Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Het algemene doel van deze procedure is om de thermische stabiliteit en structurele conformatie van eiwitten in een industriële omgeving te beoordelen met behulp van differentiële scancalorimetrie. Differentiële scancalorimetrie meet de molaire warmtecapaciteit van monsters als functie van de temperatuur en is met succes gebruikt om de thermische stabiliteit en structurele conformatie van eiwitten te beoordelen. Deze relatief eenvoudige procedure is niet afhankelijk van structurele heliciteit of intrinsieke fluoroforen, zoals het geval is voor andere biofysische methoden.

Een ander voordeel van deze techniek is dat het direct de temperatuur van de thermische overgang meet en de energie die nodig is om de interactie te verstoren die de tertiaire structuur van eiwitten stabiliseert. Wanneer het wordt gebruikt in combinatie met de entropie van ontvouwen, kan de temperatuur van de thermische overgang dienen als een nuttige parameter om de consistentie van productieprocessen voor biologische producten te bewaken. Visuele demonstratie van deze methode kan dienen als een interactief medium om nieuwe gebruikers effectief te assisteren met kritieke stappen.

Om te beginnen, zet de differentiële scancalorimeter aan. Lever vervolgens stikstof in het systeem. Dit zal de druk in de cellen verhogen om het koken van de monsters te onderdrukken en het vormen van bellen bij verhoogde temperaturen te voorkomen.

Afhankelijk van het materiaal waaruit de cel bestaat, pas de druk van de stikstofgastoevoer aan volgens de aanbevolen druk van de fabrikant om schade aan de cel te voorkomen. Zorg ervoor dat alle reservoirs voor reinigingsmiddelen zijn gevuld tot het vereiste volume. Vereiste reinigingsmiddelen omvatten detergens om de cel te wassen en water om de cel na elke monsterserie schoon te maken.

Stel de temperatuur van het monsterhoudercompartiment in op een geschikte waarde, bij voorkeur vijf graden Celsius om de integriteit van het monster vóór het experiment te behouden. Het is belangrijk om het monster in evenwicht te brengen met de buffer om ervoor te zorgen dat het enige verschil tussen de oplossingen het eiwit is. Daarom kan het waargenomen verschil in warmtecapaciteit correct worden toegeschreven aan het eiwit.

Bepaal de concentratie van het eiwitmonster met behulp van een geschikte methode voor eiwitconcentratiebepaling, zoals de Lowry-methode. Voor het instrument dat in dit protocol wordt gebruikt, is het preferabele werkbereik 0,5 tot één milligram eiwit per milliliter. Dialyseer het monster tegen de buffer die als referentie voor het experiment zal worden gebruikt.

Ontgas het monster en de referentiebuffer in een vacuüm om microbubbels te verwijderen die volumenauwkeurigheid kunnen veroorzaken. Werk in een biocontainmentkast met laminaire stroming, gebruik een micropipet en steriele tips om de monsters in paren in hun respectieve buffer in 96-wells platen te laden. Vul de eerste twee paar wells met buffer om buffer-buffer scans uit te voeren om de geschiktheid van het instrument te verifiëren vóór monstermeting.

Vul de laatste twee paar wells met water voor de waterscan om de cellen te reinigen. Bedek vervolgens de 96-wells plaat met afdichtfolie. Zorg ervoor dat de wells goed zijn afgesloten voordat u de plaat uit de bioveiligheidskast haalt om besmetting van het monster te voorkomen.

Plaats tenslotte de plaat in het monsterhoudercompartiment in de juiste oriëntatie. Voer met de acquisitiesoftware de monsterinformatie in volgens de volgorde waarin de plaat is geladen. Voer de eiwitconcentraties in, indien beschikbaar.

Voer anders de concentratie in de analysesoftware in vóór data-analyse. Selecteer de optie die ervoor zorgt dat de cel met detergens wordt gereinigd voor elke monsterscan. De reiniging moet worden gevolgd door meerdere waterrinsingstappen om ervoor te zorgen dat er geen detergensresidu in de cellen achterblijft.

Stel de starttemperatuur van het experiment in op 20 graden Celsius, die kan variëren afhankelijk van het monster. Voor bekende eiwitten kan een vooraf bepaalde starttemperatuur worden gebruikt, terwijl een lagere starttemperatuur kan worden toegepast voor onbekende monsters. Stel vervolgens de eindtemperatuur van het experiment in.

De eindtemperatuur kan ook variëren afhankelijk van voorkennis van het monster. Stel vervolgens de scansnelheid van het experiment in. Het is raadzaam om onbekende monsters met verschillende scansnelheden te scannen om de kinetica van ontvouwen te beoordelen.

Stel de acquisitiesoftware in om de monsters opnieuw te scannen om de omkeerbaarheid van de thermische overgang te onderzoeken. Het ontvouwen van een eiwit wordt als omkeerbaar beschouwd als de enthalpie die voor de tweede scan is verkregen, minstens 80% is van de enthalpiewaarde van de eerste scan. Stel de post-experimentele thermostaat in op 10 graden Celsius om de integriteit van de calorimetercel te behouden.

Controleer of de parameters van de experimentopstelling correct zijn voordat u het experiment uitvoert. Als alles op zijn plaats zit, start u het experiment. Na het experiment voert u data-analyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voor de analyse wordt baseline-subtraksie handmatig uitgevoerd. Consistentie in deze stap is cruciaal om vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Hier wordt een representatieve ruwe gegevens van een experimentele run getoond, inclusief de buffer- en waterscans.

De te analyseren monsters zijn toxines in zijn native en ontgifte toestand. De monsterscans worden afzonderlijk verwerkt om de smelttemperatuur en enthalpiewaarden voor elk monster af te leiden. Voor de native toestand is de smelttemperatuur 55,55 graden Celsius en is de enthalpie van de toxine 3,157 maal 10 tot de vijfde calorieën per mol.

Omgekeerd is de smelttemperatuur van de toxine in zijn ontgifte toestand 81,21 graden Celsius en is de enthalpie 3,656 maal 10 tot de vijfde calorieën per mol. De overlay van de verwerkte gegevens van de toxine in zijn native en ontgifte toestand toont aan dat het ontgifte monster thermisch stabieler is dan zijn native toestand volgens de smelttemperatuurwaarden. Het geeft ook aan dat het ontgiftingsproces structurele veranderingen in de tertiaire structuur van de toxine introduceert.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u een voldoende voorraad detergens en water moet verstrekken om kruisbesmetting van de cel en de spuit te voorkomen, omdat hun helderheid cruciaal is voor nauwkeurige resultaten. Na het bek