Name: Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer functionele hepatocyten isoleren uit muizenlever voor het bestuderen van ontstekingsreacties. Deze methode gebruikt ELISA en real-time PCR om cytokines zoals CRP en IL6 te kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH (R01HL128714 CF) en (F31DK10236101 KS) en de American Heart Association (CF AG).

Alle dieren protocollen en experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Miami Miller School of Medicine. 1. Voorbereiding <ol><li> Verwarm leverperfusie media en lever verteren media in een waterbad bij 37 ° C. </li><li> Stel een perfusie pomp (30 ml / min). Zorgvuldig Prefill de slang systeem van de pomp met leverperfusie media. Vermijd luchtbellen in het systeem en de voorbereiding van de stereotactische microscoop. </li><li> Coat celcultuurschalen middels collageen type I volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 2. Lever Recovery <ol><li> Verdoven van de donor muis met behulp van zuurstof / isofluraan inhalatie (isofluraan 4% / 2 L / min zuurstof). <ol><li> Handhaaf anesthesie door verlaging isofluraan 2-2,5% of door injectie van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal) en xylazine (10 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneally). Continue isofluraan anesthesie voorkeur aangezien ketamine verlaagt de bloeddruk en hepatotoxiciteit veroorzaken. </li></ol></li><li> Plaats de verdoofde muis op een absorberend kussen. Bevestig de ledematen van de muis met plakband. </li><li> Scheer en desinfecteer de buik van de muis en het uitvoeren van een ventrale laparotomie van het schaambeen naar de craniale rand van de lever met behulp van chirurgische schaar met scherpe / stompe uiteinden. Incise de buikwand aan beide zijden, staart van het middenrif. </li><li> Expose de vena cava inferior (IVC) door voorzichtig het verplaatsen van de darm naar de rechterkant. ontleden zorgvuldig vetweefsel rond de IVC met behulp van steriele wattenstaafje swabs en schuine tip tang. </li><li> Incise de suprahepatic diafragma en open de borstholte door twee laterale incisies met behulp van fijne chirurgische schaar met scherpe / scherpe tips. Afbinden de thoracale IVC met behulp van chirurgische zijde (5/0). </li><li> Canule de infrarenale IVC met behulp van een afgeschermde iv catheter, verwijder voorzichtig de naald,sluit de perfusie pomp en start perfuseren de lever. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de lever onmiddellijk beginnen te blancheren en deining. </li><li> Doorsnijden de poortader zodat geschikte afvoer van bloed en perfusie media met behulp van fijne chirurgische schaar. </li><li> Perfuseren van de lever, waarbij ongeveer 30 ml leverperfusie media, en dan overschakelen naar de lever te verteren media (30 ml). Schakel de perfusie pomp en verwijder de canule eenmaal perfusie is voltooid. </li><li> Voorzichtig bloot de centrale regio van de lever en zoek het bindweefsel tussen de lever lobben. Pak de centrale aansluiten van vezels en zorgvuldig te ontleden alle weefsels die de lever op zijn plaats en verwijder voorzichtig de lever. </li><li> Onmiddellijk over de lever in een 50 ml polypropyleen conische buis met 15 ml lever verteren media. NB: Er is geen specifieke tijd-lijn voor deze stap. Na perfusie, de lever blijft digest media voor het transport naar een steriele celkweek kap. alle subsequent stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving. </li></ol> 3. Isolatie en behandeling van Cellen <ol><li> Binnen een celkweek kap, overdracht van de lever van de 50 ml polypropyleen conische buis met de spijsvertering media in een steriele weefselkweek schotel. </li><li> Met behulp van een steriel pincet voorzichtig scheur de vier lobben van de lever. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de spijsvertering medium troebel worden als gevolg van het isoleren van hepatocyten uit de lever. </li><li> Met behulp van een 25 ml steriele pipet tip, filter instellen voor het troebele spijsvertering medium door een 70 um nylon cel zeef in een nieuwe 50 ml polypropyleen conische buis om onverteerd weefsel deeltjes en celresten te verwijderen. </li><li> Herhaal de stappen 3,2 en 3,3 met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dit helpt bij het verwijderen van eventueel resterend hepatocyten van de lever. </li><li> Centrifugeer bij 50 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant bevattende overmaat celafval en voorzichtig resuspendeer cellen in 25 ml koude 1xWilliams &#39;Medium E. </li><li> Met behulp van een 25 ml steriele pipet tip, filter instellen voor het re-suspensie door een nieuwe 70 um nylon cel zeef in een 50 ml polypropyleen conische buis aan een schoner schorsing te bereiken. </li><li> Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor drie extra wassingen met koud Williams &#39;Medium E 1x tot een duidelijker cel suspensie te verkrijgen. </li><li> Na de laatste wasstap, aspiraat supernatant overtollige celresten te verwijderen. Re-schorten en filter cellen in 25 ml warm Williams &#39;Media E 1x dat de primaire hepatocyt ontdooien en plating supplementen bevat door een nieuwe 70 um nylon cel zeef in een 50 ml polypropyleen conische buis. </li><li> Aantal cellen in de 25 ml celsuspensie met een hemocytometer. Gemiddeld verwachten 15-20000000 cellen per volwassene lever. Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw kleuring. </li><li> Plaat cellen in 2 ml Williams &#39;Media E 1x dat primaire hepatocyten ontdooien en uitplaten supplementen op een collageen beklede 6-well ce bevatcultuur cluster II (9 x 10 5 cellen per well). </li><li> Na 4 uur, veranderen media om Williams &#39;Media E 1x dat de primaire hepatocyten onderhoud supplementen bevat. </li><li> Na 24 uur serum verhongeren cellen met Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) media 1x gedurende 6 uur. </li><li> Behandel de cellen met PBS als drager, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 ug / ml) of IL-6 (50 ng / ml) in serumvrij medium en incubeer gedurende 24 uur. </li></ol> 4. Isolatie van RNA <ol><li> Bereid RNA onder toepassing van een commerciële spin kolom kit volgens instructies van de fabrikant. </li></ol> 5. Het genereren van cDNA uit geïsoleerde RNA door reverse transcriptie <ol><li> Voeg 200 ng van geïsoleerde RNA-monster van een PCR-buis. </li><li> Voeg 14 ul van endonuclease-vrij H2O tot PCR-buis van stap 5,1. </li><li> Voeg 4 pi van reverse transcriptase PCR-buis van stap 5,1. </li><li> Re-schorten inhoud zachtjes om mengsel homogeen te maken; centrifuge voorzichtig. </li&gt; <li> Plaats PCR buis met het mengsel in een thermocycler. Run thermocycler voor reverse transcriptie: 1 cyclus van 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) en houdt bij 4 ° C. Het eindproduct zal het gewenste cDNA zijn. </li></ol> 6. Analyse van de cellen door kwantitatieve real-time PCR (qPCR) <ol><li> Bereid de 96-well plaat. <ol><li> Plaats alle componenten van qPCR reactie op ijs: 1 pi cDNA, 0,25 pM forward primer, 0,25 uM reverse primer, 5 pi SYBR Green, 3,5 pl PCR kwaliteit water tot een totaal volume van 10 pi. Met behulp van SYBR Green, voor te bereiden master mix aan alle monsters lopen in drievoud. </li><li> Zodra de master mix is ​​voltooid, vortex homogene maken. Aliquot 9 pi van qPCR master mix in elk putje van een 96-wll plaat. Na voorzichtig voeg 1 pi van cDNA in elk putje. Totaal reactievolume wordt 10 ul worden. </li><li> Na het laden is voltooid, sluit 96-well plaat met optischekleeffolie en kort centrifugeer 96 putjes (50 x g gedurende 1 min). </li></ol></li><li> Run monsters in een Real Time-PCR-instrument. Plaats verzegelde 96-well plaat in Real Time-PCR-instrument en lopen monsters per instrument aanbevelingen van de fabrikant. Voorbeelden van standaard en snelle cycli zijn hieronder opgenomen. <ol><li> Voor standaard cyclusparameters Gebruik de volgende: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 120 s, vervolgens 40 cycli van 94 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 60 s, en vervolgens eventueel houden op 4 ° C. </li><li> Voor snelle cyclusparameters: Gebruik de volgende: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden, vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s, 58 ° C gedurende 15 s, en vervolgens 72 ° C gedurende 10 s. </li></ol></li><li> Raadpleeg instrument handleiding voor aanwijzingen over hoe om gegevens te analyseren. </li></ol> 7. Analyse van celsupernatanten met ELISA Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. </p&gt; <ol><li> monstervoorbereiding <ol><li> Verdeel 398 ul verdunningsmiddel in afzonderlijke buisjes. Pipetteer 2 pi van de cel supernatant monster in de buis 398 pi verdunningsmiddel. Dit zal een verdunning van 200 maal verschaffen. </li><li> Herhaal stap 7.1.1 voor elk te testen monster. </li></ol></li><li> Procedure <ol><li> Pipetteer 100 ul van 200-voudig verdunde monster en standaard in de putjes van een 96-wells plaat. </li><li> Incubeer de 96-well plaat bij 25 ° C gedurende 45 min op een microplaat schudinrichting bij 150 rpm. </li><li> Was de putjes 5 keer met 1x wasbuffer oplossing. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, verwijdert u alle resten van het wassen oplossing met absorberend papier. </li><li> Voeg 500 ul HRP-conjugaat reagens in elk putje. </li><li> Herhaal stap 7.2.2 - 7.2.3. </li><li> Pipetteer 100 ul van tetramethylbenzidine (TMB) reagens aan elke well van 96-well plaat. </li><li> Meng 96-puts plaat bij 25 ° C gedurende 20 min op een microplaatschudinrichting bij 150 rpm. Stop de reactie door het direct toevoegen van 100 pl stopoplossing aan elk putje en meng voorzichtig. Zodra de stopoplossing toegevoegd moet de kleur geel. Dit meldt dat de stop oplossing correct is gemengd. </li><li> Met behulp van een microtiter plaatlezer, de extinctie bij 450 nm in de eerste 5 minuten. </li></ol></li><li> Berekening van de resultaten <ol><li> Berekenen een tabel van de gemiddelde absorptiewaarden (A 450) voor elk monster en elke standaard. </li><li> Monteer een standaard kromme door het uitzetten van de gemiddelde A450 van elke standaard tegen de standaardconcentratie in ng / mL op een lineaire grafiek. Laat de x-as de concentratie en de y-as A 450 waarden vertegenwoordigen vertegenwoordigen. </li><li> Gebruik makend van de gemiddelde A450 van elk verdund monster, het gehalte aan het gewenste eiwit in mg / ml van de standaard curve. </li><li> Vermenigvuldig het monster concentratie door de verdunning factor. Dit maakt de bepaling van de werkelijke concentratie van het gewenste eiwit in de cel supernatant monster. </li><li> Plot de geconstrueerde tafel uit monsters in een lijngrafiek. Als OD 450-waarden buiten de standaardkromme vallen, moeten de monsters op geschikte wijze worden verdund en opnieuw getest. </li><li> Normaliseren resultaten 500.000 cellen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Silverstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+chronic+kidney+disease%3A+role+in+the+progression+of+renal+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephro%22%5BJournal%5D)">Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease.</a> Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).</li>
<li>Isakova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+is+elevated+before+parathyroid+hormone+and+phosphate+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).</li>
<li>Faul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+induces+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">FGF23 induces left ventricular hypertrophy.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).</li>
<li>Gutiérrez, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+mortality+among+patients+undergoing+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22N+England+J+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis.</a> N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).</li>
<li>Munoz Mendoza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+Inflammation+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).</li>
<li>Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+Fibroblast+Growth+Factor-23+with+Markers+of+Inflammation%2C+Insulin+Resistance+and+Obesity+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+directly+targets+hepatocytes+to+promote+inflammation+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. , 1-12 (2016).</li>
<li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Moshage, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interleukin-1%2C+interleukin-6+and+its+interrelationship+on+the+synthesis+of+serum+amyloid+A+and+C-reactive+protein+in+primary+cultures+of+adult+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioch+Biophysi+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes.</a> Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).</li>
<li>Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+for+liver+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models for liver toxicity testing.</a> Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).</li>
<li>Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Hepatocytes+by+a+Two-step+Collagenase+Perfusion+Procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Isolation+of+Primary+Human+Hepatocytes+and+Corresponding+Major+Populations+of+Non-parenchymal+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Moshage, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+the+hepatic+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytokines and the hepatic acute phase response.</a> J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).</li>
<li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782563/">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li>
<li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+pathway+in+the+liver%3A+From+physiopathology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li>
<li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShulman%2C+M+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 945, 287-302 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Het isoleren van primaire hepatocyten van muizen is een snel, goedkoop en betrouwbaar hulpmiddel om ontstekingsreacties ex vivo te bestuderen. Indien correct uitgevoerd, kunnen de resultaten eenvoudig worden gegenereerd en gereproduceerd op een tijdige en kostenefficiënte manier. De volgende punten moet zorgvuldig worden beoordeeld met het oog op een succesvolle isolatie te waarborgen. De chirurgische incisie en de canule van het IVC moet worden uitgevoerd onder algemene verdoving e...

