Analyse van Chromosoom Segregatie, Histon Acetylatie, En Spindel Morfologie In Paard Oocyten
11 mei 2017
Dit manuscript beschrijft een experimentele aanpak om paardocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren. Specifiek illustreert het onderhavige werk hoe u onrijpe en volwassen paardocyten verzamelt door middel van ultrageluidgeleide ovumopname (OPU) en hoe u chromosoom-segregatie, spindemorfologie, globale histonacetylering en mRNA-expressie kunt onderzoeken.
De algemene doelen van deze experimentele aanpak zijn, ten eerste, om paarden eicellen morfologisch en biochemisch te karakteriseren en, ten tweede, om gameten van hetzelfde dier te vergelijken die in vitro of in vivo zijn verwerkt. Deze experimentele aanpak kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de oöcytbiologie en vruchtbaarheid bij monovularische soorten. Het kan ook de veiligheid van gameetmanipulatieprocedures verbeteren.
Deze aanpak werd ontwikkeld om de beperkte beschikbaarheid van eicellen te overwinnen, vooral van monovularische soorten. Het demonstreren van de OPU-procedures zal worden gedaan door Professor Stefan Deleuze van de Universiteit van Luik, Cecile Douet, de labmanager van mijn lab, en Fabrice Reigner, de manager van de paardeneenheid bij het INRA Centre Val de Loire. Dagelijks beoordeelt u de diameter van de ovariële follikels in een cohort van volwassen merries met behulp van echografie.
Zoek een groot follikel met een diameter groter dan 33 millimeter. Zodra gevonden, bereid u voor om 1.500 eenheden humaan choriongonadotrofine te injecteren om de rijping van de oöcyt in een dominant follikel te induceren. Vervolgens zoekt u de halsgroef en veegt u de injectieplaats af met alcohol.
Vervolgens, om de ader te laten stijgen, brengt u enige kracht aan twee of drie centimeter onder de injectieplaats. Breng de naald bijna parallel aan de nek in, zuigt u lichtjes om er zeker van te zijn dat de naald in de ader zit en injecteert u het hormoon. Bereid een echografiesonde voor voor vaginale toegang.
Verbind vervolgens de naald met een zuigsysteem. 35 uur na de hCG-injectie, zet u de instrumentatie voor OPU in en sedateer u de merrie. Goede pijnbestrijding is uiterst belangrijk voor de veiligheid van het dier en de operator.
Een dier dat geen pijn of ongemak voelt, zal manipulatie van de eierstok mogelijk maken, waardoor puncties en spoelingen gemakkelijker te uitvoeren zijn. Zodra de naaldsonde is ingebracht, moet één operator de eierstok manipuleren om het richting de sonde te draaien terwijl de andere operator de naald manipuleert. Lokaliseer het dominante follikel in de echografisch beeld.
Gebruik vervolgens de naald om de vaginale wand en de wand van het dominante follikel te doorboren. Zodra de follikelruimte is bereikt, aspireer u het folliculaire vocht. Draai de naald om de follikelwand te schrapen en het cumulus-oöcytcomplex te hechten.
Pomp vervolgens het vocht in een grote petrischaal. En zoek onder een stereomicroscoop naar de COC. Ondertussen spoelt u het follikel uit met warm Dulbecco's gemodificeerd PBS dat heparine bevat.
Het kan enkele spoelingen duren om de COC te verzamelen. Nadat de COC is gevonden, vervangt u de naald door een naald met twee lumen en verzamelt u de onrijpe COC's uit alle follikels met een diameter tussen de vijf en 25 millimeter. Deze worden gebruikt voor in vitro rijping.
Zodra alle follikels van een eierstok zijn afgezogen, herhaalt u dezelfde procedures om de onrijpe COC's uit de andere eierstok te verzamelen. Kies nu tussen de COC's. Bewaar alleen COC's met verschillende complete lagen van cumuluscellen en een bruine, fijnkorrelige ooplasm.
Gooi de andere weg. Aan het einde van de procedure injecteert u de merrie met 15.000 eenheden benzylpenicilline om infectie te voorkomen. Houd de merrie vervolgens minimaal twee uur in een rustige, schone stal terwijl ze herstelt.
Voordat de OPU begint, verwarmt u een fles aangevuld HEPES-gebufferd TCM-199 tot 37 graden Celsius. Bereid vervolgens het IVM-medium voor. Verdeel 500 microliters aangevuld natriumbicarbonaat-gebufferd TCM-199 in de putjes van een vierputtenplaatje.
