Name: Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer differentiecalorimetrie voor thermische stabiliteit van eiwitantigenen in vaccinontwikkeling. Deze methode meet smeltpunten en enthalpie om lotconsistentie in biologische productie te waarborgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn zeer dankbaar voor Joseph Mancini (voorheen met GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments beperkte) voor hun rol in de installatie en training op de differentiële scanning calorimeter, Sasmit Deshmukh en Webster Magcalas voor hun discussies.

1. Instrument Start-up <ol><li> Schakel de differentiële scanning calorimeter en verhoog de druk in de cellen te koken van de monsters te onderdrukken en de vorming bellen bij verhoogde temperaturen. Dit wordt typisch bereikt door het toevoeren van stikstof in het systeem. </li><li> Afhankelijk van het samenstellende materiaal van de cel (bijvoorbeeld tantaal, goud, platina, enz.), Pas de druk van het stikstofgas aan conform aanbevolen druk van de fabrikant om beschadiging van de cel. Stel bijvoorbeeld de druk van het stikstofgas voorziening van 45 psi voor gebruikte procedure ontwikkelen instrument en druk boven 80 psi kan de cel beschadigen. </li><li> Zorgen dat alle reinigingsmiddel reservoirs gevuld tot het gewenste volume. Reinigingsmiddelen vereist onder meer zeep en water om te wassen en reinigen van de cel, respectievelijk na elk monster run. </li><li> Stel de temperatuur van het monster te houden compartimenteen geschikte waarde, bij voorkeur 5 ° C, om de integriteit van het monster voor experimenteren handhaven. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Dialyseer het monster tegen de buffer die wordt gebruikt als referentie voor het experiment. Alternatief kan elutiebuffer verzameld op de laatste stap van eiwitzuivering (dwz kolom elutie) worden gebruikt. </li><li> Bepaal de concentratie van het eiwit monster met de meest geschikte eiwitconcentratie bepalingsmethode zoals Kjedahl methode 33 of Lowry methode 34. Voor een objectieve vergelijking van de resultaten, maken gebruik van dezelfde methode consequent binnen dezelfde studie. De vereiste concentratie kan variëren afhankelijk van het model van het instrument. Voor de in dit protocol gebruikte instrument, de voorkeur werkbereik is 0,5-1 mg / ml. </li><li> Ontgas het monster en referentie buffer in vacuüm ontdoen van microbellen dat volume inaccur kunnen veroorzakenacy. Deze stap kan worden overgeslagen voor nieuwere modellen calorimeter. </li><li> Met behulp van een micropipet en steriele tips in een laminaire stroming biocontainment kast, laadt de monsters en hun respectieve buffer in paren in 96 putjesplaten compatibel met het instrument. Vul de eerste twee paar putten met buffer en de laatste twee paren met water voor de buffer-buffer en het water scan respectievelijk. Buffer-buffer scans controleren of de geschiktheid van het instrument voorafgaand aan de meting (dat wil zeggen de beoordeling van instrumentatie fout) te proeven, evenals de oprichting van een basislijn; terwijl water scans worden uitgevoerd om de cellen te reinigen. </li><li> Bedek de 96-well plaat met een afdichtende film, en ervoor te zorgen dat de putten goed zijn afgedicht voordat de plaat uit de bioveiligheid kabinet om het monster te voorkomen. </li><li> Plaats de plaat in de steekproef houden compartiment in de juiste richting. </li></ol> 3. Experimenteel Parameter Setup Opmerking: Afhankelijk van de instrumentation monsters kunnen worden geladen in de cel ofwel handmatig met een injectiespuit of automatisch met behulp van een autosampler. In dit geval is (dwz een industriële omgeving), wordt een autosampler gebruikt om tijd te besparen. <ol><li> Met behulp van de acquisitie software, voert het monster informatie in de volgorde van de plaat werd volgens paragraaf 2.4 geladen. Voer concentraties indien beschikbaar, anders, voer concentratiewaarden in analysesoftware voorafgaand aan de data-analyse (paragraaf 4.2). </li><li> Selecteer de optie dat het reinigen van cellen met detergent zorgt voor elk monster-scan, die moet worden gevolgd door meerdere water spoelen stappen om geen wasmiddel residuen in de cellen te waarborgen. </li><li> Stel de starttemperatuur van het experiment met 20 ° C, maar dit kan variëren afhankelijk van voorkennis van het monster. Voor bekende eiwitten, kunnen vooraf bepaalde begintemperatuur worden gebruikt, terwijl een lagere uitgangstemperatuur kunnen worden toegepast onbekende monsters. </li><li> Stel de uiteindelijke temperatuurvan het experiment, bijvoorbeeld 100 ° C. De eindtemperatuur variabel voorkennis van het monster. </li><li> Stel de scansnelheid van het experiment, bijvoorbeeld 60 ° C / h, wat typisch scansnelheid. Evenwel scansnelheid variabel voorkennis van het monster, bijvoorbeeld 90 ° C / h of 120 ° C / h. Het is raadzaam om onbekende monsters met verschillende scansnelheden scannen naar de kinetiek van ontvouwen beoordelen. </li><li> Rescan monsters naar de omkeerbaarheid van de thermische ontvouwing te onderzoeken. Het ontvouwen van een eiwit wordt als reversibel indien het resultaat voor de tweede scan enthalpie ten minste 80% van de enthalpie waarde van de eerste scan. </li><li> Stel de post-experiment thermostaat op 10 ° C om de integriteit van de cellen calorimeter te behouden. </li><li> Controleer of het experiment setup parameters juist vóór de uitvoering van het experiment zijn. Als alles op zijn plaats is, start het experiment. </li></ol> 4. Gegevens Analysis <ol><li> Ophalen ruwe gegevens uit het experiment en selecteer een monster bij een tijd voor analyse. Aftrekken verwijzing scan, dwz buffer, uit het monster scan. LET OP: Reference aftrekken wordt automatisch door nieuwere modellen van DSC-instrumenten uitgevoerd. </li><li> Voer sample concentratie waarde als het werd weggelaten volgens paragraaf 3.1. </li><li> Passen en aftrekken van de basislijn verkregen thermogram om rekening te houden met verschillen in de warmtecapaciteiten van de gevouwen en ontvouwen toestanden van het eiwit dat wordt veroorzaakt door de blootstelling van hydrofobe groepen op water ontvouwen. Lineaire of derdegraads kromme fitting kan worden toegepast, afhankelijk van de vorm van het profiel DSC voor het monster. Voor consistentie, hetzelfde type fitting tijdens een onderzoek, bijvoorbeeld real-time stabiliteitsstudie te gebruiken. Deze stap is nodig om de curve werkwijze voor piekintegratie om enthalpie van transitie verkrijgen. </li><li> Piekintegratie voeren met behulp van niet-lineaire kleinste kwadraten. Op basis van productkennis toe te passen twee-staten of niet-twee-staten-model. Twee-staten-model kan worden gebruikt voor enkele coöperatieve thermische overgangen, en voor onbekende eiwitten, gelden de niet-twee state model tot nader kennis van de producten is beschikbaar. Indien van toepassing, aan te passen curve fitting met de iteratieve curve fitting functie van de software van de apparatuur totdat de Chi-kwadraat waarde constant blijft. </li><li> Verkregen resultaten worden de waarden weergegeven voor middelpunt van transitietemperaturen (Tm), calorimetrische enthalpie (AH) en van&#39;t Hoff enthalpie (AH VH) van het monster. </li></ol>