Chronische nierziekte (CKD) kan worden gedefinieerd als een toestand van acute en chronische ontsteking 1. Bij patiënten met CKD, serum niveaus van het hormoon phosphaturic fibroblast groeifactor 23 (FGF23) geleidelijk stijgen, om het serum fosfaat homeostase 2 te handhaven. Verhoogde serum niveaus FGF23 onafhankelijk geassocieerd met cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit bij patiënten die beginnen hemodialysebehandeling 3, 4. Bovendien hebben verschillende klinische studies aangetoond een sterke correlatie tussen verhoogde niveaus FGF23 en serum niveaus van C-reactief proteïne (CRP), interleukine-6 (IL-6) en tumornecrosefactor α (TNFa) 5, 6. Bovendien is in een experimentele studie werd onlangs aangetoond dat FGF23 direct richten hepatocyten en een ontstekingsreactie door het verhogen CRP en IL-6 p veroorzakenroduction in de lever 7. Daarom FGF23 kan fungeren als een circulerende factor die bijdraagt ​​aan systemische ontsteking in CKD. In de vroege jaren &#39;70, de primaire hepatocyten werden geïsoleerd en bestudeerd voor de eerste keer 8. Sindsdien primair gekweekte levercellen zijn uitgebreid gebruikt metabolische verwerking, hormonale functie, metabolisme en toxiciteit en immuniteit en ontstekingsreacties 9 onderzoeken 10. Vorige protocollen zijn voornamelijk de enzymatische isolatie van primaire hepatocyten uit menselijk leverweefsel 11, 12. Terwijl een uitstekend model, laat dit uit de mogelijkheid om te onderzoeken hoe genetische manipulatie beïnvloedt complex lever signalering mechanismen evenals functionele gevolgen op verschillende soorten stimuli. Hieronder beschrijven we de isolatie van muizen hepatocyten. Met name kan het effect van verschillende mediatoren van de hepatische acute fase respons, zoals lipopolysaccharide (LPS), IL-6 en FGF23 worden geanalyseerd op een gemakkelijke, snelle en reproduceerbare wijze 13. Hierin presenteren we een protocol voor de enzymatische isolatie van hepatocyten van volwassen muizen, en we tonen aan dat vastgesteld inductoren van ontsteking, zoals LPS en IL-6, alsook nieuwe ontstekingsmediatoren zoals FGF23 rechtstreeks expressie en uitscheiding van kunnen stimuleren inflammatoire cytokines, zoals CRP en IL-6 in gekweekte hepatocyten.

