Name: Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer hoe je Notch-signalering stimuleert in muizenosteoclastvoorlopers om de rol bij celdifferentiatie te onderzoeken. Deze methode biedt inzicht in celbiologische processen en is aanpasbaar voor andere celtypen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), een subsidie van de AO Foundation (S-16-12A), het Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center en een intramuraal orthopedisch chirurgisch afdelingsonderzoeksontwikkelingsfonds. JWA wordt ondersteund door de University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship, gefinancierd door de National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).

Al het onderzoek met gewervelde dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd. 1. Cultuur Mediavoorbereiding <ol><li> Bereid α-MEM door oplossen minimaal essentieel medium (MEM) poeder en 1,9 g natriumbicarbonaat in 900 ml H2O en aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 100 ml warmte- geïnactiveerd foetaal runderserum. Steriliseren met behulp van een 0,22 pm polyethersulfon (PES) filter. </li><li> Bereid macrofaag medium door aanvulling α-MEM met 35 ng / ml recombinant muis macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) </li><li> Bereid osteoclast medium door aanvulling macrofagen medium met 100 ng / ml RANKL </li></ol> 2. Bone Marrow Cell Isolation <ol><li> Vul een 10 ml spuit met een 25⅝ naald per muis met 10 ml α-MEM. </li&gt; <li> Euthanaseren muizen via 10 min blootstelling aan CO 2 bij een stroomsnelheid van 1,3 l / min. Zorg ervoor dat dier dood door volgende CO 2 blootstelling met cervicale dislocatie alvorens met dissectie. </li><li> Met behulp van schone techniek, ontleden en scheiden de tibiae en dijbenen. Desinfecteren muizenhuid met 70% ethanol alvorens een snede langs het voorste oppervlak van elke achterpoot van de tibia en femur bloot. <ol><li> Knip het kniegewricht vrij het distale einde van de femur en dwars door de femur zo dicht mogelijk bij het bekken mogelijk. Dijbeen verwijderen en reinigen zoveel zacht weefsel mogelijk. Om de tibia, dwars door de enkel te verwijderen en verwijder zoveel zacht weefsel mogelijk te maken. </li></ol></li><li> Houd het been met een tang en spoel merg in een 15 ml conische buis met 2,5 ml kamertemperatuur α-MEM combineren merg flushes van een enkele muis in een enkele buis. LET OP: Een succesvolle merg flush zal de kleur van t te veranderenHij bot van rood tot beige. </li><li> Laat puin om zich te vestigen op de bodem van de buis en overdragen supernatant naar een schone 15 ml conische buis verzorgen om te voorkomen dat de overdracht van alle vuil. OPMERKING: Sommige cellen kunnen zich ook af met het merg puin. Als een groter aantal cellen vereist, kan beenmerg flushes worden gefiltreerd door een 70 um cel zeef in een schone 15 ml buis. </li><li> Centrifugebuis (s) bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. </li><li> Vacuüm zuig het supernatant en resuspendeer celpellet in 0,5 ml ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten om rode bloedcellen te lyseren. </li><li> Voeg 10 ml PBS direct ACK-celoplossing en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. NB: De eerder rode celpellet moet nu beige zijn. </li><li> Vacuüm aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml α-MEM, en de plaat in een 100 mm weefselkweek behandelde schotel. Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C in een bevochtigdeweefselkweek incubator. OPMERKING: Tellen cellen is niet noodzakelijk deze stap. Gedurende deze tijd zullen hechtende cellen uit het beenmerg hechten aan het cultuur oppervlak; niet-hechtende beenmerg celpopulaties zullen blijven zweven. MCSF niet in het kweekmedium gedurende deze eerste incubatie. </li></ol> 3. Verrijking van osteoclastvoorlopers <ol><li> Na overnacht incubatie van merg flushes, overdracht kweeksupernatant met niet-hechtende cellen aan een 50 ml conische buis. OPMERKING: kweekschalen met hechtende cellen, die beenmerg mesenchymale stamcellen omvatten, kunnen worden weggegooid of gevoed met verse α-MEM desgewenst andere experimenten. OPMERKING: Osteoclasten kunnen direct door deze niet-hechtende beenmergcellen worden onderscheiden door uitplaten ze in weefselkweek behandelde gerechten in een dichtheid van 4 x 10 5 cellen / cm2 in osteoclast medium en verfrissende medium om de dag gedurende 5 dagen. </li&gt; <li> Add