An-aptameergebaseerde Sensor voor Unchelated Gadolinium (III)
9 januari 2017
Het gebruik van polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) moleculen voor het detecteren van ongecheleerd gadolinium(III) ion in een waterige oplossing wordt beschreven. De aanwezigheid van het ion wordt gedetecteerd via een toename in de fluorescentie-emissie van de sensor.
Het algemene doel van deze fluorescentie-gebaseerde assay is om de aanwezigheid van toxisch niet-gecheleerd gadoliniumion in waterige oplossingen die contrastmiddelen voor magnetische resonantie bevatten, te detecteren. Deze methode kan helpen bij het faciliteren van de gadolinium-gebaseerde MRI-contrastmiddelen door een middel te bieden om een hoge pariteit van gesynthetiseerde middelen te garanderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in staat is om submicromolaire concentraties van niet-gecheleerd toxisch gadolinium te detecteren met relatief hoge selectiviteit ten opzichte van andere biologische metaalkationen.
Om deze procedure te starten, bereidt u de assaybuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Pas de pH aan met behulp van natriumhydroxide en zoutzuur tot 7,4. Filtreer vervolgens de buffer door een steriele wegwerp fles-topfilter met een 0,2 micron PES membraan.
Breng vervolgens 497 microliter van de assaybuffer over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg een microliter van de bereide gadolinium aptamer stockoplossing en twee microliter van de bereide QS stockoplossing toe. Breng 50 microliter van deze 2X Gadolinium sensoroplossing over naar elk van de negen PCR buisjes.
Plaats vervolgens de buisjes in een thermische cycler. Stel de thermische cycler in om de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius te verwarmen, en koel de oplossingen vervolgens geleidelijk af tot 25 graden Celsius gedurende 15 minuten. Het is belangrijk om te onthouden dat de 2X gadolinium sensoroplossingen tot 95 graden moeten worden verwarmd, gevolgd door langzaam afkoelen tot kamertemperatuur voordat de gadolinium ionoplossing wordt toegevoegd.
Om te beginnen, lost u vast gadoliniumtrichloride op in assaybuffer om een gadolinium drie stockoplossing van de gewenste concentratie te maken. Bereid met behulp van seriële verdunning zes 100 microliter gadolinium drie oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Los vervolgens het te testen contrastmiddel op in assaybuffer.
Gebruik seriële verdunning om drie verschillende concentraties te bereiden. Vervolgens verwijdert u de PCR buisjes met de 2X gadolinium sensoroplossing uit de thermische cycler. Breng 50 microliter van elke gadolinium drie oplossing over naar aparte PCR buisjes.
Pipetteer elke oplossing meerdere keren op en neer om te mengen. Breng vervolgens 50 microliter van elke contrastmiddeloplossing afzonderlijk over naar de resterende PCR buisjes. Meng door meerdere keren op en neer te pipetteren.
Incubeer alle negen oplossingen gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Breng vervolgens 45 microliter van elke oplossing over naar een 384-wellsplaat in duplicaten. Neem vervolgens fluorescentiegegevens op en analyseer deze zoals beschreven in het tekstprotocol.
In deze studie wordt niet-gecheleerd trivalent gadoliniumion in waterige oplossing gedetecteerd met behulp van een fluorescentie-gebaseerde methode. De fluorescente sensor wordt ontwikkeld door een fluorfore aan de aptamer te bevestigen. De sensor wordt vervolgens gehybridiseerd met een quenching streng, die is gelabeld met een donkere quencher molecuul.
De toevoeging van gadolinium drie verplaatst de quenching streng van de aptamer, waardoor een toename in fluorescentie emissie ontstaat. Kalibratiecurven worden verkregen met behulp van 100 nanomolaire gadolinium aptamer en 200 nanomolaire QS en worden geplot als ruwe fluorescentie of fluorescentievoudverschil. Beide curven laten een lineair bereik zien voor gadolinium drie concentraties onder de één micromolaire en verzadiging van het signaal bij concentraties boven de drie micromolaire.
Twee verschillende batches van gadoteric zuur worden vervolgens geanalyseerd voor concentraties variërend van nul millimolair tot 20 millimolair. Hoewel de fluorescentie emissie van het hoogzuiverheidsmonster niet merkbaar toeneemt over dit bereik, wordt een significante verandering waargenomen in het monster dat niet-gecheleerd gadolinium drie bevat bij concentraties zo laag als vijf millimolair. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen luchtbelletjes in de wells van de microplaat zitten, omdat dit de fluorescentiemeting zal beïnvloeden.
Met behulp van deze procedure kunnen we mogelijk zelfs kleine hoeveelheden berekende gadoliniumionen detecteren in oplossingen die contrastmiddelen bevatten. Dit zal een goede methode zijn om de zuiverheid van de middelen te bepalen. Het werken met chemicaliën kan gevaarlijk zijn en het is belangrijk om voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een fluorescentie-gebaseerde assay voor het detecteren van toxische ongecheleerde gadolinium(III)-ionen in waterige oplossingen. De methode maakt gebruik van polydeoxynucleotide-moleculen (44-mer aptameer), die een verhoogde fluorescentie-emissie vertonen in de aanwezigheid van gadolinium-ionen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Analytische chemie
Achtergrond
- Gadolinium(III)-ionen worden gebruikt in MRI-contrastmiddelen.
