Name: A Comprehensive Procedure voor het evalueren In Vivo Prestaties of Cancer Nanomedicines (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer een uitgebreide procedure om het in vivo gedrag van kankernanomedicijnen te evalueren bij muizen met tumoren. Deze methode beoordeelt accumulatie op systemisch, weefsel-, en subcellulair niveau om veelbelovende kandidaten voor klinische toepassing te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs. Helene Salmon en Miriam Merad van Icahn School of Medicine at Mount Sinai bedanken voor het verstrekken van de B16-F10-YFP cellen en voor hun deskundige advies over melanoom muismodellen. De auteurs danken verder de Animal Imaging Core Facility, de Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility en de Molecular Cytology Core Facility van Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) en P30 CA008748 (MSK Center Grant). De auteurs danken ook het Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) bij MSK voor hun financiële steun (T.R.).

De procedure bestaat uit de dubbele radioactieve en fluorescente labeling van nanodeeltjes, in vivo PET-CT-beeldvorming, ex vivo biodistributie metingen en ex vivo immunokleuring en flowcytometrie analyse. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 1. Voorbereiding van de Dual-gelabelde liposomen OPMERKING: Syngene B16 melanoma tumoren worden geïnduceerd door injectie van 300.000 B16-F10 cellen in de achterkant flanken van C57BL / 6 muizen onder narcose het inhaleren 2% -isoflurane bevattende zuurstof. Gebruik steriele reagentia en instrumenten steriel werkruimte tijdens de operatie. Na de operatie zorgvuldig te observeren de dieren tot hun herstel van anesthesie. Zet de dieren terug in hun kooien alleen wanneer ze volledig bewustzijn en mobiliteit te herwinnen. Huisvesten ze in steriele kamers voor dieren met xenogetransplanteerde tumoren. Tumoren met een groottevan 300 mm 3 zijn ideaal voor karakterisering van nanodeeltjes vanwege hun uitgesproken verhoogde permeabiliteit en retentie effecten (EPR), die nanodeeltjes accumulatie kan verhogen. De gedetailleerde protocollen worden hieronder gegeven. <ol><li> In een rondbodemkolf, los een mengsel van 20 mg lipiden in 2 ml chloroform dat 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phophocholine (DPPC), cholesterol, 1,2-sn disearoyl- -glycero- 3-fosfoethanolamine-poly (ethyleenglycol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoxamine (DSPE-DFO) 8, en 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonzuur ( DiIC12 [5] -DS) en molaire verhoudingen van 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% en 0,1% respectievelijk. Opmerking: Dit lipidepreparaat is zeer vergelijkbaar met de liposomale formulering van doxorubicine momenteel in de kliniek 2. De resulterende liposomen van onze procedure zal nauw bootsen de in vivo prestatie van de klinische nanomedicine. </li><li> Gebruik een rotatieverdamper het organische oplosmiddel te verwijderen en een dunne lipide film bij kamertemperatuur. Voeg 20 ml PBS en ultrasone trillingen gedurende 30 min tot liposomaal nanodeeltjes genereren door een 3,8-mm ultrasoonapparaat tip en een amplitude van 30 W, met voldoende koeling op ijs. </li><li> Centrifugeer het liposoom oplossing bij 4000 xg gedurende 10 min op de aggregaten van de nanodeeltjes met PBS middels centrifugale filtratie (molecuulgewicht cut-off (MWCO verwijderen en wassen: 100 kDa) om vrije lipiden en resterende organische oplosmiddel te verwijderen de liposomen concentraat stellen die. blijven in de bovenste kamer, en overbrengen naar een nieuwe buis. de liposomen kunnen in een koelkast in PBS worden bewaard tot 1 week voor de volgende stappen. </li><li> Voor kwaliteitscontrole, kenmerken de liposomen door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Specifiek, meng 50 pl liposomen met 950 gl PBS, en daarna het mengsel over in de dimensionering cuvette. Plaats de cuvette in de analyzer en meet het deeltjematen en hun grootteverdeling. De deeltjesgrootte en de grootteverdeling (polydispersiteitsindex (PDI)) naar verwachting 90 zijn - 120 nm en 0,1 - 0,2 respectievelijk. </li><li> Voor radiolabeling, meng de gezuiverde liposomen, overeenkomend met 2 mg lipiden in PBS bij een pH tussen 6,9 en 7,1 met 1 mCi 89 Zr-oxalaat bij 37 ° C gedurende 2 h in een 1,5 ml buis (totaal volume: ~ 100 ui). Verwijder de vrije, ongereageerde 89 Zr door centrifugale filtratie (MWCO = 100 kDa), zoals in stap 1,3. Was het retentaat met steriele PBS en vul het aan het gewenste volume. 