<ol><li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+techniques%3A+applications+in+biology+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li>
<li>Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. , US3263484A 02 August (1966).</li>
<li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/231200637_The_Analysis_of_a_Temperature-Controlled_Scanning_Calorimeter">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li>
<li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60242a011">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li>
<li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).</li>
<li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen%2C+isolated+from+transplantable+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Dokl.+Akad.+Nauk%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndronikashvili%2C+EL+%22Conformational+Changes+of+Biopolymers+in+Solution%22">Conformational Changes of Biopolymers in Solution</a>. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).</li>
<li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://europepmc.org/abstract/med/3318939">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).</li>
<li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.pc.38.100187.002335">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li>
<li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen%2C+ribonuclease+and+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure%3A+a+calorimetric+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li>
<li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li>
<li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).</li>
<li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li>
<li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li>
<li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li>
<li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.future-science.com/doi/abs/10.4155/pbp.14.27">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li>
<li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiskoot%2C+W+%22Methods+for+structural+analysis+of+protein+pharmaceuticals%22">Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals</a>. 3, Springer Science & Business Media. (2005).</li>
<li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li>
<li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Freire, E. Differential scanning calorimetry. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1385%2F0896033015">Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology</a>. 40, 191-218 (1995).</li>
<li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li>
<li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li>
<li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li>
<li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/0307-4412(94)90013-2/full">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li>
<li>Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781588299543">Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology</a>. 490, 1-39 (2009).</li>
<li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ijapbs.com/admin/php/uploads/156_pdf.pdf">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li>
<li>Stability testing of new drug substances and products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guideline%2C+ICH+Harmonised+Tripartite%22">Guideline, ICH Harmonised Tripartite</a>. 1 (2), current step. 4 (2003).</li>
<li>Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14907713">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%96hne%2C+G+%22Differential+Scanning+Calorimetry%22">Differential Scanning Calorimetry</a>. , Springer Science & Business Media. (2003).</li>
<li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22635268">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li>
<li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+drug+stability%3A+a+formulation+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li>
<li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry%3A+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li>
<li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicity%2C+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li>
<li>Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+disc+today%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins%3A+qualification+of+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn werknemers van Sanofi Pasteur. Het werk werd gefinancierd door Sanofi Pasteur, en de daaraan verbonden kosten voor deze video-artikel werd betaald door Sanofi Pasteur. De auteurs hebben geen relevante voorkeuren of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit die een financieel conflict met de materie of materialen besproken in het manuscript heeft. Deze omvatten de werkgelegenheid, adviesbureaus, bezit van aandelen of opties, of royalty&#39;s. Nr schriftelijk hulp werd gebruikt bij de productie van dit manuscript.