α-MEM niet-hechtende cellen oplossing tot een eindvolume van 18 ml en voeg M-CSF tot een eindconcentratie van 35 ng / ml. </li><li> Voeg 3 ml celsuspensie elk 6 60 mm kweekschalen suspensie. </li><li> Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C in een bevochtigde weefselcultuur incubator. Gedurende deze tijd zullen M-CSF differentiatie van macrofagen, die zich ook door een niet-weefselkweek behandelde oppervlakken stimuleren. </li><li> Na incubatie gedurende de nacht, re-voeding osteoclastvoorlopers met 3 ml vers macrofaag medium. Dit biedt niet-hechtende cellen die geen gedifferentieerd tot macrofagen verwijderen. </li><li> Blijf cultuur osteoclastvoorlopers bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 dagen of totdat kweken bereikt ongeveer 70% confluentie. </li></ol> 4. differentiatie van osteoclasten <ol><li> Was osteoclastvoorlopers met 5 ml PBS en behandelen cellen met 1 ml marine-oorsprong proteolytische / collagenolytische enzym bij kamertemperatuur totdat de cells kan worden losgemaakt door zachtjes te tikken van de plaat. OPMERKING: osteoclastvoorlopers kan alleen worden opgeheven indien ze worden gekweekt in suspensie schotels; precursors hechten ook stevig aan weefselkweek behandelde oppervlakken worden opgeheven. Trypsine kan osteoclastvoorlopers activeren en moet worden vermeden. </li><li> Voeg 4 ml α-MEM elk gerecht en overdracht cellen om een ​​50 ml conische buis. Aantal cellen met een hemocytometer en verdun cellen tot een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / ml en voeg M-CSF tot een eindconcentratie van 35 ng / ml en RANKL tot een eindconcentratie van 100 ng / ml. </li><li> Zaadcellen bij een dichtheid van 2,6 x 10 4 cellen / cm2 in weefselkweek behandelde platen en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 2 dagen. Differentiatie wordt kenmerkend uitgevoerd in 24-well platen, waarbij 5 x 10 4 cellen gezaaid in elk putje uitgevoerd. </li><li> 2 dagen na het begin van de differentiatie, opnieuw voer cellen door vervangen medium met 1 ml verse osteocvorig medium. OPMERKING: osteoclastdifferentiatie gewoonlijk voltooid binnen 3 dagen. Resulterende osteoclasten kan TRAP-gekleurd voor eenvoudige kwantificering en morfologische analyse. </li></ol> 5. Continu Stimulatie van Notch Signalering met Jagged1-gecoate oppervlak <ol><li> Suspendeer geit anti-humaan IgG Fc antilichaam in PBS bij een concentratie van 10 ug / ml (1: 1000 verdunning van 10 mg / ml voorraad). Voeg antilichaamoplossing aan kweekoppervlak in een dichtheid van 1,3 gg / cm 2 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bij 24-well platen, voeg 250 pl (2,5 pg) per putje. </li><li> Vacuüm aspireren putten en opnieuw vullen met 1 ml PBS. Herhaal deze stap 2 keer. </li><li> Suspendeer recombinant Jagged1-Fc fusie-eiwit in PBS bij een concentratie van 10 ug / ml. Add Jagged1 FC-oplossing voor de met antilichaam beklede kweekoppervlak met een dichtheid van 1,3 gg / cm 2 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Cultuur oppervlakken bekleed met antilichaam only kan worden gebruikt als controles. </li><li> Vacuüm aspireren putten en opnieuw vullen met 1 ml PBS. Herhaal deze stap 2 keer. Houd PBS in putten tot vlak voor het zaaien cel om te voorkomen dat ze uitdrogen. </li><li> Seed 2,6 x 10 4 osteoclastvoorlopers / cm2 op gecoate oppervlakken. Notch signalering continu gestimuleerd minstens 3 dagen. </li></ol> 6. Tijdelijke Stimulatie van Notch Signalering met Jagged1-gecoate Beads <ol><li> Combineer de volgende in een geschikt formaat buis: 0,5 gg / cm 2 Jagged1-Fc, 21 gl / cm 2 proteïne G agarose korrels en PBS tot een eindvolume van 1,5 ml. Om een ​​voldoende aantal Jagged1 korrels bereiden 1 putje van een 24 putjesplaat Combineer 1 ug Fc-Jagged1, 40 ul proteïne G agarose korrels en PBS tot 1,5 ml. </li><li> Incubeer buis met rotatie bij 4 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Centrifugebuis bij 300 xg gedurende 1 min tot pellet kralen. Resuspendeer kralen in 1,5 ml PBS. Herhaal deze wash2 keer. </li><li> Resuspendeer Jagged1 kralen in 130 ul / cm2 kweekmedium en gelden voor gekweekte cellen. </li><li> Incubeer cellen met kralen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de gewenste periode. Verwijder kralen met verschillende wasbeurten van PBS of het kweekmedium. </li><li> Controleer Notch signalering activering via meting van Notch target-gen transcripties 10. </li></ol>