95% - de radiochemische opbrengst moet 80 zijn. VOORZICHTIGHEID! Het werken met radioactieve stoffen is sterk gereguleerd. Instellingen moeten worden gecertificeerd en voorzien van de nodige faciliteiten, opleiding van personeel, en een strikte controle van de radioactiviteit gebruik. Onderzoekers moeten passende opleiding krijgen en draag persoonlijke beschermingsmiddelen en dosimetrie ringen / badges bij het hanteren van radioactiviteit. </li><li&gt; Bepaal de radiochemische zuiverheid van de radioactief gemerkte liposomen door grootte uitsluiting HPLC-radio, die typisch moet meer dan 98% 10. Radiochemische zuiverheid lager dan 95% zijn indicatief onvoldoende wassen in stap 1,5. </li><li> Na radiolabeling, bepalen de grootte van de nanodeeltjes door middel van dynamische lichtverstrooiing. De grootte en de PDI zullen naar verwachting binnen hetzelfde bereik als de metingen in stap 1.4 10. LET OP: Als radioactieve monsters niet zijn toegestaan in de flowcytometer of fluorescentie microscoop, kunnen niet-radioactieve nat Zr-oxalaat worden gebruikt om liposomen te labelen in stap 1.5. Deze niet-radioactieve liposomen dezelfde kenmerken als hun radioactieve analoga. Een voorstelling van deze procedure is gegeven in Figuur 2. </li></ol> 2. In vivo PET-CT-beeldvorming en Biodistribution van Dual-gelabelde liposomen <ol><li> Injecteer 100 ui van duaal-gelabelde liposomen wet ongeveer 300 uCi radioactiviteit in tegengehouden melanoma muizen (C57BL / 6, vrouwelijk, 10 - 16 weken oud) door hun staart aderen, ongeveer 10 mCi 89 Zr / kg lichaamsgewicht. </li><li> Om de halfwaardetijd te bepalen, trekt bloed uit de staartader van verdoofde dieren onder de 2% isofluraan-met zuurstof met behulp van 28-G insuline spuiten. Verzamel de bloed (10-20 ui) in vooraf gewogen buizen bij 2 min, 15 min, 1 uur, 4 uur, 8 uur, 24 uur en 48 uur na injectie. Weeg het bloed door verschil radioactiviteit te bepalen volgens een gammateller en bereken radioactiviteitsconcentratie als percentage geïnjecteerde dosis per gram (% ID / g). OPMERKING: Voer de procedure uit in een kamer uitgerust met een anesthesie-systeem, het herstel kooien, verwarming en een biohazard kap. Zorg ervoor dat de dieren volledig te herstellen en krijgen normaal mobiliteit na de procedure voor het overzetten van herstel kooien met kooien. Huis-tumordragende dieren aangewezen ruimten dieren toegediendradioactieve materialen. </li><li> 24 of 48 uur na de injectie van de liposomen, imago van de muizen in een klein dier microPET-CT-scanner 10. Leg de verdoofde dier horizontaal op zijn buik en houd het verdoofde. Dien 2% isofluraan-zuurstof via een neuskegel. Toepassing oogzalf om zijn ogen voor de scan om te voorkomen dat ze uitdrogen. </li><li> Voer een whole-body PET statische scan opname ten minste 50 miljoen samenvalt evenementen, met een duur van 15 minuten. Stel de energie en toeval timing raam op 350-700 keV en 6 ns, respectievelijk. Daarna, het uitvoeren van een 5-min computertomografie (CT) scan. Stel de röntgenbuis een spanning van 80 kV en een stroom van 500 uA; de CT-scan maakt gebruik van 120 rotatie stappen voor een totaal van 220 graden, met ongeveer 145 ms per frame 10. </li><li> Na de PET-CT-scan, onmiddellijk te offeren de muizen door kooldioxide stikken en bevestig de dood door pinching de poten van de dieren. Eenmaal bevestigd, uit te voeren cervicale dislocaties. </li><li> Verwijder het bloed in muisweefsels door eerst opensnijden van het rechteratrium en het injecteren van 20 ml PBS in de linker ventrikel, en vervolgens de relevante weefsels zoals tumoren, lever, milt, longen, nieren, spieren en andere 16 verzamelen. </li><li> Weeg de weefsels, de radioactiviteitsinhoud door gamma telling 8, 9 meet en berekent het weefsel radioactiviteit accumulatie als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram (% ID / g). </li></ol> 3. Ex Vivo flowcytometrie en Immunokleuring OPMERKING: Injecteer 100 ui fluorescerende liposomen in muizen melanoma via de staartader in een dosis van 0,5 mg kleurstof per kg lichaamsgewicht. Als radioactieve monsters niet zijn toegestaan ​​in de flowcytometer en fluorescentie microscoop, moeten niet-radioactieve liposomen worden gebruikt. <ol><li> Offer de muizen 24 uur na injectie, zoals in stap 2,5, en het verzamelen van de tumoren, die moet worden opgeslagen in koude PBS. </li><li> Voor flowcytometrie als volgt te werk 17: <ol><li> Bereid een enzym cocktail bestaande uit een mengsel van gezuiverd collagenase I en II (4 U / ml), hyaluronidase (60 U / ml) en DNase I (60 U / ml) in flowcytometrie buffer (PBS met 0,5% BSA en 1 mM EDTA). </li><li> Meng 100 mg tumorweefsel met 200 pi enzym cocktail buffer in een 1,5 ml tube en snijd het weefsel in kleine stukjes met fijne schaar. Voeg nog 1,3 mL enzymcocktail in de buis en de inhoud ervan over een 6-wells plaat. </li><li> Schud de 6-well plaat op een horizontale schudinrichting geplaatst in een 37 ° C oven gedurende 60 minuten bij 60 rpm. </li><li> Was het weefsel homogenaat met flowcytometrie buffer 3 keer om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. </li><li> Vlekken op de cellen met een cocktail van antilichamen die specifiek zijn biomarkers waaronder CD45, CD11b, Ly6C, CD 11 c,CD64, CD3, MHCII en CD31 (1: 200 verdunning voor antilichamen kloon zijn verschaft in de materialen spreadsheet). Identificeer relevante celtypen en het bepalen van hun gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van DiIC12 (5) -DS in elke cel populatie met een passende flowcytometrie analyse software. </li></ol></li><li> Voor