Name: Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer een modulair high-throughput screeningsysteem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit van verbindingen tegen intracellulaire Mycobacterium tuberculosis in humane macrofagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de BC Lung Association en Mitacs.

1. bacteriestam en groeimedium <ol><li> Voeg albumine dextrose en zout voorraadoplossing (ADS) door het oplossen van 25 g runderserumalbumine, 10,0 g dextrose en 4,05 g natriumchloride in 460 ml gedeioniseerd water. Filter-steriliseer de ADS en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Voeg 7H9 bouillon door toevoeging van 4,7 g 7H9 poeder en 2 ml glycerol en 900 ml gezuiverd water. Autoclaaf de 7H9 bouillon bij 121 ° C gedurende 10 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur alvorens. Maak 7H9ADST door toevoeging van 100 ml van ADS en 0,5 ml Tween80 tot 900 ml van 7H9 bouillon. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Weeg 50 mg kanamycine sulfaat en los op in 1 ml gedeïoniseerd water; de uiteindelijke concentratie 50 mg / ml. Filter-steriliseer en bewaar bij -20 ° C. Voeg 0,5 ml kanamycine voorraadoplossing per 1 liter 7H9ADST. Let op: dit medium moet vers worden gemaakt, zodat de schaal van de volumes op de juiste wijze in overeenstemming met de cultuur grootte. </li><li> Groeien M. tuberculosis in 7H9ADST aangevuld met kanamycine in staande cultuur. Schud de cultuur dagelijks en verdunnen voordat de OD600 bereikt 1,0 tot klonteren te voorkomen. LET OP: Het M. tuberculosis stam die is gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode werd H37Rv getransformeerd met pJAK2.A plasmide 12. pJAK2.A is een integratief plasmide gebaseerd op de pMV361 vector, die een hoog-niveau expressie van de vuurvlieg luciferasegen van de hsp60 promotor mogelijk maakt en kan worden geselecteerd met kanamycine. </li></ol> 2. THP-1 Medium en onderhoud <ol><li> Voeg 50 ml met warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 5 ml 200 mM L-glutamine en 500 ml RPMI 1640 met RPMI maken onvolledig medium (circa 10% FBS en 2 mM glutamine). </li><li> Onderhouden van een THP-1 celkweken volgens standaardprotocol 13. In het kort, groei THP-1-cellen in RPMI medium onvolledige terwijl een celdichtheid van 0,2-1.000.000 per ml medium tussen paswijzen. </li></ol> 3. High-throughput Intracellulaire Screening Met behulp van Luciferase uiten M. tuberculosis H37Rv <ol><li> Meet de extinctie van een actief groeiende bacteriesuspensie in een spectrofotometer bij een golflengte van 600 nm. Bereken de bacteriedichtheid met de conversiefactor van 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 bacteriën per ml. </li><li> Pipet niet voldoende bacteriën een multipliciteit van infectie (MOI) van 10: 1 in een nieuwe centrifugebuis. Pellet bij 3000 xg gedurende 10 min en zuig de vloeistof. Voeg 50 ul humaan serum tot 450 gl RPMI1640. Schaal het volume op waarden die geschikt zijn voor het experiment. </li><li> De bacteriën opsoniseren, resuspendeer de pellet in een dichtheid van 1 x 10 8 bacteriën per 500 pl RPMI 1640 dat 10% humaan serum. Laat het mengsel incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Bepaal de THP-1 celkweken dichtheid door tellen met een hemocytometer en een omgekeerde Micrpe. </li><li> Pellet de cellen in steriele centrifugebuizen bij 100 xg en 37 ° C gedurende 10 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in RPMI incomplete bij een dichtheid van 1 miljoen cellen per ml. Add forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) tot 40 ng / ml eindconcentratie. OPMERKING: Dit zal de differentiatie mix worden aangeduid. </li><li> Combineer geopsoniseerd M. tuberculosis met THP-1 differentiatie mengsel bij een MOI van 10: 1 en het laatste aliquot mix in 100 ul per putje in een 96 putjes vlakke bodem witte plaat. Regelmatig roer het mengsel tot uniformiteit. Laat de differentiatie en infectie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Was de putjes tweemaal met 100 pl RPMI elk. verbindingen verdund tot de gewenste concentraties in RPMI onvolledige toe en incubeer gedurende 3 dagen. </li><li> Zuig het medium van de putten. Voeg 50 pl luciferase testreagens aan elk putje. Dicht de platen met transparent kleefplaat sealers. Toestaan ​​5 min incubatie bij 22 ° C en vervolgens een uitlezing in een luminometer verkrijgen 1 s per putje. </li></ol> 4. Cytotoxiciteit analyse met behulp van een 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay 14 <ol><li> Differentiëren THP-1-cellen in RPMI onvolledige aangevuld met 40 ng / ml PMA in heldere platen met 96 putjes. Handhaaf een celdichtheid van 1.000.000 per ml monster en 100 ul per putje. Toestaan differentiatie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Zuig het medium van de putten en was ze tweemaal met RPMI 1640. verbindingen verdund in RPMI onvolledig aan de putjes toe. Incubeer gedurende 3 dagen. </li><li> Ontbinding 0,5 g MTT in 100 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) een voorraadoplossing van 5 mg / ml te maken. Steriel filter en bewaar bij -20 ° C, beschermd tegen licht; is het het beste om deze oplossing vers te maken. </li><li> 2,5 h before het einde van de 3-dagen incubatieperiode, voeg 25 ul MTT-oplossing aan elk putje en voltooi de incubatieperiode. </li><li> Bereid 50% N, N-dimethylformamide (DMF) door het mengen van 250 ml DMF met 250 ml gedeïoniseerd water. </li><li> Bereid MTT extractiebuffer als volgt: Weeg 100 g SDS in een 500 ml fles en