Deze procedure is met succes opgenomen in verschillende karakterisering testpakketten, waaronder de stabiliteit en de vergelijkbaarheid studies 21. Realtime stabiliteitsstudies wordt gebruikt om de DSC Tm bewaken, alsmede een schatting van de Fa van biologische tijd om hun houdbaarheid te bepalen. Met betrekking tot de vergelijkbaarheid wordt gebruikt om de impact van de werkwijze en inrichting verandering en het effect van belangrijke vervaardigingsstappen op de structurele conformatie van geproduceerde partijen beoordelen. Dit omvat normaliter de directe vergelijking van de AH van geproduceerde partij een referentie product dat is aangewezen als het ideale product. Bovendien heeft DSC bewezen een analysemiddel voor product formuleringsstudies 37 zijn. De Tm van een eiwit in verschillende buffers met verschillende concentraties kan worden gebruikt om de formulering die de stabiliteit te bepalen proffershet eiwit. Om de betrouwbaarheid van deze methode en objectiviteit van de resultaten, is het belangrijk om testparameters consistent van gang tot gang in dezelfde studie (bv vaccinpreparaat studie). Echter, de procedure worden gewijzigd om verschillen in de fysische eigenschappen van verschillende eiwitten tegemoet. Een voorbeeld van een modificatie die gemaakt kan worden is het veranderen van de scansnelheid van het experiment 38, 39. Eiwitten die gevoelig zijn voor de vorming van aggregaten waren toen verwarmd werden sneller scansnelheid onderzocht (bijvoorbeeld 120 ° C / h) de bijdrage van aggregaten voor de thermische overgangsprofiel voorkomen en verstopping van de capillairen van de calorimeter. Het is vermeldenswaard dat het scannen van snelheid de uitkomst van een DSC experiment 38 kunnen beïnvloeden. Verbreding van de thermische overgangstemperatuur piek waargenomen met toenemende scansnelheden in sommige proeiwitten; echter, T m bleef redelijk constant 38. Bovendien is de dialyse en ontgassen stappen voor de bereiding van de monsters zijn ook zeer belangrijk voor nauwkeurige resultaten 31. Dialyse zorgt dat het enige verschil in de samenstelling van het monster en de buffer het eiwit; Aldus kan de overtollige warmte wordt geabsorbeerd door het monster worden toegeschreven aan de warmtecapaciteit van het eiwit. Ontgassing garandeert juiste omvang analyse, zoals de extrapolatie van de thermodynamische parameters neemt aan dat het ontvouwen gebeurtenis zich voordoet onder druk en constant volume 31. De constante druk gedeelte van de veronderstelling komt voor rekening van stikstof onder druk van het systeem als in punt 1.1 van de procedure. In vergelijking met andere werkwijzen voor het bepalen van de stabiliteit van eiwitconformaties zoals Circulaire dichroïsme (CD) en fluorescentie spectroscopie, DSC biedt een aantal voordelen in een comcommerciële instelling met inbegrip van kosten en tijd te besparen. Enerzijds het adiabatische ontwerp van een differentiële scanning calorimeter maakt het meten van de thermische stabiliteit betere temperatuurregeling precisie vergeleken met metingen met instrumentatie voor CD en fluorescentie spectroscopie 6. Ten tweede, in tegenstelling tot CD, de nauwkeurigheid van DSC gegevens zijn niet afhankelijk van de heliciteit van de eiwitten 39, 40; echter CD biedt aanvullende informatie over het ontvouwen van de secundaire structuur, die complementair zijn aan de DSC 41 zou zijn. Bovendien, het onder druk zetten van de DSC systeem kunnen getest met een breed temperatuurbereik zonder verwarmen het monster; Aldus kan een groot aantal eiwitten worden getest door DSC. Terwijl DSC is een relatief snelle en eenvoudige benadering van de thermische stabiliteit van biologische bepaling is niet zonder beperkingen. Ten eerste, de basislijn aftrekken stap introduceert een vorm van menselijke inconsequentie in de ruwe data-analyse; aldus kunnen verschillen in de resultaten worden waargenomen bij verschillende gebruikers. Ten tweede, differentiële scanning calorimeters hebben minimale concentratie grenzen die moeilijk te realiseren bij massaproductie schaal zou kunnen zijn. Ten derde, de AH van irreversibele thermische denaturatie is niet absoluut; hetgeen impliceert dat afgeleid Ag (een indicator van eiwitstabiliteit) in soortgelijke scenario misleidend kan zijn. Bovendien heeft de werkwijze het beste werkt voor gezuiverde monsters. Aanwezigheid van onzuiverheden kan ofwel leiden tot een verschuiving in de Tm of er een interactie met het eiwit te onderzoeken, of het uiterlijk van nieuwe thermische transities als er geen interactie. In ieder geval deze extra functies op de thermogrammen verkeerd kan worden toegeschreven aan monsters, waardoor de interpretatie van de resultaten beïnvloeden. Ondanks deze beperkingen DSC blijft een betrouwbare methode die gedetailleerde thermodynamische Inform kunnen biedene eiwitontvouwende proces indien goed 42 geïmplementeerd. Concluderend DSC biedt aanzienlijke voordelen als een conformationeel uitlezing instrument vaccinproducten en hun tussenproducten. De twee parameters, Tm en AH, verzameld voor een reeks van veel hetzelfde product kan een empirische basislijn die kan worden gebruikt om het effect van procesveranderingen, formulering en bewaaromstandigheden op de tertiaire structuur en stabiliteit van eiwitten onderzocht worden en virale antigenen 21, 43.