immunokleuring als volgt te werk: <ol><li> Plaats een tumor in een cassette gevuld met een optimale snij-medium (OCT) en bevriezen op droog ijs. </li><li> Maak 6-um ingevroren secties van tumorweefsel en leg ze op histologie glasplaatjes; de onderdelen moeten op de grootste doorsneden van de tumor, waarbij de meest representatieve gegevens over het weefsel verschaffen. </li><li> Vlekken op de biomarkers (bv CD31 voor endotheliale cellen) van belang met de overeenkomstige antilichamen (bijvoorbeeld anti-CD31, kloon MEC13.3). Bevestig de secties met paraformaldehyde; blokkeren met serum overeenkomen met de soorten oorsprong van de secundaire antilichamen; incubat met primaire antilichamen gedurende 12 uur bij 4 ° C en daarna met secundaire antilichamen gedurende 2 uur; en tot slot, wassen met PBS en bedek met dekglaasjes. Afbeelding de gekleurde dia&#39;s met een Leica rechtopstaande confocale microscoop SP5 13, 16. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxil%28R%29--the+first+FDA-approved+nano-drug%3A+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> J Control Release. 160, 117-134 (2012).</li>
<li>Green, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abraxane%2C+a+novel+Cremophor-free%2C+albumin-bound+particle+form+of+paclitaxel+for+the+treatment+of+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer.</a> Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).</li>
<li>Juliano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+is+the+wave+cresting%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: is the wave cresting?</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 171-172 (2013).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bankruptcy+filing+worries+developers+of+nanoparticle+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs.</a> Nature. 533, 304-305 (2016).</li>
<li>Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines%3A+so+many+papers+and+so+few+drugs%21%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs!</a> Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).</li>
<li>Dunphy, M. P., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiopharmaceuticals+in+preclinical+and+clinical+development+for+monitoring+of+therapy+with+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET.</a> J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+of+Tumor-Associated+Macrophages+with+89Zr-Labeled+High-Density+Lipoprotein+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles.</a> J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+labeling+strategy+for+in+vivo+PET+and+near-infrared+fluorescence+imaging+of+nanoparticle+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting.</a> J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/ncomms11838">Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy.</a> Nature communications. , (2016).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+macrophage+proliferation+suppresses+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+advances%22%5BJournal%5D)">Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation.</a> Science advances. , (2015).</li>
<li>Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticles+for+the+accurate+detection+of+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).</li>
<li>Gianella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+nanoemulsion+platform+for+imaging+guided+therapy+evaluated+in+experimental+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer.</a> ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Activation+of+CD103%28%2B%29+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44, 924-938 (2016).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+PET+Imaging+of+HDL+in+Multiple+Atherosclerosis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).</li>
<li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature communications. 5, 3065(2014).</li>
<li>Carney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+PET+Imaging+of+PARP1+Expression+in+Glioblastoma+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models.</a> Mol Imaging Biol. , (2015).</li>
<li>Salinas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioiodinated+PARP1+tracers+for+glioblastoma+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging.</a> EJNMMI Res. 5, 123(2015).</li>
<li>Carlucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Modality+Optical%2FPET+Imaging+of+PARP1+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma.</a> Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+screening+of+a+nanoparticle+library+improves+atherosclerosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).</li>
<li>Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antibody therapy of cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12, 278-287 (2012).</li>
<li>Goodwill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-space+MPI%3A+magnetic+nanoparticles+for+safe+medical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging.</a> Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthulling te doen.

