A Comprehensive Procedure voor het evalueren

Het algemene doel van deze procedure is om het in vivo gedrag van kanker-nanogeneesmiddelen te evalueren op systemisch niveau, weefselniveau, enkelcelniveau en subcellulair niveau in immuuncompetente muizen met tumoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de kernvraag binnen het veld van de kanker-nanogeneeskunde: Hoe accumuleren nanogeneesmiddelen kwantitatief in verschillende weefsels van levende dieren gedurende een bepaalde tijd?

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze dubbele labelingsbenadering in vivo karakterisering van nanogeneesmiddelen mogelijk maakt, van het macroscopische tot het microscopische niveau. We kiezen liposomen als voorbeeld om onze procedure te demonstreren, omdat liposomen momenteel in klinisch gebruik zijn en bovendien een veelvoorkomend platform vormen voor experimentele nanogeneesmiddelen. Om de procedure te starten, lost u 20 milligram van een lipidenmengsel op, dat 0,1% molaire fractie van een lipofiele kationische fluorescente kleurstof bevat, in twee milliliter chloroform.

Droog vervolgens de lipiden met een rotatieverdamper. Voeg 20 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan de gedroogde lipiden. Sonicate het mengsel op ijs met een 3,8 millimeter probe sonicator bij 30 watts gedurende 30 minuten, waarbij het mengsel gedurende het hele proces tussen de vier en 20 °C wordt gehouden.

Centrifugeer de resulterende liposomale nanodeeltjessuspensie bij 4,000 G gedurende 10 minuten. Verwijder het pellet en was de liposomen met PBS met behulp van een centrifugeerfiltereenheid met een MWCO van 100 kilodalton bij 4000 G. Overbreng de geconcentreerde liposomen vanuit de bovenkamer naar een nieuwe centrifugebuis. De liposomen kunnen tot een week in PBS in een koelkast worden bewaard.

Voer dynamische lichtverstrooiing uit op een mengsel van 50 µL van de gezuiverde liposoomsuspensie en 950 µL PBS. Meet de partikelgrootte en bepaal de grootteverdeling. Om de radiolabelingsprocedure te starten, brengt u het benodigde volume gezuiverde liposomen en PBS over in een buisje van 1,5 mL om twee milligram lipiden te verkrijgen.

Voeg hieraan één millicurie zirconium-89-oxalaat toe voor een eindvolume van 100 µL en een pH van 6,9 tot 7,1. Roer het mengsel twee uur lang bij 37 °C. Verwijder vervolgens vrij zirconium-89 via centrifugale filtratie met een 100 kDa filtereenheid bij 4.000 ×g. Was het retentaat drie keer met steriele PBS bij 4.000 ×g. Verdun vervolgens het retentaat tot ongeveer drie microcurie per µL voor injectie.

Gebruik size-exclusion HPLC in combinatie met een stralingsdetector om de radiochemische zuiverheid van de radiogemarkerde liposomen te bepalen. Als de radiochemische zuiverheid lager is dan 95%, moet de dosis opnieuw worden geformuleerd. Gebruik dynamische lichtverstrooiing om te bevestigen dat zowel de partikelgrootte als de distributiewaarden vergelijkbaar zijn met die van de niet-radiogemarkerde liposomen.

Om de beeldvormingsprocedure te starten, injecteert u ongeveer 300 microcurie aan radiogemarkeerde liposomen in de staartвена van een gefixeerde melanoma-muis. Twee minuten na de injectie gebruikt u een insulinespuit met een 28 gauge naald om 10 tot 20 microliters bloed uit de staartvena van de muis te verzamelen. Overbreng het bloedmonster naar een vooraf gewogen telbuis.

Weeg het bloedmonster en meet de activiteit met een gammacounter. Bereken de radioactiviteitsconcentratie als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram. Verzamel en meet vijftien minuten na injectie op dezelfde wijze een ander bloedmonster.

Anestheseer vervolgens de muis door middel van toediening van 2% isofluraan en zuurstof via een neuskap. Neem één uur na de injectie een derde bloedmonster af en meet dit. Laat de muis daarna herstellen in een herstelkooi totdat de normale mobiliteit is teruggekeerd.

Verzamel aanvullende monsters vier, acht, 24 en 48 uur na de injectie. Laat de muis volledig herstellen tussen de injecties door. Huisvest de muis in een ruimte die is aangewezen voor dieren waaraan radioactieve materialen zijn toegediend.

Anestheseer de muis 24 of 48 uur na de liposoominjectie met 2% isofluraan en zuurstof. Plaats de muis op de buik op de bedtafel van een microPET-CT-scanner voor kleine dieren. Blijf 2% isofluraan en zuurstof toedienen via een neusmasker.

Breng veterinaire zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. Schuif vervolgens de scantafel in het instrument. Voer een statische PET-scan van het gehele lichaam uit gedurende 15 minuten met ten minste 50 miljoen coincidence-events, een energie van 250 tot 700 kiloelectronvolt en een coincidence-tijdsvenster van zes nanoseconden.

Voer vervolgens een CT-scan van vijf minuten uit met 120 rotatiestappen over 220 graden, met ongeveer 145 milliseconden per frame. Offer de muis direct na voltooiing van de scan op door verstikking met kooldioxide. Bevestig de dood door in de poot van het dier te knijpen en voer daarna een cervicale dislocatie uit.

Perfuseer de weefsels met PBS om het bloed te verwijderen en oogst de relevante weefselmonsters. Weeg de verzamelde weefsels en meet hun activiteit. Bereken de accumulatie van radiogemarkeerde liposomen in het weefsel als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram.

Bewaar het tumorweefsel in koud PBS. Voer ex vivo flowcytometrie en immunofluorescentie-imaging uit op het geoogste tumorweefsel om de accumulatie met betrekking tot celpopulaties te meten. PET/CT-imaging van tumor dragende muizen die waren geïnjecteerd met nanodeeltjes gelabeld met zirconium-89 toonde een significante accumulatie van nanodeeltjes in het tumorweefsel 24 uur na injectie aan.

De halfwaardetijd in het bloed van de nanodeeltjes werd bepaald op ongeveer 10 uur. Ex vivo biodistributiemetingen 24 uur na injectie waren consistent met de in vivo PET/CT-metingen. De accumulatie van nanodeeltjes werd vervolgens op enkelcelniveau onderzocht met immunovlekingstechnieken.

Flowcytometrie wees uit dat nanodeeltjes bij voorkeur accumuleerden in tumor-geassocieerde macrofagen. Immunofluorescentie-imaging van tumorstalen wees daarnaast op specifieke targeting van endotheelcellen door de nanodeeltjes. Deze techniek kan onderzoekers helpen bij het identificeren van veelbelovende nanomedicijnen voor klinische translatie.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Bij het radiolabellen van nanogeneesmiddelen is het belangrijk om strikte kwaliteitscontroles toe te passen. Door deze procedure te volgen, kunnen andere nanogeneesmiddelen, zoals nanoemulsies, polymere nanodeeltjes, micellen, antilichamen en antilichaamfragmenten, worden gelabeld om hun in vivo prestaties in tumor dragende muizen te meten.