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een experimentele methode die direct het verschil in warmte-energie opname plaatsvindt in een monster ten opzichte van een referentie tijdens een geregelde temperatuurverandering 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 meet , 10, 11, 12. Uitgevoerd in een differentiële scanning calorimeter, omvat de methode het introduceren van warmte-energie in een cel en een referentie-cel tegelijkertijd terwijl identieke verhoging van de temperatuur van beide cellen in de tijd 2, 13,14. Vanwege verschillen in de samenstelling van het monster en de referentie worden verschillende hoeveelheid energie nodig om de temperatuur van de cellen 2, 12, 13 te verhogen. Aldus wordt de overtollige hoeveelheid energie die nodig is ter compensatie van het temperatuurverschil tussen de cellen gemeten en is rechtstreeks gecorreleerd aan specifieke thermodynamische eigenschappen van het monster 1, 3. In de jaren 1960, MJ O&#39;Neil en E. Watson van Perkin Elmer ontwikkelde de eerste differentiële scanning calorimeter de warmtestroom van vaste materialen 2, 3, 4 meten. Parallel, PL Privalov en DR Monaseldze EL van het Institute of Physics, Republiek Georgië (voormalige Sovjet-Unie) een unieke differentiële adiabatische calorimeter die kunnen worden gebruikt for biochemisch onderzoek 5, 6. Vervolgens, team Andronikashvili bij het Institute of Physics, Republiek Georgië, meldde de warmtecapaciteit van biomoleculen zoals vezelachtige en bolvormige eiwitten, DNA en RNA behulp van DSC 7, 8, 9. Verschillende ploegen geleid door Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts en Privalov 14, 15, 16 gericht op de ontwikkeling van de theorie en praktische toepassingen van DSC om de thermodynamische gegevens van eiwitontvouwende onderzoeken. De waarde van DSC bestuderen grote supramoleculaire structuren zoals fagen, chloroplast, fosfolipide vloeibare kristallen, en vlees eiwitten zijn ook gemeld 17 </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC is nu gemeengoed in farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling worden voor de beoordeling van de thermische stabiliteit van biomoleculen, in het bijzonder eiwitten 1, 21, 22. Dit is vooral te wijten aan de vooruitgang in termen van gevoeligheid en automatisering van de instrumenten die worden gebruikt het experiment 23, 24 uit te voeren. Hier, het eindresultaat van de DSC experiment, namelijk molaire warmtecapaciteit als functie van de temperatuur, wordt gebruikt om de volgende thermodynamische parameters te schatten (verandering warmtecapaciteit (ΔCp), enthalpie (AH), entropie (AS) en Gibbs vrije energie (Ag)) met behulp van de onderstaande vergelijking: eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="vergelijking 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="vergelijking 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) Waar Cp wordt gemeten warmtecapaciteit; q is de warmtestroom in het testmateriaal; T 0 en T zijn de eerste en laatste temperaturen van de overgang van respectievelijk 22, 25. Het is ook vermeldenswaard dat de vergelijkingen bovenstaande van toepassing op enkel-domein eiwitten die twee-staten-transitie en omkeerbare thermische ontvouwing 22 kan ondergaan. Analyse van meer complexe eiwitten (bijvoorbeeld niet-twee-state eiwitten en oligomeren) have gerapporteerd door Friere et al. 26; Johnson et al. 27; en Kasimova et al. 28. Om te bepalen of een eiwit ondergaat twee-toestandsovergang of vormt tussenproducten tijdens de thermische denaturatie, het experimenteel afgeleide enthalpie (AH, ook wel calorimetrische enthalpie AH Cal) vergeleken met de enthalpie verkregen volgens de van&#39;t Hoff vergelijking hieronder gegeven (ook genoemd van&#39;t Hoff enthalpie, AH VH): <img alt="vergelijking 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) Waarbij Tm is de temperatuur middelpunt van de overgang, R de ideale gasconstante (1,987 cal mol -1 K -1) en Y de fractie van de eiwitpopulatie in ongevouwen toestand 16, 29. AlsAH VH gelijk aan AH Cal; of VH AH / AH Cal gelijk is aan 1, dan is de proteïne ondergaat een &quot;alles-of-niets&quot; overgang (dat wil zeggen twee-toestandsovergang) 16, 25, 29. Indien AH VH is dan AH Cal; of VH AH / AH Cal is dan 1, het eiwit ondergaat een niet-two-state overgang 16, 25, 29. De verhouding AH VH / AH Cal komt ook overeen met het aandeel van de eiwitstructuur die smelt als thermodynamische coöperatie eenheid of domein 26. De thermodynamische parameters zoals hierboven genoemd Ag en AH nuttige informatie over de thermische stabiliteit van eiwitten, waaronder biologische<html> 30. Toch zal de nadruk worden gelegd op Tm en de AH in deze publicatie, want zij zijn de gerapporteerde waarden voor dit protocol. Tm halverwege temperatuur van de overgang, waarbij de gevouwen en ontvouwen toestanden van het eiwit bij evenwicht (dwz Ag = 0) 25, 31. Hoe hoger de T m van een eiwit, hoe hoger de thermische stabiliteit 31. AH correspondeert met het oppervlak van de piek (en) van de warmtecapaciteit versus temperatuur diagram (ook bekend als thermogram) gegenereerd aan het einde van de DSC experiment 16, 25. Het is de energie die nodig is om eiwitten denatureren en kan worden gebruikt om de actieve fractie (F a) te schatten in een proteïne formulering (dat wil zeggen, het percentage eiwitten met actieve conformatie in een monster) met de volgende vergelijking: jove_content &quot;&gt; <img alt="vergelijking 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) Waar AH is de experimenteel afgeleide enthalpie van het eiwit monster en Q de enthalpie bepaald voor een goed gekarakteriseerde referentie- of gestandaardiseerde eiwit 22. De schatting van F een significant toezicht op de real-time stabiliteit van producten en uitvoeren stabiliteitsstudies onder stressomstandigheden zoals vereist ICH richtlijnen 32. Vergelijking van AH geeft ook informatie over de dichtheid van de tertiaire structuur van een eiwit conformatie 31. Dit protocol Gegevens een beoordelingsprocedure voor de thermische stabiliteit van eiwitten in een industriële omgeving en is uitgebreid gebruikt voor het formuleren van vaccins. Het werd ontwikkeld met behulp van een geautomatiseerde differentiële scanning calorimeter die reproduceerbare resultaten produceert fof eiwit concentraties van slechts 300 ug / ml.