Kritische stappen in het protocol: De hoge kwaliteit van duaal-gelabelde liposomen is de sleutel voor het produceren van consistente resultaten gedurende een lange periode. Gratis fluorescerende kleurstoffen of 89 Zr ionen kunnen totaal verschillende targeting patronen te genereren en moet volledig worden verwijderd tijdens de zuiveringsstap. Bovendien, als het immuunsysteem experimentele kanker nanomedicine prestaties aanzienlijk beïnvloedt het gebruik van immuuncompetente muismodel...

Nanogeneeskunde verschuift het paradigma van de behandeling van kanker ontwikkeling 1. Geïnspireerd door de enorme klinische impact van eerdere kanker nanomedicijnen, zoals liposome- en albumine-based nanotherapies 2, 3, hebben veel nieuwe formuleringen geproduceerd in het afgelopen decennium. Uit recente analyses van de eerste klinische succes van deze kanker nanomedicijnen geven aan dat slechts enkele daarvan zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik 4, 5. Een belangrijk obstakel voor de klinische toepassing van nieuwe kanker nanomedicijnen is hun beperkte verbetering van de therapeutische index vergeleken met de directe toediening van het vrije therapeutische verbindingen 6. Als zodanig nauwkeurige evaluatie van de in vivo prestatie van nanomedicijnen op systemische, weefsel en cellulaire niveaus in preklinische diermodellen essentieel identify mensen met een optimale therapeutische indices voor toekomstige klinische vertaling. Nanomaterialen kunnen radioactief gemerkte voor de kwantitatieve karakterisering in levende dieren met een positron emissie tomografie (PET) beeldvorming, die uitstekende gevoeligheid en reproduceerbaarheid van alle klinische beeldvormende modaliteiten 7 heeft zijn. Bijvoorbeeld 89 Zr-gelabelde langdurig circulerende nanomedicijnen zijn gekarakteriseerd in muismodellen van kanker 8, 9, 10, en in andere ziektemodellen 11. Bovendien kan de bloed halfwaardetijd en biodistributie van het nanogeneesmiddelen uitgebreid geëvalueerd door ex vivo radioactiviteit gemeten in afzonderlijke weefsels 8. Daarom radioactief zorgt voor de kwantitatieve evaluatie van nanomedicijnen bij systemische en weefsel niveaus. Belangrijker radiolabeled nanomedicijnen algemeen niet bij de enkele-cel of subcellulaire niveaus kan worden geanalyseerd door de beperkte ruimtelijke resolutie van het radioactieve signaal. Daarom fluorescentielabelling blijkt een complementaire modaliteit voor de evaluatie van nanodeeltjes met optische beeldvormingstechnieken zoals flowcytometrie en fluorescentie microscopie 12 zijn. Hiertoe kunnen nanodeeltjes gemerkt met radio-isotopen en fluorescerende labels kwantitatief in vivo worden beoordeeld door nucleaire beeldvorming en ex vivo door telling van radioactiviteit, en ze kunnen ook uitgebreid worden gekarakteriseerd op cellulair niveau optische beeldvorming. Eerder hebben we modulaire procedures ontwikkeld om radioactieve en fluorescerende labels nemen in verschillende nanodeeltjes, waaronder high-density lipoproteïne (HDL) 11 liposomen 9, 10, polymere nanodeeltjes, antilichaamfragmenten en nanoemulsions 10, 13. Deze gelabelde nanodeeltjes hebben geleid tot kwantitatieve karakterisering in relevante diermodellen op verschillende niveaus, waarbij de optimalisatie van deze nanomaterialen geleid voor hun specifieke toepassingen. In de huidige studie, het doel is liposomaal nanodeeltjes the gebruiken meest gevestigde nanomedicine platform 14 -als voorbeeld uitgebreide procedures tonen een duaal-gelabelde nanodeeltjes genereren en karakteriseren grondig in een klassieke syngene melanoom B16-F10 muismodel 15 . Uit de resultaten, we zijn ervan overtuigd dat deze karakterisering van nanodeeltjes aanpak kan worden aangepast aan andere kanker nanomedicijnen in relevante muismodellen te evalueren.