voeg 300 ml 50% DMF. Breng een laag vuur, zodat de SDS op te lossen. Voeg 10 ml zuiver azijnzuur en 12,5 ml 1 M HCl. Vullen tot 500 mL markering met 50% DMF; de uiteindelijke samenstelling van de extractiebuffer is 50% DMF, 20% SDS, 2,5% azijnzuur en 2,5% 1 M zoutzuur. </li><li> Na afloop van de behandelingsperiode, voeg 100 pl extractiebuffer aan elk putje (verwarmd tot 45 ° C om alle kristallen op te lossen). Laat het mengsel gedurende een nacht incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Lees de absorptie bij 570 nm. OPMERKING: De cytotoxiciteit assay wordt het best uitgevoerd in parallel met een intracelular scherm met behulp van dezelfde batch en leeftijd van THP-1 cellen. </li></ol> 5. bouillon behulp Activity Analysis een Resazurin Assay 3 <ol><li> Groeien M. tuberculosis in 7H9ADST de mid-logfase (~ 0,5-0,8 OD 600). Verdun de cultuur met de 7H9ADST tot 0,01 OD 600. Verdun de verbindingen 7H9ADST het testen concentratie en hoeveelheid 100 pl van elk verdund 2x verbinding in elk putje. </li><li> Breng 100 pi van de verdunde bacteriële suspensie in elk putje. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator gedurende 5 dagen. Los 10 mg resazurine in 100 ml gedeïoniseerd water en steriel filter. </li><li> Voeg 30 ul van resazurin oplossing en het toezicht op de kleurverandering na 48 uur; bacteriegroei wordt aangegeven door een kleur conversie van blauw naar roze. Opmerking: Een kwantitatieve analyse kan worden uitgevoerd door het meten van ofwel de fluorescentie bij 590 nm met excitatie bij 530-560nm en de absorptie bij 570 nm en 600 nm 15. </li></ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report+2015%22">Global tuberculosis report 2015</a>. , WHO. (2016).</li>
<li>USFDA. FDA news realease. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm">http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm</a> (2012).</li>
<li>Yajko, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determining+MICs+of+antimicrobial+agents+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).</li>
<li>Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+screening-based+identification+of+inhibitors+against+the+intraphagosomal+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1, 57(2010).</li>
<li>Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoevasion+and+immunosuppression+of+the+macrophage+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis.</a> Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+drug+combinations+for+tuberculosis+therapy+identified+by+a+novel+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).</li>
<li>Lam, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitazoxanide+stimulates+autophagy+and+inhibits+mTORC1+signaling+and+intracellular+proliferation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Intracellular+Screen+for+New+Compounds+Able+To+Inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+Growth+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62, 158-165 (2009).</li>
<li>ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx</a> (2016).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+and+further+development+of+a+precise+and+rapid+dye+method+for+measuring+cell+growth%2Fcell+kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.</a> J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/PI-DAL1025-1100_TI%20alamarBlue%20Rev%201.1.pdf">AlamarBlue assay</a>. , Invitrogen. (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handbook+of+anti-tuberculosis+agents.+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction.</a> Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Cell+Viability+Assays%22">Cell Viability Assays</a>. , (2004).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+apramycin+in+murine+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of apramycin in murine infection models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).</li>
<li>Ballell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+open-source+drug+discovery%3A+177+small-molecule+leads+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis.</a> ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).</li>
<li>Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18752626">Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice.</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).</li>
<li>Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+protein+tyrosine+phosphatase+%28PtpA%29+excludes+host+vacuolar-H%2B-ATPase+to+inhibit+phagosome+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).</li>
<li>Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+virulence+is+mediated+by+PtpA+dephosphorylation+of+human+vacuolar+protein+sorting+33B%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B.</a> Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://edepot.wur.nl/374646">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> J Vis Exp. , e51960(2014).</li>
<li>Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+protein+C3+binding+to+Mycobacterium+tuberculosis+is+initiated+by+the+classical+pathway+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid.</a> Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria.</a> PLoS One. 5, e10777(2010).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. , e51114(2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Q203%2C+a+potent+clinical+candidate+for+the+treatment+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis.</a> Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen voor dit werk.

