Name: Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese In Vitro Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer de kinetiek van achterblijvende-streng DNA-synthese in vitro met bacteriofaag T7 replicatie-eiwitten. Deze gevoelige gel-gebaseerde methode helpt onderzoekers belangrijke stappen tijdens Okazaki-fragment synthese te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van het C.C.R. laboratorium voor hun opmerkingen en S. Moskowitz voor de voorbereiding van de figuur. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) en GM54397 (C.C.R.).

LET OP: Volg alle institutionele voorschriften met betrekking tot het veilig gebruik en de verwijdering van radioactief materiaal, inclusief maar niet beperkt tot, het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, een veiligheidsbril, laboratoriumjas en passende acryl schilden. OPMERKING: De standaard buffer bestaat uit 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM kalium- glutamaat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dit buffer wordt pre een 5x concentratie) en 0,3 mM van elke dNTP. T7 replicatie eiwitten gezuiverd zoals beschreven 8, 9, 10. Enkelstrengs DNA bevattende één T7 primase herkenningsplaats (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) is verkrijgbaar bij diverse bedrijven DNA-synthese (de lengte van de ssDNA kan afhangen van het enzym van keuze, voor T7 primase, een pentameer is de minimale lengte template volledige lengte primer te synthetiseren 11, de cryptische C is echter essentieel indien de primer verlengd met polymerase, additionele nucleotiden aanwezig op het 3 &#39;uiteinde van de template. Reacties worden geïnitieerd door het toevoegen van een eindconcentratie van 10 mM MgCl2 en geïncubeerd bij 25 ° C. Handmatige sampling werkt goed voor tijdstippen van 5 seconden of meer. Als tijdstippen korter dan die vereist, wordt aanbevolen een snelle quench-stroom instrument om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. 1. Multiple-omzet Primer Synthese Reactie door Manual Sampling <ol><li> Voordat de proef begon, monster 2 pl formamide kleurstof buffer (93% (v / v) formamide, 50 mM EDTA, 0,01% xyleencyanol en 0,01% broomfenolblauw) in 8 1,5 ml polypropyleen buizen. In het algemeen is het aantal buizen is gelijk aan het aantal tijdstippen geanalyseerd. </li><li> Bereid een 20 pi mengsel bestaande 1x buffer, 0,1 mM ATP en CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32P] CTP, 0,1 uM ssdNA template en 0,1 uM GP4 (uitgedrukt als hexameer concentratie - 0,6 uM monomeer). </li><li> Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Verwijder 2 pi van het mengsel met behulp van een pipet en meng met 2 pl formamide kleurstof buffer in een 1,5 ml buis bereid in stap 1.1 voor de niet reactiecontrole (tijdstip nul). </li><li> Voeg 2 ul van 0,1 M MgCl2 tot reactiemengsel (een eindconcentratie van 10 mM). </li><li> Handmatig intrekken 2 pl monsters van de reactiemengsels onder toepassing van een pipet in 10 s intervallen en meng met formamide kleurstof voorverdeeld in 1,5 ml buisjes bereid in stap 1.1. </li><li> Warmte monsters bij 95 ° C gedurende 5 min in een verwarmingsblok. </li><li> Laad porties van de monsters op een denaturerende gel. De kleine tetraribonucleotide primer gesynthetiseerd door T7 primase goed ontbonden op een 0,4 mm dikke 25% acrylamide: bisacrylamide (19: 1), 3 M ureum, 1x TBE (100 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA). </li><li> Plaats de gehele gel op ChromatograPHY papier en dek af met plastic folie. Droog onder toepassing van een gel droger. </li><li> Bereid een verdunningsreeks van de rest van het reactiemengsel en spot hetzelfde volume geladen op de gel chromatografie op papier, dat wil zeggen, spotten 4 pl van de verdunning of 4 pl monster werd geladen. Opmerking: Dit zal dienen als de standaardcurve om de concentratie van de producten gevormd tijdens de reactie te bepalen. Bijvoorbeeld