Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta
August 15th, 2017
Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.
Het algemene doel van deze procedure is om het plasmodesmata-lokalisatiesignaal in doeleiwitten te identificeren. De methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen bij het bestuderen van intercellulaire verbindingen van planten door het identificeren van kritische gedachten in signalen die eiwitten naar de plasmodesmata leiden, wat op zijn beurt de cel-tot-cel-transport van grote moleculen vergemakkelijkt. Het grote voordeel van deze techniek is dat de procedure betrouwbaar is en gemakkelijk kan worden aangepast voor de ontdekking van plasmodesmata-lokalisatie signaalsequenties in de meeste plasmodesmata-doeleiwitten.
Videodemonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het planten, filteren en voorbereiding voor confocale observatie moeilijk te leren zijn via typische op print gebaseerde publicaties. Plant Nicotiana benthamiana zaden in natte grond en op een hoge dichtheid. Tijdens het groeien, houd ze in een gecontroleerde omgevingskamer bij 20 tot 25 graden Celsius en onder 16 uur licht per dag, die ongeveer 75 micromol fotonen per meter vierkant per seconde bevat.
Nadat de diameter van de u. fil een halve centimeter bereikt, verplaats de zaailingen voorzichtig naar grotere potten en zet hun groei voort in dezelfde kamer onder dezelfde omstandigheden. Houd de planten totdat ze binnen vier weken uitgroeien tot het stadium van vier tot acht bladeren.
Op dit punt zouden de grootste bladeren vier tot zes centimeter in diameter moeten zijn. Kies voor eenvoudige identificatie en analyse een expressiesysteem en markeer elk tot expressie gebracht eiwit fluorescent zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bereid een pPZP-RCS2-gebaseerd plasmide voor zoals beschreven en voeg er een microgram van toe aan een 100 microliter cultuur van competente cellen van Agrobacterium tumefaciens.
Incubeer de cellen gedurende 30 minuten op ijs. Bevriest vervolgens de cellen gedurende een minuut in vloeibaar stikstof. Verwarm vervolgens de cellen gedurende 15 minuten op 28 graden Celsius en voeg vervolgens een milliliter LB-medium toe aan het competente cellenmengsel.
Na het toevoegen van het LB-medium, plaats de cellen gedurende twee uur terug op 28 graden Celsius. Draai vervolgens de cellen gedurende een minuut bij 3.000 keer G. Breng de celpellet weer op in 0,2 milliliter LB-medium en plateer ze op selectieve LB-agar platen met antibiotica.
Laat de cellen 48 uur groeien op de platen bij 28 graden Celsius totdat individuele kolonies zichtbaar zijn. Neem vervolgens verschillende individuele kolonies op en plateer ze op verse LB-agar platen en laat de cellen 48 uur groeien bij 28 graden Celsius. Neem vervolgens een kleine hoeveelheid bacteriën van elke plaat voor analyse en gebruik Colony PCR om de aanwezigheid van de specifieke binaire constructies van belang te bevestigen.
Voeg elke agrobacterium kolonie met het construct van belang toe aan vijf milliliter LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Laat de cellen een nacht groeien bij 28 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 3.000 keer G. Breng de pellet terug op tot een OD600 van 0,5 in agroinfiltratiebuffer.
Incubeer de suspensie gedurende twee uur op kamertemperatuur en laad vervolgens het inoculum in een plastic spuit van één milliliter. Houd een volledig volgroeide N. Benthamiana blad met een behandschoende vinger op de adaxiale kant vast, druk de spuitnaald tegen de onderste epidermis van het blad. Breng vervolgens langzaam de agrobacterium in infiltratiemedium binnen door het medium te injecteren.
Houd de geïnfiltreerde plant totdat deze moet worden waargenomen. Gebruik een mes om elk blad 24 tot 48 uur na infiltratie in fragmenten tussen de nerven te snijden. Plaats de bladsneden op de objectslide met de abaxiale bladoppervlakte naar boven.
Plaats vervolgens een druppel water op de bladsnede en bedek deze met het dekglas. Immobiliseer het dekglas met kleine stukjes tape aan elke kant. Breng een slide onder een laser-scanning confocale microscoop en gebruik een 10X subjectief objectief om cellen met het beste signaal te identificeren.
Gebruik vervolgens een 63X subjectief objectief om beelden op te nemen voor meer gedetailleerde observaties. Gebruik daarnaast de juiste fluorescentie om de tot expressie gebrachte fluorescente eiwitten te exciteren. Behoud alle instellingen die worden gebruikt voor beeldacquisitie om consistentie tussen experimenten te behouden.
Onderzoek gemiddeld 100 tot 120 cellen voor elke experimentele conditie. Diagnosticeer de lokalisatie van de geteste eiwitten met behulp van de confocale microscoopbeelden. Deze afbeeldingen illustreren de karakteristieke perifere gepuncteerde plasmodesmata-lokalisatiepatronen die worden waargenomen voor het volledige TMV-bewegingseiwit gefuseerd met het vrachtmolecuul CFP, en voor het geïdentificeerde plasmodesmata-lokalisatiesignaal gefuseerd met CFP, evenals voor het co-geëxpresseerde plasmodesmata-lokalisatie-eiwit, PDCB1 gefuseerd met DsRed.