Het doel van dit onderzoek was om een eenvoudige en kosteneffectieve HTS methode met behulp van een menselijke intracellulaire infectie model voor M. tuberculosis te creëren. Tuberculose is een menselijke ziekte gekenmerkt door de infectie van alveolaire macrofagen van M. tuberculosis. Als gevolg van bioveiligheid kwesties, heeft het onderzoek met biologische modellen van zowel de bacterie en de gastheercellen zijn gebruikt in het verleden. Er is echter aangetoond dat het gebruik van surrogaat bacterië...

Mycobacterium tuberculosis, de verwekker van tuberculose (TB), is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Geneesmiddel- gevoelige TB is een behandelbare ziekte die meerdere antibiotica gedurende 6 maanden vereist. Ondanks dat het een behandelbare ziekte, werd TB sterfte geschat op 1,5 miljoen in 2015 1. In de afgelopen 10 jaar zijn er zijn toenemende bezorgdheid over de prevalentie van resistente M. tuberculosis. Multiresistente tuberculose (MDR-TB) wordt gedefinieerd als tuberculose die resistent is tegen ten minste isoniazide (INH) en rifampicine (RMP), en de meeste MDR-TB-stammen zijn ook bestand tegen tweedelijns tbc selecteren, dus beperkt behandelingsmogelijkheden . De effecten van geneesmiddelresistentie maken een grotere uitdaging voor de behandeling van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntievirus (HIV); 400.000 patiënten wereldwijd overleden aan HIV-geassocieerde TB in 2015 1. Teleurstellend, de Amerikaanse Food and Drug Administrantsoen heeft goedgekeurd slechts één nieuwe TB-geneesmiddelen tegen MDR-TB, Bedaquiline, in de afgelopen 40 jaar 2. Vooruitgang in het vinden van betere en kortere TB therapieën zijn dringend nodig om voorop te blijven in de strijd tegen tbc en MDR-TB. Traditioneel worden TB drug screens uitgevoerd onder in vitro kweekomstandigheden in groeimedium, waarbij verbindingen worden toegevoegd aan een groeiende kweek en hun doeltreffendheid bij het uitroeien van de micro-organismen wordt bepaald door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op vast medium. Zoals CFU tellingen zijn arbeidsintensief, tijdrovend en kostbaar zijn verschillende indirecte methoden ontwikkeld om dit probleem te verlichten. Dergelijke werkwijzen omvatten de Alamar Blue assay levensvatbaarheid 3, de bepaling van fluorescentie 4 van groen fluorescent eiwit (GFP) of luminescentie 5 van luciferase-expressie bacteriën, en de schatting van de totale adenosine trifosfaat (ATP) 6, 7. Typische TB wordt gekenmerkt door een M. tuberculosis-infectie van de longen, waar de bacteriën bevinden en repliceren in de phagosomes van alveolaire macrofagen 8. De eenvoudige bouillon fenotypische scherm kan extracellulaire pathogenen te passen; Echter, in het historisch perspectief, sloeg verbindingen tegen M. tuberculosis geïdentificeerd met behulp van deze methode vaak niet om te voldoen aan de verwachtingen tijdens downstream validatie stappen in modellen van infectie. Wij stellen voor dat TB drug wordt het best uitgevoerd in een intracellulaire gastheercel infectie model. Toch intracellulaire modellen beschikken over een groot aantal technologische en biologische barrières voor high-throughput screening (HTS) ontwikkeling. Een grote hindernis is de complexiteit van het infectieproces, geïllustreerd door tal van stappen en de uitgebreide verwijdering van extracellulaire bacteriën door middel van in-tussen wassen. Een tweede belangrijke horde is de lange tijd aan het opnieuwquirements, de groei detectie Gewoonlijk wordt hierbij CFU rekenen op kweekplaten, is een proces dat meer dan 3 weken in beslag neemt. Een oplossing voor CFU tellingen vervangen is door geautomatiseerde fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende bacteriën. Echter, deze oplossing vereist een initiële investering in apparatuur die buiten het bereik van vele onderzoekslaboratoria. Een eenvoudige, goedkope en ziekte-relevante HTS methode zou sterk verbeteren het geneesmiddel ontdekkingsproces. In deze studie rapporteren we een nieuwe, modulaire HTS systeem dat is gericht op een snelle en zeer schaalbaar, zuinige, assay voor de bepaling van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire M. tuberculosis. Dit systeem bestaat uit drie modules: (i) intracellulair, (ii) cytotoxiciteit en (iii) in bouillon assays. De gecombineerde eindresultaat geeft een uitgebreide beschrijving van de verbinding eigenschappen, aanvullende informatie over de mogelijke werkingsmechanismen. dit screening systeem is gebruikt in verscheidene projecten verschillende samengestelde bibliotheken die werkingsmechanisme targeten, waaronder de analyse van geneesmiddel synergie 9, de stimulering van autofagie 10, en de remming van M. tuberculosis -secreted virulentiefactor (ongepubliceerd). Verbindingen van onbekende werkingsmechanisme hebben ook onderzocht 11. Een aangepaste versie van deze methode werd ook door onze industriële partner aangenomen als de primaire screening methode om nieuwe verbindingen te identificeren tegen intracellulaire M. tuberculosis 11.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>Albumine, bovien pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>kanamycinsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide (DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hydrochloorzuur (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-wells wit plaat met platte bodem</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95-wells doorzichtige plaat met platte bodem</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Transparante plaatsealer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>Microplaatspectrofotometer</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>luminometer</td><td>Applied Biosystems</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose (TB), is een leidende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Met de toegenomen verspreiding van multi-drug resistente TB (MDR-TB) is er een reële urgentie om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen tegen M. tuberculosis infecties. Traditioneel worden verbindingen geëvalueerd op basis van hun antibacteriële activiteit onder in vitro groeicondities in bouillon; echter, resultaten zijn vaak misleidend voor intracellulaire pathogenen zoals M. tuberculosis omdat de fenotypische screeningcondities in bouillon aanzienlijk verschillen van de werkelijke ziektecondities in het menselijk lichaam. Het screenen van remmers die werken binnen macrofagen is traditioneel moeilijk geweest vanwege de complexiteit, variabiliteit in infectie en langzame replicatiesnelheid van M. tuberculosis. In deze studie rapporteren we een nieuwe aanpak om snel de effectiviteit van verbindingen op de levensvatbaarheid van M. tuberculosis in een macrofaaginfectiemodel te beoordelen. Door een combinatie van een cytotoxiciteitstest en een in-bouillon M. tuberculosis levensvatbaarheidstest te gebruiken, waren we in staat om een screeningssysteem te creëren dat een uitgebreide analyse van verbindingen van belang genereert. Dit systeem is in staat om kwantitatieve gegevens te produceren tegen een lage kostprijs die binnen het bereik van de meeste laboratoria ligt en toch is het zeer schaalbaar om te passen in grote industriële omgevingen.

