Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van plasmodesmata-lokalisatiesignalen in doelwitproteïnen. De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de intercellulaire verbindingen van planten door kritische signalen te identificeren die proteïnen naar de plasmodesmata dirigeren, wat op zijn beurt het cel-tot-celtransport van grote moleculen faciliteert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de procedure betrouwbaar is en eenvoudig kan worden aangepast voor de ontdekking van plasmodesmata-lokalisatiesignaalsequenties in de meeste proteïnen die zich op de plasmodesmata richten.

Een videodemonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het planten, filteren en voorbereiden voor confocale observatie moeilijk aan te leren zijn via typische gedrukte publicaties. Plant Nicotiana benthamiana zaden in natte bodem en met een hoge dichtheid. Houd ze tijdens de groei in een gecontroleerde milieukamer bij 20 tot 25 °C en onder 16 uur licht per dag, met een intensiteit van ongeveer 75 µmol fotonen per m² per seconde.

Zodra de diameter van de u. fil een halve centimeter bereikt, worden de zaailingen voorzichtig overgezet naar grotere potten en in dezelfde kamer onder dezelfde omstandigheden verder gekweekt. Houd de planten in stand tot ze binnen vier weken het stadium van vier tot acht bladeren hebben bereikt.

Op dit punt moeten de grootste bladeren vier tot zes centimeter in diameter zijn. Kies voor een gemakkelijke identificatie en analyse een expressiesysteem en label elk tot expressie gebracht eiwit fluorescent, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bereid een pPZP-RCS2-gebaseerd plasmide voor zoals beschreven en voeg één microgram hiervan toe aan een cultuur van 100 microliter competente cellen van Agrobacterium tumefaciens.

Incubeer de cellen 30 minuten op ijs. Vries de cellen vervolgens gedurende één minuut snel in vloeibare stikstof in. Warm de cellen daarna 15 minuten op bij 28 °C en voeg vervolgens één milliliter LB-medium toe aan het mengsel van competente cellen.

Nadat het LB-medium is toegevoegd, worden de cellen gedurende twee uur teruggeplaatst bij 28 °C. Centrifugeer de cellen vervolgens 1 minuut lang bij 3.000 ×g. Resuspendeer de celpellet in 0,2 ml LB-medium en zaai deze uit op antibioticaselectieve LB-agarplaten.

Kweek de cellen op de platen bij 28 °C gedurende 48 uur totdat individuele kolonies zichtbaar zijn. Selecteer vervolgens enkele individuele kolonies en zaai deze uit op verse LB-agarplaten en kweek de cellen bij 28 °C gedurende 48 uur. Neem daarna een kleine hoeveelheid bacteriën van elke plaat voor analyse en gebruik Colony PCR om de aanwezigheid van de specifieke binaire constructen van belang te bevestigen.

Voeg elke agrobacteriumkolonie met het construct van belang toe aan vijf milliliter LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Kweek de cellen gedurende de nacht bij 28 °C. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 3.000 ×g. Resuspendeer het pellet tot een OD600 van 0,5 in agroinfiltratiebuffer.

Incubeer de suspensie gedurende twee uur bij kamertemperatuur en breng vervolgens het inoculum over in een plastic spuit van één milliliter. Houd een volledig volgroeid N.Benthamiana-blad vast met een handschoen aan de adaxiale zijde en druk de tuit van de spuit tegen de onderste epidermis van het blad. Introduceer vervolgens langzaam de agrobacterium in infiltratiemedium door het medium in te spuiten.

Houd de geïnfiltreerde plant in stand tot het moment van observatie. Gebruik een mesje om elk blad 24 tot 48 uur na infiltratie in fragmenten tussen de nerven te snijden. Plaats de bladsneden op het preparaatglas met de abaxiale zijde van het blad naar boven.

Plaats vervolgens een druppel water op de bladplak en dek deze af met het dekglas. Fixeer het dekglas met kleine stukjes plakband aan weerszijden. Plaats een preparaat onder een laser-scanning confocale microscoop en gebruik een 10X objectief om cellen met het beste signaal te identificeren.

Gebruik vervolgens een 63X objectieflens om beelden vast te leggen voor meer gedetailleerde observaties. Gebruik daarnaast de juiste fluorescente filters om de tot expressie gebrachte fluorescerende eiwitten te exciteren. Behoud alle instellingen die worden gebruikt voor de beeldacquisitie om de consistentie tussen experimenten te waarborgen.

Onderzoek gemiddeld 100 tot 120 cellen voor elke experimentele conditie. Diagnoseer de lokalisatie van de geteste eiwitten aan de hand van de confocale microscopbeelden. Deze beelden illustreren de kenmerkende perifere punctate plasmodesmata-lokalisatiepatronen die zijn waargenomen voor het volledige TMV-transporteiwit gefuseerd met het cargo-molecuul CFP, en voor het geïdentificeerde plasmodesmata-lokalisatiesignaal gefuseerd met CFP, alsofook voor het co-expressie plasmodesmata-lokalisatie-eiwit, PDCB1 gefuseerd met DsRed.

Onder controlecondities verschijnt de plasmodesmata-targeting van het volledige TMV-beweegproteïne gefuseerd aan CFP en het lokalisatiesignaal in het TMV-beweegproteïne gefuseerd aan CFP zoals hier getoond, met subcellulaire lokalisatie van CFP en nucleocytoplasmatische lokalisatie van de marker DsRed2. Wanneer het vierde aminozuur, valine, wordt gemuteerd naar een alanine, gaat de plasmodesmata-targeting door zowel het volledige TMV-beweegproteïne als het geïdentificeerde lokalisatiesignaal in het TMV-beweegproteïne verloren. Dit geeft aan dat dit residu belangrijk is voor de structuur of functie van het plasmodesmata-lokalisatiesignaal.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 50 uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de planten in een zeer gezonde conditie verkeren en zich in het juiste bladstadium bevinden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van niet alleen hoe u plasmodesmata-lokalisatie-proteinsignalen identificeert, maar ook hoe u bepaalde andere signalen in planteneiwitten kunt identificeren.