<table><tbody><tr><td>Differential Scanning Calorimeter</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (Via GE Healthcare)</td><td>Heeft een autosampler voor het geautomatiseerd doseren van monsters in de cel om menselijke inspanning en fouten te verminderen.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>Verdun met water tot 20% voor gebruik</td></tr><tr><td>500 &micro;L Polypropylene ronde bodem 96-well plate</td><td>Canadian Life Science</td><td>ML072100</td><td>Equivalente platen van andere leveranciers (bijv., VW) kunnen ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>geleverd met de Cap VP DSC</td></tr><tr><td>Bioveiligheidskast&nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - A2</td><td>laminaire flowkast voor biocontainment voor monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialyse cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 of 66380</td><td>om de monster en buffer in evenwicht te brengen</td></tr></tbody></table>

differentiecalorimetrie - een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een analytische techniek die de molaire warmtecapaciteit van monsters als een functie van de temperatuur gemeten. Bij eiwitmonsters, DSC profielen bevatten informatie over thermische stabiliteit, en in zekere mate dient als structurele &quot;vingerafdruk&quot; die kunnen worden gebruikt om structurele conformatie beoordelen. Het is uitgevoerd met een differentiële scanning calorimeter dat de thermische overgangstemperatuur hoogte (smelttemperatuur, Tm) en de energie die nodig is om de interacties stabiliseert de tertiaire structuur verstoren (enthalpie, AH) van eiwitten. Vergelijkingen worden gemaakt tussen de formuleringen, alsmede de productie veel, en verschillen in de afgeleide waarden geven de verschillen in thermische stabiliteit en structurele conformatie. Gegevens ter illustratie van het gebruik van de DSC in een industriële omgeving voor de stabiliteit studies evenals het toezicht op de belangrijkste stappen in het productieproces worden geleverd als bewijs van de effectiviteit van deze proprotocol. In vergelijking met andere werkwijzen voor het beoordelen van de thermische stabiliteit van eiwitten conformaties, DSC is kosteneffectief, vergt weinig monstervoorbereiding stappen en ook volledig thermodynamische profiel van het eiwit ontvouwingsproces.