Onder controleomstandigheden lijkt de plasmodesmata-targetting van het volledige TMV-bewegingseiwit gefuseerd met CFP en het lokalisatie-signaal in het TMV-bewegingseiwit gefuseerd met CFP, zoals hier getoond met subcellulaire lokalisatie van CFP en nucleocytoplasmatische lokalisatie van de marker DsRed2. Wanneer het vierde aminozuur, valine, wordt gemutateerd naar een alanine, gaat de plasmodesmata-targetting door zowel het volledige TMV-bewegingseiwit als het geïdentificeerde lokalisatie-signaal in TMV-bewegingseiwit verloren. Dit geeft aan dat deze rest belangrijk is voor de structuur of functie van het plasmodesmata-lokalisatiesignaal.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 50 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de planten in zeer gezonde conditie te houden en de planten zich in het juiste bladstadium te bevinden. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van, niet alleen hoe u plasmodesmata-lokalisatie-eiwitsignaal kunt identificeren, maar ook hoe u andere bepaalde signalen in planteneiwitten kunt identificeren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op het identificeren van plasmodesmata lokalisatiesignalen in doeleiwitten, wat cruciaal is voor het begrijpen van intercellulaire verbindingen in planten. De beschreven methode is betrouwbaar en aanpasbaar voor het ontdekken van deze signalen in verschillende plasmodesmata-doeleiwitten.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Plantenfysiologie
- Celbiologie
- Plant-virus interacties
Achtergrond
- Plasmodesmata (Pd) zijn essentieel voor cel-tot-cel transport in planten.
- Sorteersignalen leiden eiwitten naar de Pd, wat het transport vergemakkelijkt.
- De huidige kennis over deze sequenties is beperkt.
- Het begrijpen van deze signalen kan onze kennis van plantenfysiologie verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om plasmodesmata lokalisatiesignalen in doeleiwitten te identificeren.
- Om het begrip van intercellulaire verbindingen in planten te verbeteren.
- Om het onderzoek naar eiwittransportmechanismen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Nicotiana benthamiana zaden planten in gecontroleerde omstandigheden.
- Optimale groeiomstandigheden handhaven (20-25掳C, 16 uur licht).
- Gebruikmaken van confocale observatietechnieken voor analyse.
- Een videodemonstratie bieden voor complexe stappen.
Belangrijkste resultaten
- De methode identificeert effectief lokalisatiesignalen in eiwitten.
- Het is aanpasbaar voor verschillende plasmodesmata-doeleiwitten.
- Videobronnen verbeteren het begrip van de procedure.
- Betrouwbare resultaten dragen bij aan het veld van plantenbiologie.
Conclusies
- De studie biedt een waardevolle techniek voor het identificeren van Pd lokalisatiesignalen.
- Het begrijpen van deze signalen kan leiden tot vooruitgang in plantenfysiologie onderzoek.
- De betrouwbaarheid van de methode maakt het een nuttig hulpmiddel voor onderzoekers.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying plasmodesmata localization signals enables mechanistic de-risking of plant-based expression systems used in recombinant protein production. This approach supports target validation by clarifying subcellular trafficking pathways critical for biologics manufacturing in plant hosts. The method enhances predictive confidence in protein localization, informing go/no-go decisions for plant-derived therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates protein-sorting mechanisms to validate functional targeting signals necessary for plasmodesmata transport.
- Operational Value: Provides a reliable, adaptable strategy to identify necessary and sufficient localization signals directly in living plant cells.
- Predictive Value: Enables functional confirmation of targeting motifs through mutagenesis, such as valine-to-alanine substitution disrupting localization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescent tagging and confocal microscopy to generate quantitative, reproducible localization readouts.
- Scalability: Supports screening of multiple protein variants via Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana.
- Platform Reuse: The workflow can be applied to diverse plasmodesmata-targeted proteins beyond viral movement proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery of localization signals to downstream evaluation of protein mobility and intercellular transport efficiency.
- Disease-Relevant System: Utilizes a well-established plant model system compatible with transient expression for rapid signal validation.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in protein trafficking by defining cis-acting elements required for plasmodesmata targeting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where subcellular localization informs protein engineering and construct design for plant-based expression platforms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targeting sequences via direct visualization of protein localization in planta.
- Screening: Enables assessment of signal functionality through co-localization with plasmodesmata markers like PDCB1-DsRed.
- Analytics: Generates imaging-based quantitative data on subcellular distribution patterns under controlled expression conditions.
- Translational Research: Provides mechanistic insight into intercellular transport, relevant for optimizing protein yield and mobility in plant bioproduction.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for localization signal discovery applicable across multiple protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by defining minimal functional sequences required for plasmodesmata localization.
- Operational Value: Delivers a reproducible, video-supported protocol reducing variability in localization assays.
- Strategic Value: Informs construct optimization to enhance intracellular trafficking in plant expression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein candidates based on validated subcellular targeting.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transient expression, confocal microscopy, and fluorescent protein tagging.
- Dependent on Agrobacterium infiltration infrastructure and controlled plant growth chambers.
- Necessitates standardization of imaging settings and analysis criteria across experimental conditions.
- Adaptation to different plant species may require optimization of infiltration and growth parameters.
- Limited to proteins that can be stably expressed and fluorescently tagged in planta without disrupting native function.
