een grotere of kleinere fles kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>1,5 mL microcentrifugebuizen</td><td></td><td></td><td>Geen specifieke fabrikant, zolang ze DNAse en RNAse-vrij zijn</td></tr><tr><td>0,2 mL PCR-buizen</td><td></td><td></td><td>Geen specifieke fabrikant, zolang ze DNAse en RNAse-vrij zijn</td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td></td><td></td><td>Geen specifieke fabrikant</td></tr><tr><td>Pipet tips (zonder filter) van geschikte maten</td><td></td><td></td><td>Geen specifieke fabrikant, zolang ze DNAse en RNAse-vrij zijn</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Plate readers van andere fabrikanten werken even goed</td></tr></tbody></table>

an-aptameergebaseerde sensor voor unchelated gadolinium (iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Een methode voor het bepalen van de aanwezigheid van niet-gecheleerd trivalent gadolinium-ion (Gd3+) in waterige oplossing wordt gedemonstreerd. Gd3+ is vaak aanwezig in monsters van op gadolinium gebaseerde contrastmiddelen als gevolg van onvolledige reacties tussen de ligand en het ion, of als een dissociatieproduct. Aangezien het ion giftig is, is de detectie ervan van cruciaal belang. Hierin worden het ontwerp en het gebruik van een aptamer-gebaseerde sensor (Gd-sensor) voor Gd3+ beschreven. De sensor produceert een verandering in fluorescentie als reactie op toenemende concentraties van het ion en heeft een detectielimiet in het nanomolaire bereik (~100 nM met een signaal-ruisverhouding van 3). De test kan worden uitgevoerd in een waterige buffer bij omgevings-pH (~7 - 7,4) in een 384-wells microplaat. De sensor is relatief ongevoelig voor andere fysiologisch relevante metaalionen zoals natrium, kalium en calciumionen, hoewel het niet specifiek is voor Gd3+ boven andere trivalente lanthaniden zoals europium(III) en terbium(III). Niettemin worden de lanthaniden niet vaak gevonden in contrastmiddelen of in biologische systemen, en de sensor kan daarom worden gebruikt om selectief niet-gecheleerd Gd3+ in waterige omstandigheden te bepalen.

Een typische fluorescentieverandering van het Gd-sensor oplossing in de aanwezigheid van unchelated Gd 3+ is weergegeven in figuur 2. De emissie kan worden uitgezet als de fluorescentie-voudige verandering (figuur 2A) of de rauwe fluorescentie lezing (Figuur 2B) in willekeurige eenheden (AFU). Beide percelen opbrengst vergelijkbaar kalibratiekrommen met een lineaire bereik voor de concentratie van Gd 3+ dan 1 pM en ...

Het gebruik van polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) moleculen voor het detecteren van ongecheleerd gadolinium(III) ion in een waterige oplossing wordt beschreven. De aanwezigheid van het ion wordt gedetecteerd via een toename in de fluorescentie-emissie van de sensor.