De ruwe gegevens van de meeste DSC experimenten worden gepresenteerd als een warmtestroom tegen temperatuur grafiek, de calorimeter daadwerkelijk meet het verschil in de snelheid van de warmtestroom in de monsteroplossing en buffer 35. Daarom, als beide cellen (dwz monster en referentie-cellen) tijdens een experiment identieke oplossingen bevatten, de ruwe data van de scan moet een vlakke lijn zonder waarneembare pieken zijn. Elke piek waargenomen kan worden toegeschreven aan instrumentatie fout (bijvoorbeeld beschadigde of besmette cellen), dat is waarom loopt buffer scans voorafgaand aan de proeven van de analyse is een adequaat systeem geschiktheidsonderzoek. Figuur 1 toont het resultaat van een typische buffer scan aangeeft dat de calorimeter was in goede conditie voorafgaand aan monsteranalyse. Figuur 2 toont de ruwe gegevens voor een DSC experiment uitgevoerd op diffErent tal van twee eiwit monsters. Zoals eerder gesuggereerd, de waargenomen pieken zijn de verschillen in de warmteflux van de monsters en hun respectieve buffers. Verschillen in sample concentratie kan variaties in warmtecapaciteit geregistreerd door de calorimeter veroorzaken; maar deze variaties zijn genormaliseerd tijdens monsteranalyse zoals in Sectie 4.2 van de procedure. Hogere concentraties kunnen ook zien extra thermodynamische domeinen niet bijdragen tot de overgang bij lagere concentraties. Bovendien, elke overgang is een thermodynamische domein dat kan één of meer structurele domeinen van het eiwit 36. In dit geval Protein 1 drie structurele domeinen die gezamenlijk smelten. Figuur 3 toont de resultaten die uit de analyse van de ruwe gegevens voor eiwit 1 en 2 weergegeven in figuur 2, dat wil zeggen, na aftrekken van de basislijn en iteratieve curve fitting. De resulterende thermogrammen zijn genormaliseerd voor het scannen van snelheid en concentratie (automatisch uitgevoerd door een vooraf ingestelde algoritme in de analyse software wordt uitgevoerd); aldus, waarin de resultaten van het experiment in vergelijkbare warmtecapaciteit versus temperatuur grafieken. De analysesoftware gebruikt gegevens van de warmtecapaciteit versus temperatuur grafieken, zoals Tm en ΔCp, andere thermodynamische parameters in varianten van de bovenstaande vergelijkingen afhankelijk van het coöperatief vermogen van eiwitontvouwende gegeven ontlenen. Bij het testen van onbekende monsters, het instellen van de juiste temperatuur is van cruciaal belang. Anders kunnen onvolledig thermogrammen leiden, zie figuur 4. Hoewel Tm van dergelijke profielen kunnen worden afgeleid, AH kan niet nauwkeurig worden vastgesteld. Daarom moet het monster opnieuw getest met een groter temperatuurbereik van de thermische overgang volledig vangen. Sommige eiwitten re ookadily vorm aggregaten na volledige denaturatie, waardoor steeds na overgang warmtecapaciteit: Dit verschijnt vaak als een onvolledige thermogram zie figuur 2B. Echter, nacontrole met een hogere eindtemperatuur kan helpen bevestigen of er een optreden van een conformationele overgang bij dat gebied van de thermogram en het is slechts de warmte-absorberende effect van eiwit-aggregaten. Thermische stabiliteit is één van de belangrijkste fysische eigenschappen van eiwitten en eiwit gebaseerde producten in de industrie 37. In farmaceutische producten, wordt het gebruikt om de stabiliteit van biologische bepaling onder verschillende omstandigheden, eventueel formulering buffers en omgevingsfactoren zoals luchtvochtigheid en temperatuur. Het wordt ook gebruikt ter observatie van vervaardigingsstap (bijvoorbeeld zuivering en ontgifting) conformationele samenhang tussen productiepartijen waarborgen. <strong<html> &gt; Figuren 5 en 6 illustreren de toepassing van DSC om de effecten van chemische ontgifting en bewaaromstandigheden bestuderen, respectievelijk op de stabiliteit en structurele conformatie van twee verschillende eiwitten. De aanzienlijke verschillen in Tm en AH geven conformatieveranderingen en eiwitafbraak respectievelijk. Bovendien, het verlies van de derde overgang in Figuur 6 illustreert verder de afbraak van een domein dat werd bevestigd door een afname in molecuulgewicht wanneer de monsters werden geanalyseerd onder toepassing Grootte-uitsluitingschromatografie met multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS) ( data niet weergegeven). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> Figuur 1: Buffer Scans. De gelijkenis in gradiënt van elke scan zonder waarneembare pieken geeft aan dat het instrument is in goede staat en genereerden reproduceerbare resultaten.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> Figuur 2: Raw Data verzameld van DSC experimenten. Deze grafieken zijn een goede vertegenwoordiging van de niet-geanalyseerde (rauw) verworven na experimentele runs gegevens (dwz voorafgaand aan de baseline aftrekken en curve fitting). Elke lijn staat voor een productie veel. Protein 2 neigt gemakkelijker aggregeren bij verhitting, waardoor een verhoging warmtecapaciteit boven 100 ° C in de post-overgangsgebied van het thermogram. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; Figuur 3: geanalyseerde DSC gegevens. Deze grafieken zijn een goede vertegenwoordiging van de geanalyseerde DSC gegevens (dwz na het aftrekken van de basislijn en curve fitting). De blauwe lijn geeft de thermogram na het aftrekken van de basislijn, terwijl de rode lijn van de curve met de beste fit aan de thermogram vertegenwoordigt. (A) De Tm en de AH voor eiwit 1 Monster # 12 zijn 80,16 ° C en 1,69 x 10 6 cal / mol resp. (B) De Tm en de AH voor eiwit 1 Monster # 13 zijn 80,15 ° C en 1,71 x 10 6 cal / mol resp. (C) De Tm en de AH voor eiwit 2 Monster # 21 zijn 75,01 ° C en 4,08 x 10 6 cal / mol resp. (D) De Tm en de AH voor eiwit 2 Monster # 22 zijn 75,67 ° C en 4,22 x 10 6 cal / mol resp. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om</a>bekijk een grotere versie van dit cijfer. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> Figuur 4: Een onvolledige Thermogram. Ruwe data te verzamelen voor Protein 1 geanalyseerd bij onvoldoende temperatuurbereik. De eindtemperatuur van experiment werd ingesteld op 90 ° C, die niet de gehele overgangsprofiel van het eiwit niet geschikt ten opzichte van het experiment Figuur 2A werd ingesteld op 120 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> Figuur 5: geanalyseerde gegevens die het effect van chemische ontgifting op de tertiaire structuur van proteïne 1 (A) Protein 1 is een toxine in zijn natieve conformatie en has zijn T m bij 56,84 ° C en AH op 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) De ontgifte vorm van Protein 1 (dwz toxoïde) heeft Tm en AH waarden van 81,01 ° C en 1,89 x 10 6 cal / mol resp. Derhalve kan worden geconcludeerd dat de detoxificatie stap heeft enkele vorm van wijziging in de structurele conformatie van Protein 1 die een grotere stabiliteit (hogere Tm) zijn gezuiverde vorm verleent. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> Figuur 6: geanalyseerde gegevens die het effect van bewaaromstandigheden op de conformatie van proteïne 3. Deze grafieken tonen het effect van de bewaartemperatuur (2-8 ° C) op de stabiliteit en tertiaire structuur van ProTein 3 meer dan 30 weken. De Tm en de AH waarden voor eiwit 3 op de 8e (A) en 38 ste week (B) opslagruimte zijn in Tabel 1 hieronder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td> 1 Tm (° C) </td><td> AH 1 (cal / mol) </td><td> 2 Tm (° C) </td><td> AH 2 (cal / mol) </td><td> 3 Tm (° C) </td><td> AH 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> Eiwit 3 bij 2-8 ° C gedurende 8 weken </td><td> 61,91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75,54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90.29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><td&gt; Protein 3 bewaard bij 2-8 ° C gedurende 38 weken </td><td> 61,87 </td><td> 1,66 x 10 5 </td><td> 75,18 </td><td> 1,46 x 10 5 </td><td> 90,22 </td><td> 5,76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Tm en AH waarden voor eiwit 3 op de 8e en 38e week opslag bij 2-8 ° C. Hoewel de Tm-waarden aan beide tijdstippen zijn gelijk, het verschil in de AH waarden geeft aan dat de tertiaire structuur van proteïne 3 dan 30 weken afgebroken onder de gespecificeerde bewaarcondities.