Vervolgens incubeert u de plaat bij 38,5 graden Celsius gedurende minimaal twee uur. Breng de herstelde onrijpe COC's over naar een 3,5 centimeter-schaal gevuld met twee milliliter van het verwarmde HEPES TCM-199. Verplaats de COC's door verschillende regio's van de schaal om zachtjes omringende puinhopen weg te wassen.
Breng nu de COC's over naar het IVM-medium en incubeer ze gedurende 28 uur bij 38,5 graden Celsius. Om een chromosoomtelling uit te voeren op volwassen COC's, incubeert u ze gedurende een uur in 100-micromolar monastrol bij 38,5 graden Celsius. Verwijder vervolgens de cumuluscellen door de COC's te behandelen met 0,5% hyaluronidase in HEPES-gebufferd TCM-199.
Bewaak deze reactie op een verwarmd stadium ingesteld op 38 graden Celsius. Binnen ongeveer vijf minuten verwijdert u alle cellen. Gebruik voorzichtig pipetteren om de laatste paar hardnekkige cellen te verwijderen.
Verwijder vervolgens de zona pellucida met behulp van 0,2% pronase in HEPES-gebufferd TCM-199. Bewaak deze reactie ook op een verwarmd stadium. Het zou ongeveer vijf minuten moeten duren om te voltooien.
Bevestig vervolgens de oöcyten in 4% paraformaldehyd in DPBS gedurende 15 minuten bij 38,5 graden Celsius, gevolgd door nog eens 45 minuten fixatie bij vier graden Celsius. Na de fixatie wast u de oöcyten door ze achtereenvolgens over te brengen tussen drie putjes van 0,1% polyvinylalcohol in DPBS. Gebruik ongeveer een halve milliliter oplossing per putje.
Breng vervolgens de oöcyten over naar een putje gevuld met 0,3% Triton X-100 in PBS en laat ze 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Om niet-specifieke signalen te blokkeren, badt u de cellen in DPBS met 1% BSA en 10% normaal ezelsserum. Incubeer de cellen gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur.
Na 30 minuten, brengt u het primaire antilichaam aan en incubeert u de cellen bij vier graden Celsius gedurende de nacht. De volgende dag wast u de oöcyten en brengt u het secundaire antilichaam aan gedurende een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen lichtblootstelling. Na het aanbrengen van het secundaire, wast u de oöcyten opnieuw.</
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript presenteert een experimentele benadering om paardenoocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren. Het beschrijft in detail het verzamelen van onrijpe en rijpe paardenoocyten middels echogeleide ovum pick-up (OPU) en onderzoekt chromosoomsegregatie, spoelmorfologie, globale histonacetylering en mRNA-expressie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Oocytbiologie
- Vruchtbaarheid bij monovulatoire soorten
- Procedures voor gametenmanipulatie
Achtergrond
- Het begrijpen van de kenmerken van oocyten is cruciaal voor fertiliteitsonderzoek.
- Monovulatoire soorten hebben een beperkte beschikbaarheid van oocyten.
- Ultrasone geleide OPU kan de monstercollectie verbeteren.
- Een vergelijkende analyse van in vitro en in vivo bewerkte gameten is essentieel.
Doel van de studie
- Om paardenoocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren.
- Om gameten van hetzelfde dier te vergelijken die in verschillende omgevingen zijn verwerkt.
- Om de veiligheid bij procedures voor gametenmanipulatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Echogeleide ovum pick-up (OPU) voor de collectie van oocyten.
- Beoordeling van de diameter van ovale follikels bij volwassen merries.
- Onderzoek naar chromosoomsegregatie en spoelmorfologie.
- Analyse van globale histonacetylering en mRNA-expressie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verzameling van onrijpe en rijpe oocyten van paarden.
- Inzichten in chromosoomsegregatie en spoelmorfologie.
- Gegevens over globale histonacetyleringsniveaus.
- Expressieprofielen van relevante mRNA's werden vastgesteld.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor de karakterisering van oocyten bij paarden.
- De bevindingen kunnen het begrip van de fertiliteit bij monovulatoire soorten verbeteren.
- OPU-technieken kunnen de veiligheid van gametenmanipulatie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het karakteriseren van de oocytenbiologie bij monovulatoire soorten pakt een kritiek knelpunt aan in reproductief R&D, waarbij de beperkte beschikbaarheid van monsters mechanistische studies belemmert. Deze benadering maakt een vergelijkende analyse mogelijk van de effecten van in vitro versus in vivo rijping op de chromosomale integriteit en epigenetische regulatie, wat voorspellende inzichten biedt voor de optimalisatie van kweekcondities. Dergelijke gegevens dragen bij aan het verminderen van risico's bij geassisteerde reproductietechnologieën door kweek-geïnduceerde aneuploïdie en spoelfiguurdefecten te identificeren vóór de klinische vertaling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar mechanismen van meiotische getrouwheid mogelijk door de incidentie van aneuploïdie te kwantificeren als functionele readout van de competentie van chromosoomsegregatie.