An-aptameergebaseerde Sensor voor Unchelated Gadolinium (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Het algemene doel van deze fluorescentiegebaseerde assay is het detecteren van de aanwezigheid van toxische, niet-gecheleerde gadoliniumionen in waterige oplossingen die contrastmiddelen voor MRI bevatten. Deze methode kan de ontwikkeling van op gadolinium gebaseerde MRI-contrastmiddelen vergemakkelijken door een manier te bieden om de hoge zuiverheid van gesynthetiseerde middelen te waarborgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in staat is om submicromolaire concentraties van niet-gecheleerd toxisch gadolinium te detecteren met een relatief hoge selectiviteit ten opzichte van andere biologische metaalkationen.Om deze procedure te starten, bereidt u de assaybuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Pas de pH aan naar 7.4 met behulp van natriumhydroxide en zoutzuur. Filtreer de buffer vervolgens door een steriel wegwerpflessenfilter met een 0.2 micron PES-membraan.Breng vervolgens 497 µL van de assaybuffer over naar een schone microcentrifugebuis. Voeg één µL van de bereide gadolinium-aptameer-stamoplossing en twee µL van de bereide QS-stamoplossing toe. Breng 50 µL van deze 2X Gadolinium-sensorsolution over naar elk van de negen PCR-buisjes.Plaats de buisjes vervolgens in een thermocycler. Stel de thermocycler zo in dat de monsters vijf minuten lang worden verhit tot 95 °C, waarna de oplossingen in 15 minuten langzaam worden afgekoeld tot 25 °C. Het is belangrijk om eraan te denken de 2X gadolinium-sensoroplossingen te verhitten tot 95 °C, gevolgd door langzame afkoeling tot kamertemperatuur voordat de gadoliniumionoplossing wordt toegevoegd.Begin met het oplossen van vaste gadoliniumtrichloride in assaybuffer om een gadolinium-3-stamoplossing van de gewenste concentratie te maken. Bereid middels seriële verdunning zes gadolinium-3-oplossingen van 100 µL voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Los daarna het te testen contrastmiddel op in assaybuffer.Gebruik seriële verdunning om drie verschillende concentraties te bereiden. Neem vervolgens de PCR-buisjes met de 2X gadolinium-sensoroplossing uit de thermocycler. Overbreng 50 µL van elke gadolinium-oplossing naar afzonderlijke PCR-buisjes.Pipette elke oplossing meerdere keren op en neer om te mengen. Breng vervolgens 50 µL van elke contrastmiddeloplossing afzonderlijk over naar de resterende PCR-buisjes. Meng door meerdere keren op en neer te pipetteren.Incubeer alle negen oplossingen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng daarna 45 µL van elke oplossing in dubblo over naar een 384-wells plaat. Registreer en analyseer vervolgens de fluorescentiegegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.In deze studie wordt niet-gecheleerd trivalent gadolinium-ion in waterige oplossing gedetecteerd met behulp van een fluorescentiegebaseerde methode. De fluorescente sensor is ontwikkeld door een fluorofoor aan het aptameer te koppelen. De sensor wordt vervolgens gehybridiseerd met een quenching-streng, die is gelabeld met een dark quencher-molecuul.De toevoeging van gadolinium drie verdringt het quenching-streng uit het aptameer, wat leidt tot een toename van de fluorescentie-emissie. Kalibratiecurves worden verkregen met 100 nanomolar gadolinium-aptameer en 200 nanomolar QS en worden uitgezet als ruwe fluorescentie of als fluorescentie-vouwverandering. Beide curves vertonen een lineair bereik voor gadolinium drie-concentraties onder één micromolar en verzadiging van het signaal bij concentraties boven drie micromolar.Vervolgens worden twee verschillende batches gadoterzuur geanalyseerd op concentraties variërend van nul millimolar tot 20 millimolar. Hoewel de fluorescentie-emissie van het monster met hoge zuiverheid over dit bereik niet merkbaar toeneemt, wordt een significante verandering waargenomen in het monster dat niet-gecheleerd gadolinium drie bevat bij concentraties die zo laag zijn als vijf millimolar. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de wells van de microplaat zitten, aangezien dit de fluorescentiemeting zal beïnvloeden.Met deze procedure kunnen we mogelijk zelfs kleine hoeveelheden berekende gadoliniumionen detecteren in oplossingen die contrastmiddelen bevatten. Dit zal een goede methode zijn voor het bepalen van de zuiverheid van de middelen. Werken met chemicaliën kan gevaarlijk zijn en het nemen van voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, is belangrijk tijdens het uitvoeren van deze procedure.

an-aptamer-based-sensor-for-unchelated-gadolinium-iii

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We tonen de metalation, zuivering en karakterisering van lanthanide-complexen. De complexen hier beschreven kunnen worden geconjugeerd aan macromoleculen om het volgen van deze moleculen met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

Voorbereiding, Zuivering en karakterisering van lanthanide-complexen voor gebruik als contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging

MR kanker moleculaire beeldvorming aantonen met een kleine peptide gerichte MRI-contrastmiddel specifiek voor clotted plasma-eiwitten in tumor stroma in een muizen prostaatkanker model.