<table><tbody><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &mu;m Nylon cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 6-inch Cotton Tipped Applicators&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 well Cell Culture Cluster</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Perfusion Pump</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Kits, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Cover Glasses, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissers - Sharp/Blunt</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors-ToughCut Straight</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Student Tissue Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid solution, 2.0 N</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&nbsp;&nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/mL</td><td>AnaSed Injection</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Willams' Medium E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Liver Perfusion Medium (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td><td>Life Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td><td>Life Technologies</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van muizen

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

De lever speelt een beslissende rol in de regulering van systemische ontsteking. Bij chronische nierziekte in het bijzonder de lever reageert in reactie op de uremische milieu, oxidatieve stress, endotoxemie en verminderde klaring van circulerend proinflammatoire cytokinen door het produceren van een groot aantal acute fase reactanten. Experimentele instrumenten te bestuderen ontsteking en de achterliggende rol van hepatocyten zijn cruciaal voor de regulering en de bijdrage van hepatische cytokinen ze systemisch acute fase respons en langere pro-inflammatoire scenario, vooral in een ingewikkelde omgeving begrijpen zoals chronische nierziekte. Aangezien het bestuderen van complexe mechanismen van een ontsteking in vivo uitdagend blijft, resource-intensieve en meestal vereist het gebruik van transgene dieren, primaire geïsoleerde hepatocyten zorgen voor een robuust hulpmiddel om mechanistische inzicht te krijgen in de lever acutefasereactie. Aangezien dit in vitro techniek beschikt over een matige kosten, hoge reproduceerbaarheid en gemeenschappelijke technische kennis, geïsoleerde primaire hepatocyten kunnen ook gemakkelijk worden gebruikt als een screening aanpak. We beschrijven hier een enzymatische methode gebaseerd op primaire muizen hepatocyten te isoleren en beschrijven we de beoordeling van een ontstekingsreactie in deze cellen middels ELISA en kwantitatieve real-time PCR.

histologie Vertegenwoordiger lichtmicroscopie beelden van primaire geïsoleerde en gekweekte cellen zijn weergegeven in figuur 1A. Immunocytochemische analyse toont dat afzonderlijke hepatocyten sterk tot expressie albumine (rood) en fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) (groen). Kernen zijn gekleurd met 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blauw). (Figuur 1B). <p class="jove_step...

Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Het algemene doel van deze procedure is het succesvol isoleren van functionele muishepatocyten voor het bestuderen van de expressie en secretie van inflammatoire cytokinen, zoals CRP en IL6, als reactie op mediatoren van de hepatische acute-fase-respons. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de hepatocellulaire functie en de bijdrage van hepatische cytokinen aan een langdurige inflammatoire omgeving, zoals die wordt aangetroffen bij chronische nierziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een robuust instrument biedt voor een eenvoudige, snelle en reproduceerbare analyse van hepatische metabolomics en inflammatie, evenals de respons op geneesmiddelen.Begin met het voorverwarmen van het leverperfusiemedium en het leverdigestiemedium in een waterbad op 37 °C. Stel een perfusiepomp in zoals hier wordt getoond. Gebruik vervolgens leverperfusiemedium om het slangensysteem van de pomp voorzichtig vooraf te vullen.Probeer luchtbellen in het systeem te vermijden. Bereid de stereotactische microscoop voor op de perfusieprocedure. Plaats vervolgens het gedoseerde donormuis, nadat deze volgens het tekstprotocol is geanestheseerd, op een absorberend matje.Gebruik plakband om de extremiteiten van de muis te fixeren. Scheer vervolgens de buik van de muis en desinfecteer deze. Gebruik daarna chirurgische scharen met scherp-botte punten om een ventrale laparotomie uit te voeren vanaf het schaambeen tot aan de craniale rand van de lever.Maak aan beide zijden een incisie in de buikwand op een positie caudaal van het diafragma. Leg de vena cava inferior of IVC vrij door de darm voorzichtig met steriele wattenstaafjes naar de rechterkant te verschuiven. Maak met een fijne chirurgische schaar met scherpe punten laterale incisies door het suprahepatische diafragma en open de borstholte.Gebruik vervolgens 5-0 chirurgische zijde om de thoracale vena cava inferior (IVC) af te binden. Cannuleer de infrarenale IVC met een afgeschermde IV-katheter. Sluit de perfusiepomp aan en start met het perfunderen van de lever.Indien correct uitgevoerd, zou de lever onmiddellijk moeten beginnen te bleken en op te zwellen. Transecteer vervolgens met een fijne chirurgische schaar de vena portae, zodat bloed en perfusiemedium adequaat kunnen worden afgevoerd. Stop de perfusiepomp nadat de lever is geperfuseerd met ongeveer 30 milliliters leverperfusiemedium.Schakel over naar leverdigestiemedium en zet de pomp weer aan. Zodra de perfusie is voltooid, verwijdert u de canule. Leg voorzichtig de centrale regio van de lever bloot en lokaliseer het bindweefsel dat de leverlobben met elkaar verbindt.Pak de centrale verbindingsvezels vast en ontleed voorzichtig alle weefsels die de lever op zijn plaats houden. Verwijder vervolgens voorzichtig de lever. Breng het orgaan onmiddellijk over in een conische polypropyleen buis van 50 milliliter met 15 milliliter leverdigestiemedium.Breng de lever, terwijl u in een celkweekkast werkt, over van de polypropyleen conische buis van 50 milliliter naar een steriele weefkweekschaal. Scheur de vier leverkwabben voorzichtig open met steriele pincetten. Indien correct uitgevoerd, moet het digestiemedium troebel worden door de isolatie van hepatocyten uit de lever.Filter het troebele digestiemedium met een steriele pipetpunt van 25 milliliter door een nylon celzeef van 70 micrometer in een nieuwe conische polypropyleen buis van 50 milliliter om onverteerde weefseldeeltjes en celresten te verwijderen. Centrifugeer het gecombineerde filtraat bij 50 ×g bij vier graden Celsius gedurende twee minuten, aspireer vervolgens het supernatant dat overtollige celresten bevat en gebruik 25 milliliter koud 1X William's Medium E om de cellen voorzichtig te resuspenderen. Na het drie maal herhalen van het filteren en wassen van de hepatocyten, wordt het supernatant geaspireerd om overtollige celresten te verwijderen.Resuspendeer de cellen in 25 milliliters verwarmd 1X William's Medium E dat supplementen voor het ontdooien en uitplaten van primaire hepatocyten bevat en filter de suspensie door een nieuwe nylon cell strainer van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Zodra de cellen zijn geteld, worden ze geplateerd in twee milliliters William's Medium E dat supplementen voor het ontdooien en uitplaten van primaire hepatocyten bevat op een collageen-gecoate six well cell culture cluster. Na twee mediumwisselingen om de cellen uiteindelijk te uithongeren, worden de cellen in serumvrij medium behandeld met PBS als vehikel, 25 nanograms per milliliter FGF23, 100 micrograms per milliliter LPS of 50 nanograms per milliliter IL6.Incubeer de culturen gedurende 24 uur. Nadat het RNA is geprepareerd met een spincolumn-kit volgens de instructies van de fabrikant, voegt u 200 nanogram van het geïsoleerde RNA toe aan een PCR-buisje. Voeg vervolgens 14 microliter endonuclease-vrij water en vier microliter reverse transcriptase toe aan het buisje.Plaats de PCR-buis in de thermocycler en voer het volgende reverse transcriptieprogramma uit om cDNA te genereren. Combineer voor het uitvoeren van kwantitatieve PCR de volgende componenten van de QPCR-mastermix in een buis op ijs. Vortex de mastermix.Pipetteer vervolgens negen µL van de oplossing in elke put van een 96-wells plaat. Voeg voorzichtig één µL cDNA toe aan elke put, waarbij drie putten per monster worden voorbereid. Run tot slot de monsters in een real-time PCR-instrument en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol.Hier wordt een representatieve lichtmicroscopie-afbeelding van primaire geïsoleerde en gekweekte cellen getoond. Immunocytochemische analyse laat zien dat geïsoleerde hepatocyten albumin alsoverwijl fibroblast growth factor receptor 4 sterk tot expressie brengen. In dit experiment werden primaire geïsoleerde hepatocyten gedurende 24 uur behandeld met FGF23, LPS of IL6, waarna de mRNA-niveaus van CRP en IL6 werden geanalyseerd via kwantitatieve real-time PCR.LPS, IL6 en FGF23 verhoogden de expressie van CRP en IL6 significant. Zoals hier wordt getoond, werden celcultuursupernatanten van geïsoleerde primaire hepatocyten via ELISA geanalyseerd op CRP-spiegels. Zoals aangetoond met QPCR-analyse, verhoogden behandelingen met LPS, IL6 en FGF23 de CRP-spiegels in de celsupernatanten significant in vergelijking met PBS-behandelde cellen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts enkele uren worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Tijdens deze procedure is het belangrijk om een steriele omgeving te handhaven. Omdat er met primaire culturen wordt gewerkt, is het minimaliseren van het risico op mogelijke contaminatie van cruciaal belang voor het behalen van optimale resultaten.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u succesvol murine hepatocyten kunt isoleren voor het bestuderen van diverse hepatocellulaire functies, zoals de expressie en secretie van hepatische cytokinen.

