Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire

Het algemene doel van dit protocol is om een multidimensionale beoordeling te verschaffen van hoe verbindingen de overleving van M.tuberculosis in menselijke macrofagen beïnvloeden. Deze methode is gebaseerd op een luciferase-gebaseerde effectiviteitsassay. Wanneer dit wordt gecombineerd met cytotoxiciteit, kan een MIC-assay nuttige informatie leveren voor de modificatie van HIT-verbindingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen TB.

Het belangrijkste voordeel van onze methode is dat het tijd- en arbeidsbesparend is. Hiermee wordt een CFU-assay (kolonievormende eenheden) vervangen door een assay op basis van luciferase. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben met de consistentie bij handmatig pipetteren in vergelijking met automatisering.

Een consistente pipetteertechniek is essentieel. Kweek THP1-cellen in RPMI in volledig medium, waarbij tussen de passages een celdichtheid van 0,2 tot één miljoen cellen per milliliter medium wordt gehandhaafd.

Gebruik een spectrofotometer om de OD600 van een actief groeiende bacteriële suspensie te meten. Bereken vervolgens de bacteriële dichtheid met de conversiefactor waarbij 0,1 OD600 gelijk staat aan 3 × 10⁷ bacteriën per milliliter. Pipetteer voldoende bacteriën voor een MOI van 10:1 in een nieuwe centrifugebuis.

Pelleteer vervolgens de bacteriën bij 3,000 ×g gedurende 10 minuten. Om de bacteriën te opsoniseren, voegt u 50 µL menselijk serum toe aan 450 µL RPMI 1640 en gebruikt u dit om de bacteriële pellet te resuspenderen tot een dichtheid van 1 × 10⁸ bacteriën per 500 µL medium. Laat het mengsel 30 minuten incuberen bij 37 °C.

Bepaal vervolgens met een hemocytometer en een omgekeerde microscoop de dichtheid van de THP1-celcultuur. Pellet de cellen daarna in steriele centrifugebuisjes bij 100 ×g bij 37 °C gedurende 10 minuten. Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in RPMI in compleet medium op een dichtheid van 1.000.000 cellen per milliliter.

Voeg PMA toe tot een eindconcentratie van 40 nanograms per milliliter. Dit is het differentiatiemengsel. Combineer geopsoniseerde M.tuberculosis met het THP1-differentiatiemengsel bij een MOI van 10 op 1.

En verdeel het uiteindelijke mengsel in aliquots van 100 µL per putje in een witte 96-wells plaat met een platte bodem. Laat de differentiatie en infectie vervolgens incuberen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende de nacht. Gebruik de volgende dag 100 µL RPMI om de putjes twee keer te wassen.

Voeg vervolgens verbindingen toe die zijn verdund tot de gewenste concentraties en RPMI in volledig medium. Incubeer de platen gedurende drie dagen. Houd bij het gebruik van multikanalpipetten rekening met een langzame en gelijkmatige beweging van de plunjer en plaats de pipetpunten altijd op dezelfde plek in elke put om verstoring van de THP1-cellen te minimaliseren.

Zuig na de incubatie het medium uit de wells en voeg 50 µL luciferase-assay-reagens toe aan elke well. Sluit de platen vervolgens af met transparante zelfklevende plaatsealers. Incubeer de platen vijf minuten bij 22 °C en gebruik daarna een luminometer om een uitlezing van één seconde per well te verkrijgen.

Om THP1-cellen te differentiëren, verdeelt u, na het bereiden van het differentiatiemengsel zoals eerder in deze video gedemonstreerd, 100 µL van het differentiatiemengsel over elke put van een doorzichtige 96-wellplaat met cellen. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Aspireer de volgende dag het medium uit de putten en was deze twee keer met RPMI 1640.

Voeg 100 µL van de verbindingen, verdund in incompleet RPMI, toe aan de wells. Incubeer de cellen vervolgens gedurende drie dagen. Los 0,5 g MTT op in 100 mL PBS om een stamoplossing van 5 mg/mL te maken.