High-throughput screening met intracellulaire M. tuberculosis die het luciferasegen Figuur 2A en Tabel 1 bevat de ruwe gegevens verzameld door de luminometer, uitgedrukt in relatieve luminescentie-eenheden (RLU), die het effect van een toenemende concentratie van tuberculose geneesmiddel rifampicine op M. tuberculosis in THP-1 cellen. Figuur 2A is een spreidings...

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Het algemene doel van dit protocol is om een multidimensionale beoordeling te verschaffen van hoe verbindingen de overleving van M.tuberculosis in menselijke macrofagen beïnvloeden. Deze methode is gebaseerd op een luciferase-gebaseerde effectiviteitsassay. Wanneer dit wordt gecombineerd met cytotoxiciteit, kan een MIC-assay nuttige informatie leveren voor de modificatie van HIT-verbindingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen TB.Het belangrijkste voordeel van onze methode is dat het tijd- en arbeidsbesparend is. Hiermee wordt een CFU-assay (kolonievormende eenheden) vervangen door een assay op basis van luciferase. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben met de consistentie bij handmatig pipetteren in vergelijking met automatisering.Een consistente pipetteertechniek is essentieel. Kweek THP1-cellen in RPMI in volledig medium, waarbij tussen de passages een celdichtheid van 0,2 tot één miljoen cellen per milliliter medium wordt gehandhaafd.Gebruik een spectrofotometer om de OD600 van een actief groeiende bacteriële suspensie te meten. Bereken vervolgens de bacteriële dichtheid met de conversiefactor waarbij 0,1 OD600 gelijk staat aa

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Leer een modulair high-throughput screeningsysteem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit van verbindingen tegen intracellulaire Mycobacterium tuberculosis in humane macrofagen.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire

Meer video's verkennen