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Infectie van muizen met een adenovirus uiting van de belangrijkste humane autoantigeen cytochroom P450 2D6 (hCYP2D6) erkend door sera van patiënten die lijden aan type 2-auto-immune hepatitis resulteert in een blijvende vorm van auto-immuun-gemedieerde lever ziekte die wordt gekenmerkt door uitgestrekte hepatitis, fibrose en genereren van een CYP2D6 -specifieke immuunrespons.

De CYP2D6 Animal Model: Hoe kan ik auto-immune hepatitis induceren in Muizen

Verstoring van de galstroom resulteert in ernstige inflammatoire cholestatische leverbeschadiging met een karakteristieke tijdsafhankelijke sequentie van morfologische veranderingen. Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische ligatie van de gemeenschappelijke galgang bij muizen die het mogelijk maakt om een sterke fibrotische respons te induceren na 21 tot 28 dagen.

Bile-duct Ligatie in Muizen: Inductie van Inflammatoire leverschade en Fibrosis door Obstructive Cholestase

Hier beschrijven we een gemeenschappelijke methode om chronische lever schade in muizen door het eten van een dieet van choline-deficiënte en ethionine-aangevuld (CDE). We tonen gezondheidsmonitoring, lever perfusie, isolatie en behoud. Een tijdsverloop van zes weken kan informeren over de lever schade, pathohistology, fibrose, inflammatoire, en lever progenitor cel reacties.

De lymfkliertest Choline-deficiënte, Ethionine-aangevuld (COB) dieet Model van chronische lever schade

We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Hier beschrijven we de ontwikkeling van een klinisch relevant muriene model van leverkanker die de typische immuunkenmerken van hepatocellulaire kanker (HCC) recapituleren.

Een oncogene hepatocyte-geïnduceerde Orthotopic muis model van hepatocellulaire kanker ontstaan in de setting van leverontsteking en fibrose

Een eenvoudige en betrouwbare dieet-geïnduceerde knaagdier model voor niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) wordt beschreven, bereikt door niet-SPF huisvesting van de dieren en het beheer van een specifieke high-fat dieet. Wij beschrijven de identificatie van de lever-en vetweefsel immuun cel subsets aan recapituleren menselijke immunologische omstandigheden door bloot muizen aan milieu-kiemen.

Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes

In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het induceren van lever vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen met het vetzuur zout natriumoleaat en gebruiken we methoden voor de detectie en kwantificering van lipide accumulatie, inclusief coherente anti-Stokes Raman verstrooiing (AUTO'S) microscopie, cytofluorimetrische analyse, olie rood O kleuring, en qPCR.

Het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Deze video laat zien hoe u auto-immune hypophysitis induceren in SJL muizen en hoe u de ernst ervan te beoordelen door de histopathologie.

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

Leer functionele hepatocyten isoleren uit muizenlever voor het bestuderen van ontstekingsreacties. Deze methode gebruikt ELISA en real-time PCR om cytokines zoals CRP en IL6 te kwantificeren.

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

Meer video's verkennen