<ol><li>Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in development and disease.</a> Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).</li>
<li>Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+simplicity+in+design%2C+versatility+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: simplicity in design, versatility in function.</a> Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).</li>
<li>Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+ligand+endocytosis+generates+mechanical+pulling+force+dependent+on+dynamin%2C+epsins%2C+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin.</a> Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).</li>
<li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+Single+Molecular+Forces+Required+for+Notch+Activation+Using+Nano+Yoyo%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo.</a> Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).</li>
<li>Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+receptor-ligand+binding+and+activation%3A+insights+from+molecular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies.</a> Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).</li>
<li>Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Jagged-1+is+able+to+inhibit+the+function+of+its+multivalent+form+to+induce+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+a+surrogate+in+vitro+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).</li>
<li>Small, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Jagged+1+represses+the+function+of+its+transmembrane+form+to+induce+the+formation+of+the+Src-dependent+chord-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).</li>
<li>Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+notch+signaling+by+immobilization+of+jagged-1+on+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers.</a> Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).</li>
<li>Varnum-Finney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+ligand%2C+Jagged-1%2C+influences+the+development+of+primitive+hematopoietic+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells.</a> Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).</li>
<li>Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCdelta+is+required+for+Jagged-1+induction+of+human+mesenchymal+stem+cell+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation.</a> Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+radiation+on+the+Notch+signaling+pathway+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts.</a> Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).</li>
<li>Urs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+soluble+Jagged1-mediated+inhibition+of+Notch+signaling+on+proliferation+and+differentiation+of+an+adipocyte+progenitor+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model.</a> Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).</li>
<li>LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1-STAT3-ETBR+signaling+axis+controls+reactive+astrocyte+proliferation+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).</li>
<li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+gene+related+to+anergy+in+lymphocytes+is+associated+with+Notch-mediated+human+T+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression.</a> J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%3A+what+do+they+do+and+how+do+they+do+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts: what do they do and how do they do it?</a> Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+transcription+factor+RBP-J+results+in+osteopenia+attributable+to+attenuated+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation.</a> Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+regulates+osteoclastogenesis+directly+in+osteoclast+precursors+and+indirectly+via+osteoblast+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells.</a> J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).</li>
<li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+development+by+Notch+signaling+directed+to+osteoclast+precursors+and+through+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells.</a> Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).</li>
<li>Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+JAGGED1+promotes+osteolytic+bone+metastasis+of+breast+cancer+by+engaging+notch+signaling+in+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells.</a> Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).</li>
<li>Sekine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+osteoclastogenesis+by+Notch2%2FDelta-like+1+and+Notch1%2FJagged1+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes.</a> Arthritis Res Ther. 14 (2), R45(2012).</li>
<li>Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signaling+Promotes+Osteoclast+Maturation+and+Resorptive+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity.</a> J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).</li>
<li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+Notch2+and+NF-kappaB+accelerates+RANKL-induced+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis.</a> Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).</li>
<li>Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hajdu+Cheney+Mouse+Mutants+Exhibit+Osteopenia%2C+Increased+Osteoclastogenesis%2C+and+Bone+Resorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption.</a> J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Kritische stappen in het protocol Cultuur en in vitro differentiatie van osteoclastprecursors een nuttig platform voor onderzoek naar de moleculaire mechanismen van osteoclastogenese en de identificatie van therapeutische targets voor bot regeneratie en behoud van botmassa. Bij het kweken van muis osteoclastvoorlopers, de meest kritische element is het onderhoud van voorlopers in een naïeve staat. Als macrofaag-achtige cellen zijn osteoclastvoorlopers geprimed reactie op bacteriële bes...