MR Molecular imaging van prostaatkanker met een kleine moleculaire CLT1 Peptide Gerichte contrastmiddel

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Dit protocol beschrijft de synthese van biofunctionele Pruisisch blauwe nanodeeltjes en hun gebruik als multimodale, moleculaire beeldvormingsmiddelen. De nanodeeltjes hebben een kern-schaal ontwerp waarbij gadolinium- of mangaanionen in de nanodeeltjekern MRI-contrast genereren. De biofunctionele schaal bevat fluoroforen voor fluorescentiebeeldvorming en targeting liganden voor moleculaire targeting.

Biofunctionalized Pruisisch blauw nanopartikels voor Multimodaal Molecular Imaging Toepassingen

AN MRI-compatibele maat ontworpen laser gebaseerde verwarmingsapparaten ontwikkeld plaatselijke verhitting van subcutane tumoren verschaffen om afgifte van stoffen uit warmte gevoelige liposomen activeert specifiek op het tumorgebied.

Maat ontworpen laser gebaseerde Verwarming Apparaten voor gestuurde release van cisplatine van temperatuurgevoelige liposomen met Magnetic Resonance Image Guidance

Het ontwerpen en ontwikkelen van een aptameer-gouden nanodeeltjes colorimetrische assay voor de detectie van kleine moleculen in-het-veld toepassingen onderzocht. Bovendien, een smart-inrichting colorimetrische applicatie (app) werd gevalideerd en langdurige opslag van de test werd voor gebruik in het veld.

Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications

Een procedure voor de isolatie van EOB-DTPA en daaropvolgende complexering met natuurlijke Ga (III) en 68Ga wordt hierin voorgesteld, alsmede een grondige analyse van verbindingen en onderzoek op labelingsefficiëntie in vitro stabiliteit en n- octanol / water verdelingscoëfficiënt van het radiogelabelde complex.

Onderzoek naar het Georgia (III) Complex van EOB-DTPA en haar<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radioactief gemerkt Analogue

Dit protocol beschrijft de bereiding en karakterisering van een dendrimere magnetische resonantie imaging (MRI) contrastmiddel dat cyclen gebaseerde macrocyclische chelaten coördinerende paramagnetische gadolinium-ionen draagt. In een serie MRI-experimenten in vitro, deze agent produceerde een versterkte MRI signaal in vergelijking met de commercieel beschikbare monomere analoog.

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van-dendrimeer gebaseerde Contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Hier presenteren we een protocol te verkrijgen68Ga ijzeroxide core-doped nanodeeltjes via snel magnetron-gedreven synthese. De methodologie maakt PET / (T-1) MRI nanodeeltjes met radiolabeling efficiëntie hoger dan 90% en radiochemische zuiverheid van 99% in een 20-min-synthese.

Synthese van 68Ga ijzeroxide Core-doped nanodeeltjes voor Dual Positron emissie tomografie / (T-1) magnetische resonantie Imaging

Dit onderzoek beschrijft het geautomatiseerde proces voor de productie van [68Ga]Ga-3BP-3940 met de GAIA V2-synthesizer, voor PET-beeldvorming van fibroblastactiveringseiwit. Ook worden de resultaten gepresenteerd van kwaliteitscontroletests die zijn uitgevoerd op drie testbatches.

Geautomatiseerde bereiding van [68Ga]Ga-3BP-3940 op een synthesemodule voor PET-beeldvorming van de tumormicro-omgeving

Leer een fluorescente aptameersensor voor het detecteren van ongechelateerd gadolinium(III) in MRI-contrastmiddelen. Deze methode biedt hoge gevoeligheid en selectiviteit voor toxische ionen.

An-aptameergebaseerde Sensor voor Unchelated Gadolinium (III)

Meer video's verkennen