Differentiële scanning calorimetrie meet de thermische overgangstemperatuur (s) en de totale warmte-energie nodig is om een ​​eiwit te denatureren. De resultaten worden gebruikt om de thermische stabiliteit van eiwitantigenen beoordelen vaccinformuleringen.

Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de thermische stabiliteit en structurele conformatie van eiwitten in een industriële omgeving te beoordelen met behulp van differentiële scancalorimetrie. Differentiële scancalorimetrie meet de molaire warmtecapaciteit van monsters als functie van de temperatuur en is met succes gebruikt om de thermische stabiliteit en structurele conformatie van eiwitten te beoordelen. Deze relatief eenvoudige procedure is niet afhankelijk van structurele heliciteit of intrinsieke fluoroforen, zoals het geval is voor andere biofysische methoden.Een ander voordeel van deze techniek is dat het direct de temperatuur van de thermische overgang meet en de energie die nodig is om de interactie te verstoren die de tertiaire structuur van eiwitten stabiliseert. Wanneer het wordt gebruikt in combinatie met de entropie van ontvouwen, kan de temperatuur van de thermische overgang dienen als een nuttige parameter om de consistentie van productieprocessen voor biologische producten te bewaken. Visuele demonstratie van deze methode kan dienen als een interactief medium om nieuwe gebruikers effectief te assisteren met kritieke stappen.Om te beginnen, zet de differentiële scancalorimeter aan. Lever vervolgens stikstof in het systeem. Dit zal de druk in de cellen verhogen om het koken van de monsters te onderdrukken en het vormen van bellen bij verhoogde temperaturen te voorkomen.Afhankelijk van het materiaal waaruit de cel bestaat, pas de druk van de stikstofgastoevoer aan volgens de aanbevolen druk van de fabrikant om schade aan de cel te voorkomen. Zorg ervoor dat alle reservoirs voor reinigingsmiddelen zijn gevuld tot het vereiste volume. Vereiste reinigingsmiddelen omvatten detergens om de cel te wassen en water om de cel na elke monsterserie schoon te maken.Stel de temperatuur van het monsterhoudercompartiment in op een geschikte waarde, bij voorkeur vijf graden Celsius om de integriteit van het monster vóór het experiment te behouden. Het is belangrijk om het monster in evenwicht te brengen met de buffer om ervoor te zorgen dat het enige verschil tussen de oplossingen het eiwit is. Daarom kan het waargenomen verschil in warmtecapaciteit correct worden toegeschreven aan het eiwit.Bepaal de concentratie van het eiwitmonster met behulp van een geschikte methode voor eiwitconcentratiebepaling, zoals de Lowry-methode. Voor het instrument dat in dit protocol wordt gebruikt, is het preferabele werkbereik 0,5 tot één milligram eiwit per milliliter. Dialyseer het monster tegen de buffer die als referentie voor het experiment zal worden gebruikt.Ontgas het monster en de referentiebuffer in een vacuüm om microbubbels te verwijderen die volumenauwkeurigheid kunnen veroorzaken. Werk in een biocontainmentkast met laminaire stroming, gebruik een micropipet en steriele tips om de monsters in paren in hun respectieve buffer in 96-wells platen te laden. Vul de eerste twee paar wells met buffer om buffer-buffer scans uit te voeren om de geschiktheid van het instrument te verifiëren vóór monstermeting.Vul de laatste twee paar wells met water voor de waterscan om de cellen te reinigen. Bedek vervolgens de 96-wells plaat met afdichtfolie. Zorg ervoor dat de wells goed zijn afgesloten voordat u de plaat uit de bioveiligheidskast haalt om besmetting van het monster te voorkomen.Plaats tenslotte de plaat in het monsterhoudercompartiment in de juiste oriëntatie. Voer met de acquisitiesoftware de monsterinformatie in volgens de volgorde waarin de plaat is geladen. Voer de eiwitconcentraties in, indien beschikbaar.Voer anders de concentratie in de analysesoftware in vóór data-analyse. Selecteer de optie die ervoor zorgt dat de cel met detergens wordt gereinigd voor elke monsterscan. De reiniging moet worden gevolgd door meerdere waterrinsingstappen om ervoor te zorgen dat er geen detergensresidu in de cellen achterblijft.Stel de starttemperatuur van het experiment in op 20 graden Celsius, die kan variëren afhankelijk van het monster. Voor bekende eiwitten kan een vooraf bepaalde starttemperatuur worden gebruikt, terwijl een lagere starttemperatuur kan worden toegepast voor onbekende monsters. Stel vervolgens de eindtemperatuur van het experiment in.De eindtemperatuur kan ook variëren afhankelijk van voorkennis van het monster. Stel vervolgens de scansnelheid van het experiment in. Het is raadzaam om onbekende monsters met verschillende scansnelheden te scannen om de kinetica van ontvouwen te beoordelen.Stel de acquisitiesoftware in om de monsters opnieuw te scannen om de omkeerbaarheid van de thermische overgang te onderzoeken. Het ontvouwen van een eiwit wordt als omkeerbaar beschouwd als de enthalpie die voor de tweede scan is verkregen, minstens 80% is van de enthalpiewaarde van de eerste scan. Stel de post-experimentele thermostaat in op 10 graden Celsius om de integriteit van de calorimetercel te behouden.Controleer of de parameters van de experimentopstelling correct zijn voordat u het experiment uitvoert. Als alles op zijn plaats zit, start u het experiment. Na het experiment voert u data-analyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Voor de analyse wordt baseline-subtraksie handmatig uitgevoerd. Consistentie in deze stap is cruciaal om vergelijkbare resultaten te verkrijgen. Hier wordt een representatieve ruwe gegevens van een experimentele run getoond, inclusief de buffer- en waterscans.De te analyseren monsters zijn toxines in zijn native en ontgifte toestand. De monsterscans worden afzonderlijk verwerkt om de smelttemperatuur en enthalpiewaarden voor elk monster af te leiden. Voor de native toestand is de smelttemperatuur 55,55 graden Celsius en is de enthalpie van de toxine 3,157 maal 10 tot de vijfde calorieën per mol.Omgekeerd is de smelttemperatuur van de toxine in zijn ontgifte toestand 81,21 graden Celsius en is de enthalpie 3,656 maal 10 tot de vijfde calorieën per mol. De overlay van de verwerkte gegevens van de toxine in zijn native en ontgifte toestand toont aan dat het ontgifte monster thermisch stabieler is dan zijn native toestand volgens de smelttemperatuurwaarden. Het geeft ook aan dat het ontgiftingsproces structurele veranderingen in de tertiaire structuur van de toxine introduceert.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u een voldoende voorraad detergens en water moet verstrekken om kruisbesmetting van de cel en de spuit te voorkomen, omdat hun helderheid cruciaal is voor nauwkeurige resultaten. Na het bek