Steriliseer de oplossing vervolgens door filtratie. Twee en een halve uur voor het einde van de driedaagse incubatieperiode wordt er 25 µL MTT-oplossing aan elke put met cellen toegevoegd, waarna de incubatieperiode wordt voltooid. Bereid 50% dimethylformamide of DMF door 250 milliliters DMF te mengen met 250 milliliters gedeïoniseerd water.

Bereid de MTT-extractiebuffer als volgt. Doe 100 gram SDS in een fles van 500 milliliter en voeg 300 milliliter 50%DMF toe. Verwarm lichtjes om het SDS op te lossen.

Voeg 10 milliliters puur azijnzuur en 12,5 milliliters één molaire zoutzuur toe. Vul het flesje vervolgens aan met 50%DMF tot aan de markering van 500 milliliters. Voeg aan het einde van de behandelingsperiode 100 microliters extractiebuffer toe aan elke put.

Incubeer het mengsel gedurende de nacht bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Lees de volgende dag de absorbentie af bij 570 nanometer. Om een resazurine-assay uit te voeren, wordt M.tuberculosis gekweekt in 7H9 ADST tot de mid-logfase.

Verdun de cultuur met 7H9 ADST tot een OD600 van 0,01. Gebruik 7H9 ADST om de verbindingen te verdunnen tot twee keer de testconcentraties. Pipetteer vervolgens 100 µL van elke verdunde verbinding in elke put van een transparante 96-wellsplaat.

Breng 100 µL van de verdunde bacteriële suspensie over naar elke put. Incubeer de platen vijf dagen lang bij 37 °C in een bevochtigde incubator. Los 10 mg resazurine op in 100 mL gedeïoniseerd water.

En steriliseer de oplossing door filtering. Voeg 30 µL resazurine-oplossing toe aan de wells. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 48 uur.

Bacteriële groei wordt aangegeven door een kleurverandering van blauw naar roze. Voer de kwantitatieve analyse uit volgens het tekstprotocol. Deze spreidingsplot toont de ruwe luminescentiegegevens, gemeten in relatieve luminescentie-eenheden, voor de behandeling van M.tuberculosis en THP1-cellen met verschillende concentraties rifampicine.

In deze grafiek worden de procentuele reductie en de luminescentie in behandelde wells vergeleken met onbehandelde wells. Rifampicine is in staat om 99,9% van de relatieve lichteenheden, of RLUs, van intracellulaire M. tuberculosis te reduceren bij een concentratie van 0,1 micrograms per milliliter. Dit is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde resultaten bepaald via CFU.

In deze figuur wordt de cytotoxiciteit geïllustreerd die wordt veroorzaakt door toenemende concentraties van G1-1H gebruikt in de MTT-assay. Concentraties van 10 en drie micromolair liggen duidelijk onder de IC 50-grenswaarde. Deze figuur toont de effecten van verschillende concentraties van het antibioticum apramycine op de resazurine-conversie door M.tuberculosis.

De MIC90 in bouillon lag tussen de 2,5 en vijf microgram per milliliter. Dit is iets hoger dan de eerder gepubliceerde waarde van 1,5 microgram per milliliter. Desalniettemin valt dit nog ruim binnen het acceptabele bereik.

Zoals hier wordt aangetoond, wordt verdamping significant bij alle experimenten met langere incubatietijden. Er moet daarom zorg worden gedragen voor een goede bevochtiging van de incubatoren om inconsistenties te voorkomen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts vier dagen betrouwbare intracellulaire gegevens opleveren.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met THP1-cellen en consequent te pipetteren indien men zonder automatisering werkt. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals high-content screening, worden gebruikt om vast te stellen of hit-verbindingen bacteriostatisch of bactericide zijn. Na de ontwikkeling heeft dit protocol de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van geneesmiddelenontwikkeling tegen tuberculose om de effectiviteit van verbindingen tegen MTB in menselijke macrofagen snel te beoordelen.

Vergeet niet dat het werken met microbacterium tuberculosis gevaarlijk is. Neem voorzorgsmaatregelen en gebruik de juiste apparatuur bij het hanteren van dit micro-organisme.