Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Het algemene doel van dit experiment is om de biochemische paden te onderzoeken die worden geactiveerd als reactie op spanning met behulp van ligand-gecoate magnetische microkralen en geforceerde toepassing op adhesiereceptoren. Deze methode kan helpen vragen te beantwoorden op het gebied van mechanische transacties, zoals hoe mechanische spanning van de express helometrics ze richten op differentiatie of hoe weefselcompliantie hun transformatie aandrijft. Het grote voordeel van deze techniek is dat veel cellen kunnen worden gestimuleerd voor chemische analyse door kralen te gebruiken om spanning uit te oefenen op een specifiek deel van de adhesiereceptoren.

Om te beginnen, resuspendeer de superparamagnetische tosylgeactiveerde kralen grondig in het oorspronkelijke flesje door minimaal 30 seconden te vortexen. Pipetteer 40 microliter van de gesuspendeerde superparamagnetische kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die één milliliter 0,1 molair natriumfosfaat pH 7,4 bevat. Plaats vervolgens de buis op een magnetische scheidingstandaard om de magnetische kralen van de oplossing te scheiden.

Gooi het supernatant weg en verwijder de buis van de magnetische scheidingstandaard. Resuspendeer de kralen in één milliliter 0,1 molair natriumfosfaat pH 7,4. Na twee keer wassen van de kralen, resuspendeer de kralen in één milliliter van dezelfde buffer.

Combineer vervolgens 100 microgram bovien fibronectine of een andere cel-adhesierecepteurligand met de kralen en vortex. Herhaal deze stap door het ligand te vervangen door BSA, poly-D-lysine of apotransferrine voor negatieve controles. Incubeer de kralen met de ligandbevattende oplossing gedurende 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius op een rotor.

Als er kralenaggregaten verschijnen nadat de reactie heeft plaatsgevonden, soniqueer gedurende maximaal 10 tot 20 seconden. Isolateer vervolgens de kralen met behulp van een magnetische scheidingstandaard en aspireer de resterende oplossing. Voeg vervolgens één milliliter van een PBS-oplossing aan met 0,2% bovien serumalbumine toe.

Incubeer gedurende één uur op een rotor bij 37 graden Celsius. Gebruik een magneet om de kralen twee keer te wassen met één milliliter PBS-oplossing aangevuld met 0,2% bovien serumalbumine. Voordat u ze resuspendeert in één milliliter van dezelfde buffer.

Soniqueer de kralen als er aggregaten verschijnen gedurende maximaal 20 tot 30 seconden. Ga verder met de celassays of bewaar de kralen maximaal één maand bij vier graden Celsius. Kweek adherente cellen op een weefselkweekschaal van 60 milliliter in geschikt groeimedium totdat ze 80% confluent zijn.

Nadat de ligand-gecoate kralen zijn gepelleteerd, resuspendeer de pellet in één milliliter PBS-oplossing aangevuld met 0,2% bovien serumalbumine. Voeg 100 microliter van de ligand-gecoate kralenoplossing toe aan vijf milliliter warm kweekmedium en vortex. Aspireer vervolgens het medium in een weefselkweekschaal van 60 milliliter en voeg vijf milliliter warm groeimedium toe dat is aangevuld met kralen.

Incubeer de suspensie gedurende 20 minuten onder celkweekcondities om de kralen te laten sedimenteren en aan de cellen te hechten. Het is cruciaal om de 20 minuten niet te overschrijden, omdat kralen door fagocytose kunnen worden geïnternaliseerd. Observeer vervolgens de kralen onder een lichtmicroscoop met een 10X of 20X objectief.

Controleer op kralenhechting door de schaal lichtjes te schudden om onderscheid te maken tussen gehechte en zwevende kralen. Plaats een ronde neodymiummagneet van 38 millimeter op de bovenkant van een normale 60 millimeter kweekschaallid en houd deze op zijn plaats met behulp van twee kleinere neodymiummagneten van 13 millimeter op de onderkant van het deksel. Incubeer de cellen die aan spanning zijn blootgesteld gedurende de gewenste tijdstippen en celkweekcondities.

Verwissel het normale schotelsdeksel voor een deksel met de magneet. Aangezien de magneten erg krachtig zijn, manipuleer ze voorzichtig. Na behandeling plaatst u de schaal op ijs en aspireert u voorzichtig het gehele medium uit de schaal.

Voeg 300 microliter cellysebuffer toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Verzamel vervolgens het lysaat met behulp van een celschraper en breng het over naar een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Pellet de magnetische kralen met behulp van de magnetische scheidingstandaard en breng het totale cellysaat over naar een nieuwe, voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Verwijder een aliquot van 15 microliter van het totale cellysaat dat is verkregen na scheiding van de kralen voor western blot-analyse. Was de kralen drie keer met één milliliter ijskoude lysebuffer. Voeg vervolgens 50 microliter monsterbuffer toe aan het kralenpellet.

Na het mengen van de suspensie door te vortexen, kook deze gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius met behulp van een droogblokhouder. Deze fractie bevat de geïsoleerde adhesiecomplexen. Ga verder met biochemische analyse of bewaar de fractie bij min 20 graden Celsius.

Deze figuur wordt getoond om de zuivering van de adhesiecomplexen te demonstreren. GAPDH-immunoblotting wordt gebruikt als ladingscontrole voor totaal cellysaat en om de zuiverheid van de adhesiecomplexen te controleren. Een lange belichting werd gebruikt om de afwezigheid van cytoplasmatisch signaal in de gezuiverde adhesiecomplexfractie te valideren.

Fibronectine-gecoate kralen werden gebruikt om de mechano-transductieprocessen te onderzoeken die zich na verloop van tijd voordoen bij de adhesiecomplexen als reactie op spanning. Na magnetische scheiding van de adhesiecomplexfractie werden het lysaat en de adhesiecomplexfractie geanalyseerd door middel van western blot. Ladingscontrole en kandidaten die bekend zijn om gerekruteerd of gefosforyleerd te worden bij adhesiecomplexen als reactie op mechanische spanning werden geïmmunoblotted.

Terwijl spanning de Paxillin-rekrutering naar de adhesiecomplexen niet beïnvloedde, werd de fosforylering ervan op tyrosine 31 versterkt als reactie op mechanische spanning, zowel in het totale cellysaat als in de adhesiecomplexfractie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u spanningskrachten kunt toepassen op adhesie-oppervl