vijfvoudige verdunningen behulp TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) werken goed, verspreid over een bereik van 1:25 tot 1: 15.625 (5 2 -5 6), maar de verdunningen worden aangepast afhankelijk van de mate van activiteit. </li><li> Expose droge gel en standaard gebruik van een phosphorimager scherm. Kwantificeren van de radioactiviteit in de verdunningsreeks en bouw een standaardkromme zoals beschreven 8, 12 OPMERKING: Opname van T7 DNA polymerase aan het reactiemengsel maakt het mogelijk om EXAmine het gebruik van tetraribonucleotide primers door dit enzym. Optimaal dienen de polymerase concentratie te verzadigen met de interpretatie van de gegevens te vereenvoudigen. Een polymerase concentratie van 0,4 pM of hoger geeft goede resultaten. Bovendien kan het effect van andere eiwitten, zoals enkelstrengs DNA bindende eiwitten, aan beide primer synthese of achterblijvende streng inleiding op deze manier onderzocht. </li></ol> 2. Multiple-omzet Primer Synthese Reactie Met behulp van een Rapid-demping Instrument <ol><li> Bereiding van reactiemengsels <ol><li> Bereid 400 ul oplossing A, die 1 x buffer, 0,2 uM GP4 hexameer, 0,2 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP en CTP (inclusief 0,5 mCi / ml [α- 32P] CTP. </li><li> Bereid 400 pi oplossing B, bestaande uit 1x buffer en 20 mM MgCl2. </li></ol></li><li> Werking van rapid-demping doorstroming instrument <ol><li> Schakel rapid-doof stroming instrument; na het hoofdmenu verschijnt, type 7 op het instrument toetsenbord om de spuit chauffeur te verplaatsen naar de beginpositie. </li><li> Open buffer spuit positie om &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Laadbuffer spuiten <ol><li> Bevestig een 10 ml spuit met buffer om de drive spuit poort. Verander spuit knop positie op &quot;LOAD&quot;. </li><li> Gebruik 10 ml spuiten, vul instrument bufferreservoir A en B met 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA en vul spuit C met afschrikoplossing (250 mM EDTA en 0,2% SDS). Verwijder luchtbellen door te drukken zuigers in en uit. </li><li> Change knop posities om &#39;vuur&#39;. Type 2 om de positie van de spuit bestuurder bar aan te passen. Druk op de &quot;ADJUST DOWN&quot; knop om de spuit te verlagen tot buffer komt uit de exit lus: (7-onder gaat continu; 8-grote stap naar beneden, 9-small step down). Typ &quot;ESC&quot; om terug te keren naar het hoofdmenu. </li></ol></li><li> wash tubing <ol><li> attach exit lijn naar vacuüm. Verander sample knoppen om &quot;FLUSH&quot;. Afsluiten buffer spuit door de knoppen in de horizontale stand. Zet vacuüm en dompel de 2 flush lussen in H 2 O voor 10 s, dan duik in MeOH gedurende 10 s. Droog lussen door te zuigen lucht voor ~ 15 s, of tot het droog is. </li></ol></li><li> Loading samples <ol><li> Change monster knop positie op &quot;LOAD&quot;. Plaats oplossing A bij 1 ml spuit. Sluit spuit in één belading van het monster poorten. Herhaal dit voor oplossing B en plaats in tegengestelde sample load-poort. </li></ol></li><li> Het verzamelen van time-punten <ol><li> Op het hoofdmenu, type 1 voor demping-flow run. Voer reactietijd (s) en druk op &quot;ENTER&quot;. De reactie lusnummer te gebruiken wordt weergegeven. Overschakelen naar verplichte reactie lus. Herhaal wassen procedure in stap 2.2.4. </li><li> Draai sample knoppen om &quot;LOAD&quot;. Load reactie mengt in sampleloops tot net buiten het centrale mengen compartiment. Draai alle knoppen op &quot;FIRE &#39;. Controleer of alle knoppen in de juiste positie. </li><li> Plaats 1,5 ml buis op het einde van de afrit loop. Druk op &quot;GO&quot; om de reactie te draaien. Herhaal wassen procedure in stap 2.2.4. Reload buffer spuiten A en B totdat ze de bestuurder raken. </li><li> Herhaal stap 2.2.6.2-2.2.6.3 voor elk gewenst tijdstip. Uitzondering: Laat oplossing die de start reagens (bijv MgCl 2 in dit geval) bij afschrikken van het tijdstip nul-punt