Methoden voor de Self-integratie van Megamolecular Biopolymeren op de drooglucht-LC Interface

Het algemene doel van dit experiment is om het effect van de interface tussen drogende lucht en vloeibaar kristal (lucht-LC-interface) op de oriëntatie van megamoleculaire biopolymeren, zoals polysachariden, microtubuli en DNA, te evalueren, waarbij het dynamische gedrag op millimeterschaal wordt gevisualiseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van dispersieve structuren, zoals de zelforganisatie van biopolymeren in een droogende omgeving, vergelijkbaar met de omstandigheden waarin levende organismen ongeveer 500 miljoen jaar geleden op het land zijn gekropen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om zijdelingse opnamen van het monster te maken tijdens het droogproces, zonder dat er droging op het horizontale vlak plaatsvindt.

Om deze procedure te starten, voegt u 0,5 gram sacran toe aan 100 milliliters water. Dek de container af met vershoudfolie en roer de oplossing gedurende meer dan 12 uur bij ongeveer 80 degrees celsius. Laat de sacran- en xanthaangomoplossingen afkoelen en centrifugeer vervolgens de sacran-oplossing om onzuiverheden te verwijderen.

Bereid nu een tubuline-oplossing van 0,5 gewichtsprocent in Britton-Robinson-buffer op ijs. Meng 50 µL van de tubuline-oplossing met 5 µL GpCpp. Incubeer de oplossing vervolgens gedurende drie uur bij 37 °C om een stabiele microtubulus of MT-kern te verkrijgen.

Meng vervolgens 950 microliters van de tubuline-oplossing met 50 microliters van de GpCpp-bevattende tubuline-oplossing. Laat de oplossing vervolgens één dag staan bij ongeveer 25 degrees celsius om een stabiele 0,5 weight percent MT-oplossing te verkrijgen. Bereid daarna een 0,5 weight percent DNA-oplossing en een Tris-EDTA-bufferoplossing.

Houd de biopolymeer-monsteroplossingen met een gewichtspercentage van 0,5% op 25 °C voor het droogexperiment. Snijd een siliciumvel in een geschikte vorm met een dikte van 1 mm. Stel een éénzijdig open cel samen, bestaande uit de siliciumspacer en twee ongemodificeerde glasplaatjes.

Fixeer beide zijden van de cel met dubbele clips om te voorkomen dat de monsteroplossingen weglekken. Voeg met een pipetpunt met een poriegrootte van 1 mm langzaam 100 tot 300 µL van elke 0,5 gewichtsprocent biopolymeeroplossing toe aan elke cel bij ongeveer 25 °C. Verwijder luchtbellen uit de cel met een spuitnaald.

Plaats de cellen vervolgens gedurende 18 uur bij 60 °C onder atmosferische druk in een oven met luchtcirculatie voor verdamping. De werkrichting is tegengesteld aan die van de zwaartekracht. Deze plaatsing wordt ook toegepast bij de monitoring voor latere evaluaties.

Gebruik een halogeenlamp van 100 watt met een vlakke lichtbron over een breed gebied om recht zichtbaar licht te leveren. Stel de polarisatoren in op 45 graden en 135 graden met behulp van de houders. Fixeer de posities van de lichtbron, de polarisatoren, de monsterhouder en de camera met een optische rail en stangen.

Plaats de monsterhouder tussen de twee polarisatoren. Plaats vervolgens de camera op ongeveer 20 centimeter van de monsterhouder om scherpstelling mogelijk te maken. Plaats de biopolymeermonsters op de aangegeven tijdstippen in het tekstprotocol tussen de polarisatoren op de houder, parallel aan het XZ-vlak, en bedek het apparaat met een zwart gordijn.

Fotografeer tot slot de monsters door lineaire kruispolarisatoren met behulp van een digitale spiegelreflexcamera met een standaardzoomlens. De zelfintegratie van microdomein naar macrodomein op een drogende lucht-LC-interface werd geëvalueerd. Vóór het drogen werden heldere regio's met verzonden licht in een verstrooide toestand waargenomen.

Na het drogen werden de regio onder de lucht-LC-interface en de sacran-oplossing hoger en nam de intensiteit van de xanthine-oplossing af met kleine macrodomeinen. Spatiotemporele analyse toonde aan dat de piekintensiteit rond de lucht-vloeistofinterface en de dikte toenamen, wat erop wijst dat de microdomeinen beginnen te oriënteren vanaf de lucht-LC-interface en uitgroeien tot een domein op millischaal parallel aan de interface. Polarisatiemicroscopische beelden van de sacran-vloeistoffase toonden één blauwe regio, wat betekent dat er een enkel macrodomein was gevormd.

De vloeibare fase van xanthaangom vertoonde blauwe, gele en roze regio's, wat betekent dat de meerdere macrodomeinen zich vormden met willekeurige oriëntaties. Vóór het drogen vertoonden de sacran- en MT-oplossingen vergelijkbare LC-toestanden met verspreide domeinen. Tijdens het drogen onderging de MT-oplossing zelfintegratie en werden de verspreide domeinen geïntegreerd in één enkel macrodomein.

De DNA-oplossing vertoonde geen specifieke oriëntatie in de vloeibare fase. Het drogingsrecord van sacran vertoonde aanzienlijke dubbelbreking en er werden golvende bundels waargenomen voor het drogingsrecord van MT. Het drogingsrecord van DNA vertoonde korrelvormige macrodomeinen in willekeurige richtingen.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de biomedische techniek die biopolymeren gebruiken, om de visualisatie van luchtstroomdynamica bij zowel droogings- als bevochtigingsprocessen via geometrische benaderingen te onderzoeken.