- Wetenschappelijke waarde: Histonacetyleringsprofilering (H4K16) koppelt de epigenetische status aan de spindelmorfologie, wat de doelwitvalidatie van HDAC/HAT-paden bij oocytenrijping ondersteunt.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd cytologisch kader voor het beoordelen van oocytenkwaliteitsparameters dat toepasbaar is op verschillende soorten met beperkte toegang tot oocyten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Kwantitatieve chromosoom- en spoelmorfometrie stelt objectieve, reproduceerbare metrieken vast voor het evalueren van rijpingscondities in culturen.
- Operationele waarde: Immunokleuringsprotocollen voor tubuline en geacetyleerde histonen creëren overdraagbare assays voor high-content screening van epigenetische modifiers.
- Wetenschappelijke waarde: mRNA-stabiliteitsanalyse via qPCR onder transcriptionele stilte biedt informatie voor de identificatie van post-transcriptionele regulatoire targets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Een directe vergelijking van in vitro en in vivo gerijpte oocyten van dezelfde dierlijke isolaten scheidt cultuurspecifieke effecten, waardoor de translationele relevantie van preklinische modellen wordt vergroot.
- Operationele waarde: Stelt benchmark-dimensies van de spoel en acetyleringdrempels vast voor het definiëren van fysiologische rijpingstoestanden bij soorten met monovulatoire beperkingen.
- Wetenschappelijke waarde: Datasets van histonmodificaties ondersteunen de ontdekking van biomarkers voor het voorspellen van de competentie van oocyten in pijplijnen voor geassisteerde voortplanting.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen de fase van discovery biology, waarbij mechanistische inzichten in de kwaliteit van gameten bijdragen aan de validatie van target-moleculen stroomopwaarts en de ontwikkeling van assays stroomafwaarts voor reproductieve therapieën.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests over door kweek geïnduceerde epigenetische dysregulatie en de impact hiervan op de getrouwheid van de chromosomale segregatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (chromosoomaantallen, spoelmorfometrie, acetyleringsniveaus) voor het evalueren van effecten van verbindingen of condities op de oocytrijping.
- Analytiek: Genereert meetbare outputs (aneuploïdiegraden, H4K16-intensiteit, spoelafmetingen) die statistische vergelijking tussen experimentele groepen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met in vivo benchmarks, waardoor het risico op soortspecifieke extrapolatie bij de ontwikkeling van preklinische fertiliteitsmodellen wordt verminderd.
- Zakelijke Herbruikbaarheid: OPU- en fixatieprotocollen creëren een herbruikbaar platform voor oocytkarakterisering dat toepasbaar is op andere monovulatoire soorten waarbij sprake is van schaarste aan monsters.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de veiligheid van het maturatieprotocol door een directe koppeling van kweekcondities aan metrieken voor epigenetische en chromosomale integriteit.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflows voor het verzamelen en verwerken van oocyten verbeteren de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en soorten.
- Strategische waarde: Vroege detectie van kweek-geïnduceerde meiotische defecten vermindert het risico op falen in een laat stadium bij de ontwikkeling van technologieën voor geassisteerde voortplanting.
- Impact op portfolio: Datagestuurde prioritering van formuleringen voor maturatiemedia op basis van drempelwaarden voor aneuploïdie en spindelnormaaliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in het hanteren van oocyten, micromanipulatie en fluorescentiemicroscopie is vereist voor een nauwkeurige analyse van chromosomen en spindels.
- Confocale laser scanning microscopie en verwarmde tafel-systemen zijn essentieel voor tijdopgeloste fixatie en beeldvorming van meiotische structuren.
- Cross-laboratorium standaardisatie van antilichaamvalidatie (tubuline, H4K16ac) en montageprotocollen waarborgt vergelijkbare kwantitatieve resultaten.
- Aanpassing aan verschillende soorten vereist optimalisatie van OPU-follicikelgrootte-drempelwaarden en hormoondosering op basis van de reproductieve fysiologie.
- Beperkingen omvatten een lage oocytenopbrengst per sessie en het onvermogen om transcriptionele activiteit te beoordelen vanwege globale silencing tijdens de rijping, waardoor de focus verschuift naar post-transcriptionele regulatie.