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Home made</td><td>110634</td><td>Perez-Medina et al., JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC met 2 LC-10AT pompen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>89Zr-oxalaat</td><td>MSKCC</td><td>Gesynthetiseerd in eigen beheer</td><td>TR19/9 variabele bundel cyclotron (Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>Gammateller</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometrie</td><td>BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>Elke multi-parametrische flowcytometrie analyzer zou volstaan</td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP melanoomcellen</td><td>Home made</td><td>N/A</td><td>Salmon et al., Immunity, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3) zonder fluorfoor</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

a comprehensive procedure voor het evalueren<em&gt; in vivo</em&gt; prestaties of cancer nanomedicines

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Geïnspireerd op het succes van eerdere kanker nanomedicijnen in de kliniek hebben onderzoekers een groot aantal nieuwe formuleringen in het afgelopen decennium gegenereerd. Echter, slechts een klein aantal van nanomedicijnen goedgekeurd voor klinisch gebruik, terwijl de meerderheid van nanomedicijnen onder klinische ontwikkeling teleurstellende resultaten hebben opgeleverd. Een belangrijk obstakel voor de succesvolle klinische toepassing van nieuwe kanker nanomedicijnen is het ontbreken van een duidelijk inzicht de in vivo prestatie. Dit artikel heeft een strenge procedure voor het in vivo gedrag van nanomedicijnen in tumordragende muizen systemische, weefsel, eencellige en subcellulaire niveaus karakteriseren via de integratie van positron emissie tomografie computed tomography (PET-CT), radioactiviteit kwantificatiemethoden flowcytometrie en fluorescentie microscopie. Met deze aanpak kunnen onderzoekers nauwkeurig evalueren roman nanoschaal formuleringen in de relevante muismodellen van Cancer. Deze protocollen kunnen de mogelijkheid om de meest veelbelovende kanker nanomedicijnen identificeren met een hoog translationeel potentiële of om te helpen bij de optimalisatie van kanker nanomedicijnen voor toekomstige vertaling hebben.

Figuur 1 toont een overzicht van de procedure. Figuur 2 toont schematisch de syntheseprocedure van de duaal-gelabelde liposomen in stap 1 10 beschreven. Figuur 3 toont een representatief PET-CT beeld (figuur 3a), radioactieve kwantificering van PET imaging (figuur 3b), bloed halfwaardetijd (figuur 3c) en biodistributie (figuur 3d) van radioactieve...