controle niet geladen. </li><li> Wanneer u klaar bent het verzamelen van monsters, voert u &quot;ESC&quot; om terug te keren naar het hoofdmenu. Druk op &quot;7&quot; om buffer spuit bestuurder terug te keren naar de uitgangspositie. </li></ol></li><li> Instrument clean-up <ol><li> Verwijderen reactiemengsel spuiten. Draai monster laden knop om &quot;LOAD&quot; -stand. Onder vacuüm, wassen elk monster lus met 10 ml 0,2 N NaOH, gevolgd door 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 en 10 mL MeOH. </li><li> Draai spuit knoppen om &quot;LOAD&quot; -stand. Druk naar beneden op alle 3 SYRinge zuigers om reactie en demping buffers op te halen. Wassen spuiten met 5 ml H2O ten minste tweemaal. </li><li> Vul spuiten opnieuw met 5 mL H2O en draai knoppen om &quot;vuur&quot; positie. Verander knop posities en zet vacuum aan H 2 O. Flush te verwijderen zoals in stap 2.2.4. Schakel instrument. LET OP: De producten worden geanalyseerd zoals beschreven in stappen 1,7-1,12. Bovendien kan T7 DNA-polymerase en andere eiwitten replicatie in het reactiemengsel worden toegevoegd om het effect op synthese primer of uitbreiding analyseren. </li></ol></li></ol> 3. Single-omzet Primer Synthese Reactie OPMERKING: Single-omzet primer synthese / extensie assays zijn eveneens uitgevoerd om meerdere omzet reacties, met enkele belangrijke verschillen: deze assays volgen de omzetting van radioactief gemerkt ATP in of primer verlengingsproducten, maar de concentratie van substraten en eiwitten considerably hoger. Bovendien, teneinde milliseconde bereiken analyse van de primer synthesereactie toelaten, moet men een snelle quench-stroom machine gebruiken. <ol><li> Bereiding van reactiemengsels. <ol><li> Bereid 400 ul oplossing A, bevattende 1 x buffer, 3 uM GP4 hexameer, 6 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP en 2 nM [γ- 32 P] ATP. Bereid 400 pi oplossing B, bestaande uit 1x buffer en 20 mM MgCl2. </li></ol></li><li> Rapid-demping stroom operatie <ol><li> Verricht reacties zoals beschreven in stap 2.2. Voeg desgewenst T7 DNA polymerase of T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit bij een concentratie van 15 uM en 20 uM, respectievelijk. In dit geval, de verlengingsproducten accumuleren tegelijk regeling die voorziet in handmatige bemonstering van het reactiemengsel. </li></ol></li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Fit product vooruitgang curves voor niet-lineaire minstpleinen modellen met behulp van commercieel verkrijgbare software die in staat kleinste kwadraten horten en / of numerieke integratie. De details van de operatie zal variëren met de gebruikte software, maar onder zijn algemene vorm vergelijkingen voor de montage van de data. </li><li> Bepaal de snelheid van vorming product van meerdere omzet primer synthese reacties door het aanbrengen naar krommen ontwikkelen tot een lineaire vergelijking. Als er een aanzienlijke kromming Gebruik de initiële werkwijze tarief 13, 14 door het aanbrengen van de data voor een enkelvoudige exponentiële functie: y = A (e - k t), waarbij y de productconcentratie, A de reactie amplitude, k de waargenomen snelheidsconstante, t de tijd in seconden. De helling van de raaklijn op tijdstip = 0 is de initiële snelheid. OPMERKING: Geschikte pre-steady state primer synthesereacties een lineaire vergelijking of de pre-steady state burst vergelijking y = A (e - k bueerste t) + rate ss t, waarbij A de reactie amplitude, k burst is de waargenomen snelheidsconstante voor de pre-steady state burst, percentage ss is de constante frequentie ss = kcat [Enzyme]), t de tijd , in seconden. Fit single-omzet primer synthese reacties vooruitgang bochten om een single-exponentiële functie y = A (e - k t). Bij GP4, bij de data door numerieke integratie 15, een model met drie NTP condensatiestappen, waarbij elke tussenproduct in evenwicht met het enzym, met in de handel verkrijgbare software. </li></ol>

