Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Het algemene doel van dit biochemische protocol is het genereren van nucleosomen met differentieel isotoopgelabelde zusterhistonen. Dit is bedoeld voor gebruik bij het gelijktijdig in kaart brengen van posttranslationele modificatiereacties op beide zusterhistonen. Het algemene doel van dit biochemische protocol is het genereren van nucleosomen met differentieel isotoopgelabelde zusterhistonen voor gebruik bij het gelijktijdig in kaart brengen van posttranslationele modificaties op beide zusterhistonen.

Deze methode, in combinatie met resolutie-technieken voor het in kaart brengen van posttranslationele modificaties, zoals bij massaspectrometrie, beantwoordt kernvragen in de chromatinbiologie, zoals welke mechanismen bijdragen aan de vorming van symmetrisch gemodificeerde nucleosomen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig kan worden opgezet in een biochemisch laboratorium, aangezien het standaardprotocollen voor nucleosoomreconstitutie combineert met gangbare methoden voor eiwitzuivering. Twee pools histon H3 zullen worden gebruikt voor de reconstitutie vanHet octameer.

Stikstof-15 gemerkte H3 die een polyhistidine-tag aan de amino-terminus bevat, en koolstof-13 gemerkte H3 die een streptavidine-affiniteitstag aan de amino-terminus bevat. Begin deze procedure door de geliofiliseerde histon-aliquoten, inclusief de twee typen histon H3, op te lossen in ontvouwingsbuffer. Voeg aan elke buis die ongeveer vijf milligram histonen bevat één milliliter ontvouwingsbuffer toe en meng door te pipetteren, maar vortex niet.

Houd de buisjes 30 minuten op ijs om volledige ontvouwing mogelijk te maken. Meet vervolgens de absorbentie bij 280 nanometer om de exacte concentratie van elk histon te bepalen. Meng de kernhistonen in equimolaire verhoudingen, waarbij rekening wordt gehouden met de opname van elk 50% van de twee histone H3-pools.

Gebruik ontvouwingsbuffer om de uiteindelijke proteïneconcentratie aan te passen tot ongeveer één milligram per milliliter. Breng het mengsel over naar een dialysemembraan met een afsnijwaarde van zes kilodalton. Dialyseer vervolgens tegen één tot twee liter gekoelde refoldingsbuffer bij vier graden Celsius.

Verzamel de volgende dag het gedialyseerde materiaal en verwijder eventuele neerslagen door middel van centrifugatie in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op maximale snelheid. Nadat de octameerconcentratie is bepaald, dient een centrifugale filtereenheid met een cutoff van 10 kilodalton te worden gebruikt om de octameer te concentreren tot een eindvolume van ongeveer twee milliliter. Er dient een octameerconcentratie tussen 50 en 100 micromolar te worden verkregen.

Bereid de gelfiltratie voor door de gelfiltratiekolom op een FPLC-systeem aan te sluiten. Equilibreer met twee kolomvolumes, of CV, van 0,22 micrometer gefilterde en ontgaste refoldingbuffer. Injecteer het geconcentreerde materiaal bij een stroomsnelheid van één milliliter per minuut en verzamel fracties van één tot 1,5 milliliter.

Om deze procedure te starten, worden de relevante fracties die zuivere octameren bevatten samengevoegd en wordt de concentratie bepaald zoals eerder beschreven. Sluit een kolom van één milliliter met nikkelnitrilotriacetaat of nikkel-NTA aan op het FPLC-systeem. Equilibreer vervolgens met 10 CV van 0,22 µm gefilterde en ontgaste refoldingbuffer bij een stroomsnelheid van 1 ml per minuut.

laat het gezuiverde octameer door de nikkel-NTA stromen met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut. Verzamel de doorstroomfractie. Elueer met 10 CV refolding-buffer die 250 millimolaire imidazole bevat, met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut.

Vang de nikkel-NTA-elutie op. De streptavidine-gebaseerde zuivering dient idealiter in een koudekamer te worden uitgevoerd. Equilibreer een affiniteitskolom van één milliliter commercieel streptavidine met 10 CV refoldingbuffer die 250 millimolair imidazole bevat, met gebruik van een batch-gravitatiestroomopstelling.