- Niet-gecheleerde gadoliniumionen kunnen toxisch zijn in biologische systemen.
- Fluorescentie-assays bieden een gevoelige detectiemethode.
- Hoge selectiviteit is cruciaal voor het onderscheiden van gadolinium van andere metaalkationen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare assay te ontwikkelen voor het detecteren van niet-gecheleerde gadoliniumionen.
- Om de veiligheid van MRI-contrastmiddelen op basis van gadolinium te waarborgen.
- Om detectie bij submicromolaire concentraties te bereiken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van assaybuffer met pH-aanpassing naar 7.4.
- Filtratie van de buffer door een steriel filter.
- Gebruik van polydeoxynucleotide-aptameren voor detectie.
- Meting van veranderingen in fluorescentie-emissie bij aanwezigheid van gadoliniumionen.
Belangrijkste Resultaten
- De assay detecteert gadoliniumionen succesvol bij lage concentraties.
- Er werd een hoge selectiviteit bereikt ten opzichte van andere biologische metaalkationen.
- De fluorescentie-emissie nam significant toe in de aanwezigheid van gadolinium.
- De methode kan de veiligheid bij het gebruik van MRI-contrastmiddelen verbeteren.
Conclusies
- Deze op fluorescentie gebaseerde assay is effectief voor het monitoren van gadoliniumionconcentraties.
- Het biedt een methode om de kwaliteit van gadoliniumhoudende middelen te waarborgen.
- Toekomstige toepassingen kunnen een bredere milieu- en biologische monitoring omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De detectie van niet-gecheleerde gadolinium(III)-ionen is essentieel voor het waarborgen van de veiligheid en kwaliteit van gadoliniumhoudende MRI-contrastmiddelen die in de klinische diagnostiek worden gebruikt. Deze op aptameren gebaseerde fluorescentiesensor maakt submicromolaire detectie van toxisch Gd³⁺ in een waterige buffer mogelijk, wat de vroege fase van assay-ontwikkeling voor zuiverheidstesten van contrastmiddelen ondersteunt. De methode biedt een selectieve, reproduceerbare uitlezing die helpt bij het mechanistisch minimaliseren van risico's tijdens de identificatie van lead-compounds en preklinische screenings van formuleringen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de stabiliteit van gadolinium-chelaten en de efficiëntie van ligandbinding bij de ontwikkeling van contrastmiddelen mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van chelatiemechanismen door het detecteren van dissociatieproducten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen voor het beoordelen van de zuiverheid van contrastmiddelen over seriële verdunningen.
- Operationele waarde: Compatibel met 384-well microplaatformaten, wat high-throughput screening van batches contrastmiddelen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Demonstreert selectiviteit ten opzichte van fysiologische ionen (Na⁺, K⁺, Ca²⁺), waardoor vals-positieven in complexe matrices worden verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevante methode voor het monitoren van gadoliniumvrijgave onder gesimuleerde biologische omstandigheden.
- Operationele waarde: Ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door het kwantificeren van residuele niet-gecheleerde Gd³⁺ tijdens screening van formuleringen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege screening van contrastmiddelen tot preklinische veiligheidsevaluatie, waarbij de detectie van residuele metaalionen bijdraagt aan de optimalisatie van de formulering en aan go/no-go-beslissingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van chelaatstabiliteit en de sterkte van ligand-ioninteracties in waterige omgevingen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid mogelijk voor batch-tot-batchvergelijking van de zuiverheid van contrastmiddelen.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (fluorescentie-vouwwijziging) die vergelijking van Gd³⁺-concentraties tussen monsters mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door biologische omstandigheden te simuleren waarin gadoliniumdissociatie kan optreden.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een herbruikbare analytische capaciteit voor kwaliteitscontrole bij de productie van contrastmiddelen en stabiliteitstests.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de veiligheid van contrastmiddelen door toxisch Gd³⁺ op nanomolaire niveaus te detecteren.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie en reproduceerbaarheid door buffer-gestuurde, pH-gestabiliseerde fluorescentiemetingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door batches met residueel ongecheleerd gadolinium te identificeren vóór de preklinische vrijgave.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van contrastmiddelkandidaten mogelijk op basis van chelatie-efficiëntie en retentie van metaalionen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met nucleïnezuren, aptameerhybridisatie en fluorescentiedetectie.
- Afhankelijk van thermische cyclusequipment voor het annexeren van de aptameer-quenchingstrand en microplaatlezers voor fluorescentiekwantificering.
- Vereist cross-team standaardisatie van bufferbereiding, pH-aanpassing en filtratieprotocollen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar andere lanthanoïden vanwege gedeeltelijke kruisreactiviteit met Eu³⁺ en Tb³⁺.
- Beperkt door het gebrek aan absolute specificiteit voor Gd³⁺ ten opzichte van andere trivalent lanthanoïden, wat orthogonale bevestiging in complexe monsters vereist.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
4:33
Conclusion
0:36
Preparation of Aptamer Stock Solutions and 2x Gd-sensor Solution
1:52
Constructing the Fluorescence Calibration Curve and Detecting the Presence of Unchelated Gd3+ in a Solution of Gd Contrast Agent
3:15
Results: Changes in the Fluorescence Emission of the Aptamer-based Sensor in the Presence of Gadolinium(III)