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De belangrijkste factor bij het uitvoeren van deze experimenten is de beschikbaarheid van zeer actieve gezuiverd enzym. Tijdens ons werk met GP4, bijvoorbeeld, vonden wij dat de opslag van het gezuiverde enzym in buffer (20 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) bevattende 50% glycerol bij -20 ° C leidt tot een vermindering de specifieke activiteit van het preparaat over een paar maanden. Daarom hebben we nu flash-freeze kleine fracties gezuiverd gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCE...

De replicatie van DNA is geconserveerd kenmerk van alle cellulaire leven. Hoewel de identiteit en het aantal replicatie componenten sterk variëren, zijn de algemene mechanismen gedeeld over de evolutie 1. We beschrijven gel gebaseerde discontinue kinetische experimenten, met behulp van radioactieve substraten, gericht op het begrijpen van de kinetiek van achterblijvende streng DNA synthese in vitro door componenten van de T7 replisome. De replicatiemachinerie van bacteriofaag T7 is zeer eenvoudig, bestaande uit slechts vier eiwitten (DNA polymerase, GP5 en de processivity factor, E. coli thioredoxine, de bifunctionele primase-helicase GP4, en de enkelstrengs DNA-bindend eiwit, GP2. 5) 2. Deze functie maakt het een aantrekkelijke modelsysteem om de geconserveerde biochemische mechanismen van DNA-replicatie bestuderen. Speciale nadruk wordt gelegd op de vorming van ribonucleotide primers door T7 DNA primase, een criticaIk stap in de initiatie van DNA-synthese. Bovendien kan men ook het gebruik van deze primers door T7 DNA- polymerase replicatie of andere eiwitten onderzocht door ze in het reactiemengsel. De T7 primase-helicase, GP4, katalyseert de vorming van primers voor DNA-synthese op specifieke DNA-sequenties genoemd primase herkenningsplaatsen of PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). De cytosine in het PRS cryptisch, is het essentieel voor herkenning van de website, maar het is niet gekopieerd naar het product 3. De eerste stap in de synthese primer door GP4 omvat de vorming van het dinucleotide pppAC, die vervolgens wordt uitgebreid tot een trimeer en uiteindelijk functionele tetranucleotide primers pppACCC, pppACCA of pppACAC afhankelijk van de sequentie in de mal 4. Deze primers kunnen vervolgens worden gebruikt door T7 DNA polymerase om DNA-synthese, die ook een gp4 werkwijze met 5, 6 initiëren. In dit opzicht is de primasedomein stabiliseert de extreem korte tetraribonucleotides de sjabloon, voorkomen van dissociatie grijpt DNA polymerase zodanig bevorderlijk is voor een primer / matrijs in de polymerase actieve plaats 7. Deze stappen (RNA primer synthese primer handoff te polymerase en extensie) worden herhaald in meerdere cycli op de bekledings bundel repliceren en worden gecoördineerd met de replicatie van de belangrijke bundel. De hier beschreven assays zijn zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd in een gematigd tijdsbestek. Ze zijn echter relatief lage-throughput en goede zorg moet worden betracht bij het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen. Afhankelijk van de snelheid waarmee de reactie verloopt, kan men een snelle quench-instrument te gebruiken om monsters opbrengen op tijdschalen vatbaar voor zinvolle analyse reactietijd gangen in zowel de constante of de pre-steady state. Onlangs hebben we gebruikten assays hier beschreven evidenc biedene van het belang van primer vrijlating uit de primase domein van GP4 in de inleiding van Okazaki fragmenten. Bovendien toonden we aan een regulerende rol voor het T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit, gp2.5, voor de efficiëntie van vorming en gebruik 8 primer.