Het zoogdier Notch signaling pathway homoloog dezelfde route in Drosophila melanogaster en bestaat uit vier transmembraan Notch receptoren (Notch1-4) en vijf membraangebonden liganden van de Jagged (JAG1 &amp; JAG2) en Delta-achtige (DLL1, 3, en 4) gezinnen 1. Notch signalering wordt gestart wanneer Notch receptor op een ontvangende cel door ligand is gebonden aan een zendende cel 2. Tijdens deze trans-activatie, de membraangebonden Notch ligand produceert een rekkracht op de membraangebonden Notch receptor 3, 4. De rekkracht van ligand binding induceert conformatieveranderingen in de Notch receptor die extracellulaire splitsing van de receptor vergemakkelijken door TNFa omzettend enzym (TACE), gevolgd door een intracellulaire splitsing gebeurtenis gemedieerd door een preseniline bevattende gamma-secretase complex (γ-secretase). γ-secretase releases de Notch intracellular domein (NiCd) die transloceert naar de kern waar het een complex met transcriptionele activatie CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), brein-achtige (MAML) en celtype-specifieke factoren heeft expressie van target genen 5. De mechanische elementen van Notch activatie leiden tot de noodzaak van unieke methoden Notch pathway activatie in vitro. Oplosbare Notch liganden binden aan receptoren Notch, maar niet de productie strekkrachten noodzakelijk NiCd afgifte terwijl tegelijkertijd de competitieve inhibitie van binding van cel-geassocieerd Notch ligands. Zo, de toevoeging van oplosbare Notch liganden aan kweekmedium kunnen normale Notch signalering 6, 7 verzwakken. Gelukkig kunnen Notch ligands NiCd afgifte veroorzaken als ze worden bevestigd aan een geschikt stijf substraat 5, 8, 9,10. Zaaien cellen op kweek-ligand gecoate substraten of toepassing-ligand gecoate kralen om cellen kunnen activeren zowel Notch signalering, en de keuze daartussen vooral afhankelijk van de gewenste timing van Notch stimulatie. Voor onmiddellijke, tijdelijke Notch activatie als gewenst zou zijn in het midden van een functionele assay of differentiatie, Notch ligand kan gebonden worden aan kralen, toegepast op gekweekte cellen agarose en uitgewassen op elk moment. Langduriger Notch signalering vanaf het begin van de kweekperiode, kan weefselkweekplaten worden bekleed met ligand voorafgaand aan zaaien van cellen. Voor de toepassing van dit protocol, worden werkwijzen uitgevoerd met muis osteoclastvoorlopers, maar de werkwijzen en variaties op de hier beschreven werkwijzen zijn toepasbaar op een breed scala aan celtypen 6, 11, 12, 13, </sup&gt; 14. Osteoclasten terminaal gedifferentieerde hematopoëtische afstamming, cellen die verantwoordelijk zijn voor de resorptie van botweefsel zijn, en ze zijn betrokken bij verschillende aandoeningen van botverlies 15. Dus in vitro onderzoek van de differentiatie van osteoclasten uit hun monocyt / macrofaag-lijn precursoren en de moleculaire mechanismen die de functie moet beter begrip van osteoclasten en de ontwikkeling van nieuw bot regenereren therapieën. Hoewel wordt nu algemeen aanvaard dat Notch een positieve rol bij de differentiatie en functie van osteoclasten speelt, variaties in zowel Notch stimulatie en osteoclast precursor cultuur en differentiatie tot oorspronkelijk tegenstrijdige bevindingen 16, 17, 18, 19. Nadere bestudering van de verschillen in methoden en het gebruik van genetischemodellen zijn sterk verduidelijkt de rol van Notch in osteoclasten, maar toepassing van gestandaardiseerde Notch stimulatie en kweekwerkwijzen kunnen dergelijke controversen in toekomstige studies van Notch in andere celtypes 20, 21, 22, 23 te voorkomen. Er zijn meerdere werkwijzen voor het kweken en differentiëren muis osteoclastvoorlopers, en zoals met uiteenlopende werkwijzen voor het stimuleren Notch signalering, de beste methode afhangen van de wetenschappelijke vraag. Hierin zal onze manier van kweken van hechtende en niet-hechtende fracties van beenmerg cellen gespoeld uit muizen lange beenderen voorkeur worden gepresenteerd. Deze werkwijze heeft het voordeel van in wezen waarvoor geen gespecialiseerde uitrusting en cellen die van toepassing zijn op verschillende differentiatiemethoden zijn.