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates differential scanning calorimetry — a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Mengen is een efficiënte benadering van biomaterialen met een breed scala van eigenschappen en gecombineerde functies te genereren. Door het voorspellen van de moleculaire interacties tussen de verschillende natuurlijke zijde proteïnen, kunnen nieuwe zijde-zijde eiwit legering platforms met instelbare mechanische veerkracht, elektrische reactie, optische transparantie, chemische verwerkbaarheid, biologische afbreekbaarheid, of thermische stabiliteit worden ontworpen.

Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Een protocol is bedoeld om te snel testen van de thermische stabiliteit van eiwitten in een verscheidenheid van voorwaarden door middel van thermische shift testen en nano differentiële scanning van fluorimetrie. Buffer systemen, zouten en additieven, samen zijn bestaande uit drie unieke stabiliteit schermen, vehiculumcontrolegroep met eiwitten om te identificeren van geschikte buffers voor functionele en structurele studies.

Hoe te stabiliseren van eiwit: stabiliteit schermen voor thermische verschuiven Assays en Nano Differential Scanning fluorimetrie in het Virus-X-Project

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

Deze publicatie toont de toepassing van röntgendiffractie en differentiële scanningcalorimetrie als gouden standaarden voor het onderzoeken van de vaste toestand van lipide-gebaseerde hulpstoffen (LLBE's). Het begrijpen van de solid-state verandering in LLE's en het effect ervan op de prestaties van farmaceutische producten daarvan is de belangrijkste factor voor het vervaardigen van robuuste op lipiden gebaseerde doseringsvormen.

Een pakket van gevestigde analytische hulpmiddelen om de solid-state verandering van lipide-gebaseerde hulpstoffen te onderzoeken

Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het detecteren van de binding tussen verbindingen en eiwitmoleculen, en biedt de voordelen van minimaal verlies van eiwitmonsters en een hoge nauwkeurigheid van de gegevens.

Detectie van CD40-eiwit-umbelliferon-interactie via differentiële scanfluorescentie

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Leer differentiecalorimetrie voor thermische stabiliteit van eiwitantigenen in vaccinontwikkeling. Deze methode meet smeltpunten en enthalpie om lotconsistentie in biologische productie te waarborgen.

Differentiecalorimetrie - Een methode voor het beoordelen van de thermische stabiliteit en conformatie van eiwitantigeen

Meer video's verkennen