<table><tbody><tr><td>Tris voorgeprogrammeerde kristallen pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminzuur kaliumzout monohydraat</td><td>SIGMA</td><td>G1501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) tetraazijnzuur, dinatriumzout, dihydraat</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha;-32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactief, neem beschermende maatregelen</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactief, neem beschermende maatregelen</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>vier dNTPs onderdeel van set</td></tr><tr><td>100 mM ATP en CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>onderdeel van NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructies</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>aangepaste sequenties&nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>SIGMA</td><td>B8026&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cylene xyanol&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methyleenbisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetiek van achterblijvende-streng dna-synthese<em&gt; in vitro</em&gt; door de bacteriofaag t7 replication eiwitten

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Hier bieden we protocollen voor de kinetische onderzoeking van de achterblijvende-streng DNA-synthese in vitro door de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7. Het T7-replisome is een van de eenvoudigste replicatiesystemen die bekend zijn, samengesteld uit slechts vier eiwitten, wat een aantrekkelijk kenmerk is voor biochemische experimenten. Speciale nadruk wordt gelegd op de synthese van ribonucleotide-primers door de T7-primase-helicase, die door DNA-polymerase worden gebruikt om DNA-synthese te initiëren. Omdat de mechanismen van DNA-replicatie geconserveerd zijn door de evolutie, zouden deze protocollen toepasbaar moeten zijn, of nuttig als een conceptueel springplank, voor onderzoekers die andere modelsystemen gebruiken. De protocollen die hier worden beschreven zijn zeer gevoelig en een ervaren onderzoeker kan deze experimenten uitvoeren en gegevens voor analyse verkrijgen in ongeveer een dag. Het enige gespecialiseerde stuk apparatuur dat vereist is, is een snel-quenching flow-instrument, maar dit stuk apparatuur is relatief gebruikelijk en verkrijgbaar bij verschillende commerciële bronnen. De belangrijkste nadelen van deze assays zijn echter het gebruik van radioactiviteit en de relatief lage doorvoer.

De in Figuur 1A resultaten werden verkregen zoals beschreven in stap 1 van het protocol, dat wil zeggen, door handmatig een primer synthese gekatalyseerd door gp4 onder meervoudige omzetvoorwaarden bemonstering. Hier kan een reeks producten na gelelektroforese worden waargenomen door CTP gemerkt met 32P bij de α-plaats in primer synthesereacties (Figuur 1A). Het gemerkte precursor, CTP, toont de hoogste mobiliteit en ...

We beschrijven gevoelige, gel-gebaseerde discontinue assays om de kinetiek van lagging-strandinitiatie te onderzoeken met behulp van de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7.