<table><tbody><tr><td>Recombinant mouse M-CSF</td><td>Biolegend</td><td>576402</td><td>Beschikbaar bij meerdere leveranciers, test activiteit voor experimenten</td></tr><tr><td>Recombinant mouse RANKL</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>200-04</td><td>Beschikbaar bij meerdere leveranciers, test activiteit voor experimenten</td></tr><tr><td>Recombinant human Jagged1-Fc</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1277-JG-050</td><td>Beschikbaar bij meerdere leveranciers, test activiteit voor experimenten</td></tr><tr><td>Protein G agarose beads</td><td>InvivoGen</td><td>gel-agg-2</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgG Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-001-008</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>Accutase cell dissociation reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Gebaat om osteoclast voorlopers te verwijderen</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>Gebaat om gedifferentieerde osteoclasten te kleuren</td></tr></tbody></table>

stimulatie van notch signalering in mouse osteoclastvoorlopers

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch-signalering is een sleutelcomponent van meerdere fysiologische en pathologische processen. De aard van Notch-signalering maakt echter in vitro onderzoek naar zijn variabele en soms tegenstrijdige rollen een uitdaging. Als onderdeel van directe cel-cel communicatie met zowel receptoren als liganden gebonden aan het plasmamembraan, kan Notch-signalering niet in vitro worden geactiveerd door eenvoudige toevoeging van liganden aan het kweekmedium, zoals mogelijk is met veel andere signaalroutes. In plaats daarvan moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand.
Variaties in methoden voor Notch-signalering activering kunnen tot verschillende resultaten leiden in gekweekte cellen. In osteoclast-precursoren in het bijzonder hebben verschillen in methoden van Notch-stimulatie en osteoclast-precursor kweek en differentiatie geleid tot onenigheid over of Notch-signalering een positieve of negatieve regulator van osteoclast-differentiatie is. Hoewel nadere vergelijkingen van osteoclast-differentiatie onder verschillende Notch-stimulatiecondities in vitro en genetische modellen de controverse over Notch-signalering en osteoclasten grotendeels hebben opgelost, zouden gestandaardiseerde methoden voor continue en tijdelijke stimulatie van Notch-signalering in gekweekte cellen dergelijke discrepanties in de toekomst kunnen voorkomen.
Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stimuleren van Notch-signalering specifiek in gekweekte muis osteoclast-precursoren, hoewel deze methoden toepasbaar zouden moeten zijn op elk adherant celtype met kleine aanpassingen. De eerste methode produceert continue stimulatie van Notch-signalering en omvat het immobiliseren van Notch-ligand op een weefselkweekoppervlak voorafgaand aan het zaaien van cellen. De tweede, die Notch-ligand gebruikt dat gebonden is aan agarose-kralen, maakt tijdelijke stimulatie van Notch-signalering mogelijk in cellen die al gehecht zijn aan een kweekoppervlak. Dit protocol omvat ook methoden voor het detecteren van Notch-activatie in osteoclast-precursoren evenals representatieve transcriptionele markers van Notch-signalering activering.

