Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

Het algemene doel van deze procedure is het succesvol isoleren van functionele muishepatocyten voor het bestuderen van de expressie en secretie van inflammatoire cytokinen, zoals CRP en IL6, als reactie op mediatoren van de hepatische acute-fase-respons. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de hepatocellulaire functie en de bijdrage van hepatische cytokinen aan een langdurige inflammatoire omgeving, zoals die wordt aangetroffen bij chronische nierziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een robuust instrument biedt voor een eenvoudige, snelle en reproduceerbare analyse van hepatische metabolomics en inflammatie, evenals de respons op geneesmiddelen.

Begin met het voorverwarmen van het leverperfusiemedium en het leverdigestiemedium in een waterbad op 37 °C. Stel een perfusiepomp in zoals hier wordt getoond. Gebruik vervolgens leverperfusiemedium om het slangensysteem van de pomp voorzichtig vooraf te vullen.

Probeer luchtbellen in het systeem te vermijden. Bereid de stereotactische microscoop voor op de perfusieprocedure. Plaats vervolgens het gedoseerde donormuis, nadat deze volgens het tekstprotocol is geanestheseerd, op een absorberend matje.

Gebruik plakband om de extremiteiten van de muis te fixeren. Scheer vervolgens de buik van de muis en desinfecteer deze. Gebruik daarna chirurgische scharen met scherp-botte punten om een ventrale laparotomie uit te voeren vanaf het schaambeen tot aan de craniale rand van de lever.

Maak aan beide zijden een incisie in de buikwand op een positie caudaal van het diafragma. Leg de vena cava inferior of IVC vrij door de darm voorzichtig met steriele wattenstaafjes naar de rechterkant te verschuiven. Maak met een fijne chirurgische schaar met scherpe punten laterale incisies door het suprahepatische diafragma en open de borstholte.

Gebruik vervolgens 5-0 chirurgische zijde om de thoracale vena cava inferior (IVC) af te binden. Cannuleer de infrarenale IVC met een afgeschermde IV-katheter. Sluit de perfusiepomp aan en start met het perfunderen van de lever.

Indien correct uitgevoerd, zou de lever onmiddellijk moeten beginnen te bleken en op te zwellen. Transecteer vervolgens met een fijne chirurgische schaar de vena portae, zodat bloed en perfusiemedium adequaat kunnen worden afgevoerd. Stop de perfusiepomp nadat de lever is geperfuseerd met ongeveer 30 milliliters leverperfusiemedium.

Schakel over naar leverdigestiemedium en zet de pomp weer aan. Zodra de perfusie is voltooid, verwijdert u de canule. Leg voorzichtig de centrale regio van de lever bloot en lokaliseer het bindweefsel dat de leverlobben met elkaar verbindt.

Pak de centrale verbindingsvezels vast en ontleed voorzichtig alle weefsels die de lever op zijn plaats houden. Verwijder vervolgens voorzichtig de lever. Breng het orgaan onmiddellijk over in een conische polypropyleen buis van 50 milliliter met 15 milliliter leverdigestiemedium.

Breng de lever, terwijl u in een celkweekkast werkt, over van de polypropyleen conische buis van 50 milliliter naar een steriele weefkweekschaal. Scheur de vier leverkwabben voorzichtig open met steriele pincetten. Indien correct uitgevoerd, moet het digestiemedium troebel worden door de isolatie van hepatocyten uit de lever.

Filter het troebele digestiemedium met een steriele pipetpunt van 25 milliliter door een nylon celzeef van 70 micrometer in een nieuwe conische polypropyleen buis van 50 milliliter om onverteerde weefseldeeltjes en celresten te verwijderen. Centrifugeer het gecombineerde filtraat bij 50 ×g bij vier graden Celsius gedurende twee minuten, aspireer vervolgens het supernatant dat overtollige celresten bevat en gebruik 25 milliliter koud 1X William's Medium E om de cellen voorzichtig te resuspenderen. Na het drie maal herhalen van het filteren en wassen van de hepatocyten, wordt het supernatant geaspireerd om overtollige celresten te verwijderen.

Resuspendeer de cellen in 25 milliliters verwarmd 1X William's Medium E dat supplementen voor het ontdooien en uitplaten van primaire hepatocyten bevat en filter de suspensie door een nieuwe nylon cell strainer van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Zodra de cellen zijn geteld, worden ze geplateerd in twee milliliters William's Medium E dat supplementen voor het ontdooien en uitplaten van primaire hepatocyten bevat op een collageen-gecoate six well cell culture cluster. Na twee mediumwisselingen om de cellen uiteindelijk te uithongeren, worden de cellen in serumvrij medium behandeld met PBS als vehikel, 25 nanograms per milliliter FGF23, 100 micrograms per milliliter LPS of 50 nanograms per milliliter IL6.

Incubeer de culturen gedurende 24 uur. Nadat het RNA is geprepareerd met een spincolumn-kit volgens de instructies van de fabrikant, voegt u 200 nanogram van het geïsoleerde RNA toe aan een PCR-buisje. Voeg vervolgens 14 microliter endonuclease-vrij water en vier microliter reverse transcriptase toe aan het buisje.

Plaats de PCR-buis in de thermocycler en voer het volgende reverse transcriptieprogramma uit om cDNA te genereren. Combineer voor het uitvoeren van kwantitatieve PCR de volgende componenten van de QPCR-mastermix in een buis op ijs. Vortex de mastermix.

Pipetteer vervolgens negen µL van de oplossing in elke put van een 96-wells plaat. Voeg voorzichtig één µL cDNA toe aan elke put, waarbij drie putten per monster worden voorbereid. Run tot slot de monsters in een real-time PCR-instrument en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol.

Hier wordt een representatieve lichtmicroscopie-afbeelding van primaire geïsoleerde en gekweekte cellen getoond. Immunocytochemische analyse laat zien dat geïsoleerde hepatocyten albumin alsoverwijl fibroblast growth factor receptor 4 sterk tot expressie brengen. In dit experiment werden primaire geïsoleerde hepatocyten gedurende 24 uur behandeld met FGF23, LPS of IL6, waarna de mRNA-niveaus van CRP en IL6 werden geanalyseerd via kwantitatieve real-time PCR.

LPS, IL6 en FGF23 verhoogden de expressie van CRP en IL6 significant. Zoals hier wordt getoond, werden celcultuursupernatanten van geïsoleerde primaire hepatocyten via ELISA geanalyseerd op CRP-spiegels. Zoals aangetoond met QPCR-analyse, verhoogden behandelingen met LPS, IL6 en FGF23 de CRP-spiegels in de celsupernatanten significant in vergelijking met PBS-behandelde cellen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts enkele uren worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Tijdens deze procedure is het belangrijk om een steriele omgeving te handhaven. Omdat er met primaire culturen wordt gewerkt, is het minimaliseren van het risico op mogelijke contaminatie van cruciaal belang voor het behalen van optimale resultaten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u succesvol murine hepatocyten kunt isoleren voor het bestuderen van diverse hepatocellulaire functies, zoals de expressie en secretie van hepatische cytokinen.