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Het algemene doel van deze procedure is om de kinetiek van de synthese van de primer en de DNA-lagging strand te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van DNA-replicatie, zoals de wijze waarop primers worden gevormd door DNA-primase, worden overgedragen aan en worden benut door DNA-polymerase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de identificatie mogelijk maakt van cruciale stappen tijdens de synthese van Okazaki-fragmenten.Aangezien er in dit experiment radioactieve materialen worden gebruikt, moeten alle institutionele regelgevingen met betrekking tot het veilig gebruik en de afvoer van radioactieve materialen worden nageleefd. Begin met het overbrengen van aliquoten van 2 µL formamide-kleurstofbuffer in acht polypropyleen buisjes van 1,5 mL, gelijk aan het aantal te analyseren tijdstippen. Bereid vervolgens een mengsel van 20 µL voor bestaande uit buffer, ATP, CTP, CTP gelabeld op de alfa-fosfaatgroep met P32, enkelstrengs DNA-template en het gene four-eiwit, of GP four primase helicase.Incubeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na vijf minuten een pipet om twee µL van het mengsel te verwijderen en meng dit met twee µL formamidekleurstofbuffer in een van de eerder voorbereide buisjes van 1,5 mL. Dit is de controle voor geen reactie.Voeg twee microliter 0,1 molair magnesiumchloride toe aan het reactiemengsel en start onmiddellijk een timer. Neem elke 10 seconden handmatig monsters van twee microliter van het reactiemengsel en meng deze met de formamidekleurstof in de 1,5 milliliter buisjes. Nadat alle tijdspunten zijn verzameld, worden de monsters vijf minuten lang verhit in een heatblock op 95 graden Celsius.Laad aliquoten van de monsters op een denaturerende gel voor elektroforese. Begin deze procedure met het bereiden van de reactiemengsels. Bereid 400 microliters van oplossing A voor, bestaande uit buffer, GP four hexameer, enkelstrengs DNA-template, dNTP's, ATP, CTP en CTP gelabeld op de alfa-fosfaatgroep met P32.Bereid 400 µL van oplossing B voor, bestaande uit one X buffer en 20 mM magnesiumchloride. Stel vervolgens het rapid quench flow-instrument in. Zet het instrument aan en typ, nadat het hoofdmenu is verschenen, zeven op het toetsenbord van het instrument om de spuitdriver naar de home-positie te verplaatsen.Open de positie van de bufferspuit om te laden. Vul spuit C met quenchoplossing en vul vervolgens, met behulp van een spuit van 10 milliliter, de bufferreservoirs A en B van het instrument met buffer. Verwijder luchtbellen door de zuigers in en uit te bewegen.Zet de knoppen in de stand om te vuren. Gebruik type twee om de positie van de stang van de spuitendraaier aan te passen. Druk op de knop voor neerwaartse aanpassing om de spuit te laten zakken totdat de buffer uit de uitlaatlus komt.Typ escape om terug te keren naar het hoofdmenu. Om de slang te spoelen, sluit de uitgangslijn aan op een vacuüm. Zet de monsterknoppen op spoelen.Zet de knoppen in de horizontale positie om de bufferspuit te sluiten. Zet het vacuüm aan, dompel de twee spoellussen 10 seconden lang in water en dompel ze vervolgens 10 seconden lang in methanol. Droog de lussen door gedurende ongeveer 15 seconden lucht op te zuigen, of tot ze droog zijn.Om monsters te laden, zet u de positie van de monsterknop op 'load'. Plaats oplossing A in een spuit van één milliliter en sluit de spuit aan op een van de monsterlaadpoorten; doe hetzelfde met oplossing B in de tegenovergestelde monsterlaadpoort. Begin met het verzamelen van tijdspunten door een één in het hoofdmenu te typen voor een quench flow run.Voer de reactietijd in en druk op enter. Het te gebruiken reactielusnummer wordt weergegeven. Schakel over naar de vereiste reactielus.Nadat de buis is gewassen zoals eerder gedemonstreerd, draait u de monsterknoppen naar de stand 'load'. Vul de reactiemengsels in de monsterlussen tot net buiten het centrale mengcompartiment. Draai alle knoppen naar de stand 'fire' en controleer of alle knoppen in de juiste positie staan.Plaats een buisje van 1,5 milliliter aan het uiteinde van de uitlooplus. Druk op 'go' om de reactie te starten. Nadat de procedure voor het spoelen van de slang is herhaald, moeten de bufferspuiten A en B opnieuw worden gevuld totdat ze de driver van de bufferspuiten raken.Herhaal de stappen voor het uitvoeren van de reactie voor elk gewenst tijdstip, met één uitzondering: laad oplossing B niet tijdens het quenchen van de nulmeting (t=0 controle). Wanneer de monstername is voltooid, druk op escape om terug te keren naar het hoofdmenu. Druk op zeven om de bufferspuitdriver terug naar de homepositie te brengen.Begin met het reinigen van het instrument door de spuiten van het reactiemengsel te verwijderen en draai de knop voor het laden van de monsters naar de laadpositie. Spoel elke monsterloop onder vacuüm met telkens 10 milliliters natriumhydroxide, fosforzuur en methanol. Druk op de zuigers van alle drie de spuiten om de reactie- en quenchbuffers op te halen.Spoel de spuiten minstens twee keer met vijf milliliter water. Vul de spuiten opnieuw met vijf milliliter water, draai de knoppen naar de vuurpositie, zet het vacuüm aan en laat de driver via het toetsenbordcommando zakken om het water te verwijderen. Spoel de slang zoals eerder gedemonstreerd.Schakel als laatste het instrument voor de rapid quench flow uit. De monsters worden vervolgens geanalyseerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Deze resultaten zijn verkregen door handmatige monsterneming van een primersynthesiereactie gekatalyseerd door GP four onder multiple turnover-condities.De gelabelde precursor CTP vertoont de hoogste mobiliteit en migreert naar de onderkant van de gel, gevolgd door langzamer migrerende soorten, die overeenkomen met de kleurstof en tetraribonucleotiden gesynthetiseerd door GP four. Afhankelijk van de incubatieduur en de context van de template-sequentie kunnen aanvullende gelabelde producten worden waargenomen die overeenkomen met hogere oligomeren. Wanneer een rapid quench-instrument wordt gebruikt om de door GP four gekatalyseerde reactie te onderzoeken op tijdschalen variërend van seconden tot enkele ms, is duidelijk dat de accumulatie van primers niet lineair is, maar een bifasisch profiel vertoont, aangegeven door de doorgetrokken lijn.Dit suggereert dat de productvorming snel is en dat de vrijgave de snelheidsbepalende stap is in de gestage toestand. De stippellijn stelt een hypothetische voortgangscurve voor die zou resulteren als de primer-vorming door GP vier niet zou verlopen met een pre-steady state burst. Een experiment voor primer-synthese met een enkele omzetting verschaft informatie over de vorming en het verval van intermediaire species tijdens de omzetting van substraat naar product.De gelafbeelding toont het tijdsverloop van de tetrameervorming. De grafiek geeft de vorming van intermediairen weer als functie van de tijd. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in 90 minuten worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.Vergeet niet dat het werken met radioactieve reagentia extreem gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals een juiste afscherming.