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Het algemene doel van deze procedure is om het in vivo gedrag van kanker-nanogeneesmiddelen te evalueren op systemisch niveau, weefselniveau, enkelcelniveau en subcellulair niveau in immuuncompetente muizen met tumoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de kernvraag binnen het veld van de kanker-nanogeneeskunde: Hoe accumuleren nanogeneesmiddelen kwantitatief in verschillende weefsels van levende dieren gedurende een bepaalde tijd?Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze dubbele labelingsbenadering in vivo karakterisering van nanogeneesmiddelen mogelijk maakt, van het macroscopische tot het microscopische niveau. We kiezen liposomen als voorbeeld om onze procedure te demonstreren, omdat liposomen momenteel in klinisch gebruik zijn en bovendien een veelvoorkomend platform vormen voor experimentele nanogeneesmiddelen. Om de procedure te starten, lost u 20 milligram van een lipidenmengsel op, dat 0,1% molaire fractie van een lipofiele kationische fluorescente kleurstof bevat, in twee milliliter chloroform.Droog vervolgens de lipiden met een rotatieverdamper. Voeg 20 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing toe aan de gedroogde lipiden. Sonicate het mengsel op ijs met een 3,8 millimeter probe sonicator bij 30 watts gedurende 30 minuten, waarbij het mengsel gedurende het hele proces tussen de vier en 20 °C wordt gehouden.Centrifugeer de resulterende liposomale nanodeeltjessuspensie bij 4,000 G gedurende 10 minuten. Verwijder het pellet en was de liposomen met PBS met behulp van een centrifugeerfiltereenheid met een MWCO van 100 kilodalton bij 4000 G. Overbreng de geconcentreerde liposomen vanuit de bovenkamer naar een nieuwe centrifugebuis. De liposomen kunnen tot een week in PBS in een koelkast worden bewaard.Voer dynamische lichtverstrooiing uit op een mengsel van 50 µL van de gezuiverde liposoomsuspensie en 950 µL PBS. Meet de partikelgrootte en bepaal de grootteverdeling. Om de radiolabelingsprocedure te starten, brengt u het benodigde volume gezuiverde liposomen en PBS over in een buisje van 1,5 mL om twee milligram lipiden te verkrijgen.Voeg hieraan één millicurie zirconium-89-oxalaat toe voor een eindvolume van 100 µL en een pH van 6,9 tot 7,1. Roer het mengsel twee uur lang bij 37 °C. Verwijder vervolgens vrij zirconium-89 via centrifugale filtratie met een 100 kDa filtereenheid bij 4.000 ×g. Was het retentaat drie keer met steriele PBS bij 4.000 ×g. Verdun vervolgens het retentaat tot ongeveer drie microcurie per µL voor injectie.Gebruik size-exclusion HPLC in combinatie met een stralingsdetector om de radiochemische zuiverheid van de radiogemarkerde liposomen te bepalen. Als de radiochemische zuiverheid lager is dan 95%, moet de dosis opnieuw worden geformuleerd. Gebruik dynamische lichtverstrooiing om te bevestigen dat zowel de partikelgrootte als de distributiewaarden vergelijkbaar zijn met die van de niet-radiogemarkerde liposomen.Om de beeldvormingsprocedure te starten, injecteert u ongeveer 300 microcurie aan radiogemarkeerde liposomen in de staartвена van een gefixeerde melanoma-muis. Twee minuten na de injectie gebruikt u een insulinespuit met een 28 gauge naald om 10 tot 20 microliters bloed uit de staartvena van de muis te verzamelen. Overbreng het bloedmonster naar een vooraf gewogen telbuis.Weeg het bloedmonster en meet de activiteit met een gammacounter. Bereken de radioactiviteitsconcentratie als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram. Verzamel en meet vijftien minuten na injectie op dezelfde wijze een ander bloedmonster.Anestheseer vervolgens de muis door middel van toediening van 2% isofluraan en zuurstof via een neuskap. Neem één uur na de injectie een derde bloedmonster af en meet dit. Laat de muis daarna herstellen in een herstelkooi totdat de normale mobiliteit is teruggekeerd.Verzamel aanvullende monsters vier, acht, 24 en 48 uur na de injectie. Laat de muis volledig herstellen tussen de injecties door. Huisvest de muis in een ruimte die is aangewezen voor dieren waaraan radioactieve materialen zijn toegediend.Anestheseer de muis 24 of 48 uur na de liposoominjectie met 2% isofluraan en zuurstof. Plaats de muis op de buik op de bedtafel van een microPET-CT-scanner voor kleine dieren. Blijf 2% isofluraan en zuurstof toedienen via een neusmasker.Breng veterinaire zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. Schuif vervolgens de scantafel in het instrument. Voer een statische PET-scan van het gehele lichaam uit gedurende 15 minuten met ten minste 50 miljoen coincidence-events, een energie van 250 tot 700 kiloelectronvolt en een coincidence-tijdsvenster van zes nanoseconden.Voer vervolgens een CT-scan van vijf minuten uit met 120 rotatiestappen over 220 graden, met ongeveer 145 milliseconden per frame. Offer de muis direct na voltooiing van de scan op door verstikking met kooldioxide. Bevestig de dood door in de poot van het dier te knijpen en voer daarna een cervicale dislocatie uit.Perfuseer de weefsels met PBS om het bloed te verwijderen en oogst de relevante weefselmonsters. Weeg de verzamelde weefsels en meet hun activiteit. Bereken de accumulatie van radiogemarkeerde liposomen in het weefsel als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram.Bewaar het tumorweefsel in koud PBS. Voer ex vivo flowcytometrie en immunofluorescentie-imaging uit op het geoogste tumorweefsel om de accumulatie met betrekking tot celpopulaties te meten. PET/CT-imaging van tumor dragende muizen die waren geïnjecteerd met nanodeeltjes gelabeld met zirconium-89 toonde een significante accumulatie van nanodeeltjes in het tumorweefsel 24 uur na injectie aan.De halfwaardetijd in het bloed van de nanodeeltjes werd bepaald op ongeveer 10 uur. Ex vivo biodistributiemetingen 24 uur na injectie waren consistent met de in vivo PET/CT-metingen. De accumulatie van nanodeeltjes werd vervolgens op enkelcelniveau onderzocht met immunovlekingstechnieken.Flowcytometrie wees uit dat nanodeeltjes bij voorkeur accumuleerden in tumor-geassocieerde macrofagen. Immunofluorescentie-imaging van tumorstalen wees daarnaast op specifieke targeting van endotheelcellen door de nanodeeltjes. Deze techniek kan onderzoekers helpen bij het identificeren van veelbelovende nanomedicijnen voor klinische translatie.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Bij het radiolabellen van nanogeneesmiddelen is het belangrijk om strikte kwaliteitscontroles toe te passen. Door deze procedure te volgen, kunnen andere nanogeneesmiddelen, zoals nanoemulsies, polymere nanodeeltjes, micellen, antilichamen en antilichaamfragmenten, worden gelabeld om hun in vivo prestaties in tumor dragende muizen te meten.