Breng het nikkel-NTA-eluat door de streptavidine-affiniteitskolom. Verzamel de doorloop. Elueer met 10 CV refoldingsbuffer die 2,5 millimolaire desthiobiotine bevat.

Vang het eluaat op. Voeg na het meten van de octameerconcentratie in het eluaat 10 keer minder TEV-protease toe en laat de reactie een nacht lang doorgaan bij vier graden Celsius. Breng het mengsel de volgende dag over naar een dialysemembraan met een cutoff van 50 kilodalton en dialyseer dit een nacht lang tegen refoldingbuffer bij vier graden Celsius.

Concentreer het gezuiverde asymmetrische octameer met een centrifugale filtereenheid met een cutoff van 10 kilodalton tot een volume van één tot twee milliliter. De verwachte octameerconcentratie is 20 tot 50 micromolair. Voor nucleosoomreconstitutie is DNA nodig dat een nucleosoompositioneringssequentie bevat.

Pas de zoutconcentratie van het DNA aan naar twee molair natriumchloride met behulp van een vijf molaire natriumchloride-stockoplossing. Meng het DNA met de octameer en de refoldingbuffer met gebruik van de optimale octameer-DNA-verhouding die via een kleinschalige test is bepaald. Voeg de octameer als laatste toe om elke mogelijkheid van menging van de octameer en het DNA bij een zoutconcentratie lager dan twee molair te voorkomen.

Overbreng het mengsel naar een dialysemembraan met een afsnijpunt van zes kilodalton en dialyseer dit gedurende de nacht tegen één liter refoldingbuffer bij vier graden Celsius. Verlaag de volgende dag de zoutconcentratie van de dialysebuffer stapsgewijs, waarbij het monster gedurende ten minste drie uur in elke natriumchloridebuffer blijft.

Breng vervolgens het dialysemembraan over naar een bekerglas met één liter assaybuffer en zet de dialyse overnacht voort bij vier graden Celsius. Verzamel de volgende dag het gedialyseerde monster. Verwijder eventueel gevormd neerslag door middel van centrifugatie in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op maximale snelheid.

Concentreer het monster met een centrifugeerfiltereenheid met een afsnijwaarde van 30 kilodalton tot een eindvolume van ongeveer 300 microliters. Meet de DNA-concentratie bij 260 nanometers. De uiteindelijke concentratie moet in het bereik van 10 tot 20 micromolair liggen.

Bewaar het monster bij vier graden Celsius gedurende maximaal enkele weken. Een gelfiltratie-elutieprofiel van het hervouwen histonmengsel laat zien dat de histonoctameren elueren bij ongeveer 70 milliliters. Een SDS-PAGE-gel toont de correcte histonstoichiometrie.

De gereconstitueerde octamere pool die de drie typen octameren bevat, wordt onderworpen aan een tandem-affiniteitszuiveringsschema. De isolatie van asymmetrische species wordt geverifieerd door de aanwezigheid van de affiniteitstag. De affiniteitstags worden vervolgens verwijderd met TEV-protease.

Een kleinschalige nucleosoomreconstitutie met verschillende molaire verhoudingen van DNA ten opzichte van het octameer toonde aan dat een verhouding van één op één optimaal was. Een grootschalige nucleosoomreconstitutie werd uitgevoerd met de geoptimaliseerde molaire verhouding van DNA ten opzichte van het octameer, waarbij de juiste stoichiometrie van de vier kernhistonen werd waargenomen. NMR-spectroscopie van differentieel isotoopgelabelde nucleosomen bevestigde de aanwezigheid van stikstof 15-gelabelde en koolstof 13-gelabelde zuster-H3-histonen.

In dit toepassingsvoorbeeld werden nucleosomen die differentieel isotoopgelabeld en asymmetrisch gefosforyleerd waren op C ring 10 van histon H3, gereageerd met GCN5-acetyltransferase. De acetylering van histon H3 lysine 14 op beide H3-kopieën werd in real-time gevolgd met NMR-spectroscopie. De analyse onthulde dat fosforylering van C ring 10 van histon H3 de acetylering van histon H3 lysine 14 door GCN5 in cis stimuleert in vergelijking met in trans.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vijf dagen worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe nucleosomen die zusterhistonen met verschillende kenmerken bevatten, gereconstitueerd kunnen worden.