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit protocol laat een eenvoudige single-molecule fluorescentie microscopie technieken voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomes in real time.

Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

Het lot van de replisome na een botsing met een head-on RNA-polymerase (RNAP) is onbekend. We vinden dat de replisome kraampjes bij botsing met een head-on RNAP, maar rek hervat na het verplaatsen van de RNAP uit DNA. MFD bevordert replicatie opnieuw op te starten door het vergemakkelijken van verplaatsing van de RNAP na de botsing.

Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Een reproduceerbare, accuraat en tijd efficiënt kwantitatieve PCR (qPCR) methode om op te sommen T7 bacteriofaag wordt hier beschreven. Het protocol geeft een duidelijke beschrijving van phage genomic DNA voorbereiding, PCR reactie voorbereiding, qPCR fietsen voorwaarden en qPCR data-analyse.

Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

In dit manuscript beschrijven we een protocol om transcriptie en de remmende activiteit van antibacteriële middelen die zich richten op bacteriële transcriptie functioneel te onderzoeken.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

We beschrijven hier een relatief snelle en eenvoudige benadering voor het in kaart brengen van genoom-breed replicatietiming bij zoogdieren, van celisolatie tot de basisanalyse van de sequentieresultaten. Een genomische kaart van een representatief replicatieprogramma zal worden verstrekt volgens het protocol.

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Leer de kinetiek van achterblijvende-streng DNA-synthese in vitro met bacteriofaag T7 replicatie-eiwitten. Deze gevoelige gel-gebaseerde methode helpt onderzoekers belangrijke stappen tijdens Okazaki-fragment synthese te identificeren.

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese

Meer video's verkennen