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vivo-performance-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

BioImaging methoden die worden gebruikt om cellen biodistributie van nanodeeltjes te beoordelen zijn van toepassing voor therapeutische en diagnostische controle van nanoformulated verbindingen. De werkwijzen die hierin beschreven zijn gevoelig en specifiek wanneer beoordeeld door histologische coregistration. De methodieken voor een translationeel weg van knaagdier voor de menselijke toepassingen.

Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Een voorbeeld van een nano geneesmiddel op basis polymalic zuur gepresenteerd naar het rationele ontwerp van gepersonaliseerde geneeskunde die voor kanker. Het beschrijft de synthese van een nano geneesmiddel Her2-positieve menselijke borst kanker in naakt muizen.

Polymalic Acid-gebaseerde Nano Biopolymeren voor Targeting van Multiple Tumor Markers: een kans voor Gepersonaliseerde Geneeskunde?

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrie en Microscopie

Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor de nauwkeurige afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een geavanceerd leverings- en monitoringsysteem.

In vitro en in vivo levering van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een op maat gemaakt leveringssysteem

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Hier beschrijven we het protocol voor in vivo toediening van magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die RNA-oligomeren vervoeren naar uitgezaaide borstkanker in diermodellen, waardoor een klinisch haalbare benadering wordt geboden voor de therapeutische uitschakeling van oncogene nucleïnezuren.

Monitoring van de accumulatie van nanodrugs bij borstkankermetastasen bij muizen

Leer een uitgebreide procedure om het in vivo gedrag van kankernanomedicijnen te evalueren bij muizen met tumoren. Deze methode beoordeelt accumulatie op systemisch, weefsel-, en subcellulair niveau om veelbelovende kandidaten voor klinische toepassing te identificeren.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren

Meer video's verkennen