Het doel van deze methode is de cultuur en stimuleren Notch signalering bij osteoclastvoorlopers. Wanneer behoorlijk beschaafd, osteoclastvoorlopers vertonen vooral een langgerekte spoelvormige morfologie met gladde cytoplasma (Figuur 1A). Zorg moet worden genomen om immunologische activatie van de osteoclastprecursors voorkomen. Na activering voorlopers verspreiden en afgevlakt met schuimende cytoplasma (Figuur 1B). Deze &quot;gebakken ei&quot; cellen z...

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van de stimulering van notch-signalering op verschillende momenten tijdens het differentiatieproces van osteoclasten te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiologie, zoals: Hoe verandert de rol van notch-signalering tijdens een cellulair proces? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de marginaliteit, waardoor deze kan worden aangepast aan andere cellen of notch-liganden.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de differentiatie van osteoclasten, kan deze ook worden toegepast op andere processen zoals celoverleving, proliferatie of de differentiatie van andere celtypen. Begin de procedure door een muis in rugligging te fixeren en de huid te desinfecteren met 70 procent ethanol. Maak vervolgens een incisie langs het anterieure oppervlak van één achterpoot om het scheenbeen en het dijbeen bloot te leggen.Vervolgens wordt er een incisie door het kniegewricht gemaakt om het distale uiteinde van het femur vrij te maken. Verwijder het femur door het uiteinde van het bot vlakbij het bekken door te snijden en verwijder al het aanhechtende zachte weefsel. Snijd door de e

stimulation-of-notch-signaling-in-mouse-osteoclast-precursors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De differentiatie van precursorcellen in osteoclasten wordt gereguleerd door cytokinen en groeifactoren. Hier worden een nieuwe genoverdrachtstechniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweekprotocollen voor het differentiëren van precursorcellen in osteoclasten in vitro beschreven als een methode om de effecten van cytokinen op osteoclastogenese te bestuderen.

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.

Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van induceerbare osteoblast-lijnspecifieke  Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en beschrijft methoden voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens orthodontische tandbeweging, waardoor licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.

Gebruik van induceerbare osteoblastische afstammingsspecifieke Stat3 knock-outmuizen om alveolaire botremodellering te bestuderen tijdens orthodontische tandbeweging

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het beenmergletselmodel bij muizen is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van postnatale osteogenese door middel van intramembraneuze ossificatie. Dit vereenvoudigde chirurgische protocol beschrijft de beenmergablatieprocedure voor stroomafwaartse beoordeling van nieuwe botvorming en cellulaire reacties na verwonding.

Verbeterde methodologie voor het bestuderen van postnatale osteogenese via intramembraneuze ossificatie in een beenmergletselmodel bij muizen

Dit artikel beschrijft in vivo en in vitro methodologie om de thymische vestigingsprogenitors te karakteriseren door de analyse van de kinetiek van generatie, fenotype en aantallen van hun T-cel nakomelingen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Leer hoe je Notch-signalering stimuleert in muizenosteoclastvoorlopers om de rol bij celdifferentiatie te onderzoeken. Deze methode biedt inzicht in celbiologische processen en is aanpasbaar voor andere celtypen.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Meer video's verkennen