Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Het algemene doel van deze procedure is om een gemakkelijke manier te bieden om de expressie van ionkanalen in heterologe systemen te controleren en tegelijkertijd langdurige celkweekcomplicaties te vermijden. Hierdoor wordt een manier geboden om de omstandigheden tussen experimenten te controleren en meer reproduceerbare resultaten te genereren. Deze methode kan helpen bij het faciliteren van onderzoek op het gebied van ionkanalen.

Zoals het karakteriseren van kanaaleigenschappen in de farmacologie. Aangezien de huidige methoden ofwel complex zijn ofwel inconsistente eiwitexpressie vertonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we gecontroleerde expressieniveaus van een breed scala aan eiwitten kunnen bereiken, afgestemd op individuele experimenten binnen een relatief korte tijd.

Om deze procedure te starten, zet TREX 293 cellen over naar een 12-wellplaat voorbereid met 0,9 milliliter volledig DMEM per put voor het genereren van 50 procent confluentie. En incubeer de cellen een nacht bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator. Bereid vervolgens een transfectiemixtuur samengesteld uit DMEM, het gen van belang, hier getoond, TRPV1, een inert plasmide en het lipide transfectie reagens.

Voor elektrofysiologische experimenten, neem EGFP op in het zoogdierexpressieplasmide in de transfectiecocktail om de cellen die succesvol transfectie ondergaan, te visualiseren. Incubeer het transfectiemengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bewerk de cellen vervolgens door het transfectiemengsel druppelsgewijs op de geplaatste cellen in de 12-wellplaat te pipetten.

Schudden de plaat krachtig om een homogene verspreiding van DNA en transfectiereagens te garanderen. Daarna, incubeer de getransfecteerde cellen een nacht bij 27 graden Celsius. De volgende ochtend, als elektrofysiologie wordt uitgevoerd, bevestig dat de cellen succesvol zijn getransfecteerd door het fluorescerende signaal van EGFP onder een UV-lamp te observeren.

Als elektrofysiologie wordt uitgevoerd, zet cellen van de 12-wellplaat over naar PDL gecoate deksels in 500 microliter volledige DMEM. Als calciumbeeldvorming wordt uitgevoerd, plaats ongeveer 20.000 cellen op PDL gecoate calciumbeeldvormingskamers. Bereid in deze procedure een doxycycline-stamotoplossing voor bij één milligram per milliliter in dubbel gedistilleerd water.

Bescherm de stamotoplossing tegen licht bij vier graden Celsius gedurende maximaal drie weken. Voor langdurige opslag, bewaar de doxycycline-stamotoplossing bij min twintig graden Celsius. Bereid vervolgens verse doxycycline-oplossing in volledige DMEM.

En verwarm het tot 37 graden Celsius. Voor elektrofysiologische opnames, pipet 500 microliter doxycycline-oplossing bij twee microgram per milliliter naar elke put om een ​​eindconcentratie van doxycycline bij één microgram per milliliter te maken. Voor calciumbeeldvorming, voeg 100 microliter doxycycline-oplossing toe bij drie microgram per milliliter naar elke put om een ​​eindconcentratie van doxycycline bij één microgram per milliliter te maken.

Incubeer het monster voor de gewenste hoeveelheid tijd voor inductie bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Om de eiwitexpressie door calciumbeeldvorming te kalibreren, bereid Ringer's oplossing voor en verwarm deze tot 37 graden Celsius. Om de verspreiding van AM-esters, een fluorescerende ionenindicator, zoals Fura-2 in aquose soluties, te helpen, bereid een oplossing van non-ionisch F-127 in DMSO.

Verwarm de oplossing tot 27 graden Celsius totdat de non-ionische F-127 is opgelost. Bewaar vervolgens de non-ionische F-127-oplossing bij kamertemperatuur en verwarm deze opnieuw tot 37 graden Celsius voor gebruik. Bereid vervolgens een Fura-2 AM-ladingoplossing van de Ringer's-oplossing, aangevuld met twee tot drie micromolar Fura-2 AM, 02 milligram per milliliter non-ionisch F-127 en 10 millimolar D-glucose.

Zuig vervolgens het medium van de cellen in de kamers af en vervang het door Fura-2 AM-ladingoplossing. Incubeer de cellen gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Zuig vervolgens de Fura-2 AM-oplossing af.

En spoel de cellen met Ringer's en 10 millimolar D-glucose-oplossing om extra cellulaire kleurstof te verwijderen. Laat 200 microliter Ringer's en 10 millimolar D-glucose-oplossing in elk achter. En incubeer het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Na 30 minuten, plaats de kamer op de tafel boven het microscoopneusstuk en zet het vast met een houder. Bereken vervolgens en bereid een werkconcentratie van de TRPV1 specifieke agonist capsaïcine volgens de gewenste eindconcentratie. Zet vervolgens de lamp, camera en microscoop aan en selecteer Fura-2 filter om emissie bij 510 nanometer golflengte te detecteren.

Pas aan voor de gewenste vergroting en focus de cellen in het geselecteerde veld door deze parameters te manipuleren met behulp van de microscoopknoppen. In het donker, trek achtergrondlicht af en stel de belichtingstijd in. Stel beeldsampling in op de gewenste snelheid.

Begin vervolgens met het opnemen van de fluorescentierespons van Fura-2 beladen cellen door ze te exciteren bij 340 nanometer en 380 nanometer golflengtes. De verhouding van 340 tot 380 signalen is een indicator voor intracellulaire calciumconcentratie en dus ook voor TRPV1 activiteit. Voeg vervolgens twee micromolar capsaïcine toe in 200 microliter Ringer's oplossing om een ​​eindverzadigde concentratie van één micromolar capsaïcine te creëren om de expressieniveau van TRPV1 te evalueren en de TRPV1 respons te analyseren.

Om de ideale inductietijd voor single channel opname te bepalen, bereid eerst de bad- en pijptoplossingen voor. Bereid vervolgens enkele glaspijpen voor, vuur gepolijst tot een weerstand van 10 tot 12 megaohms. Voer gehele cel patch clamp uit door een afdichting op het membraan van de doelcel te creëren.

Stel vervolgens het holding potentieel in op min 40 millivolt. En scheurt het membraan door negatieve druk toe te passen. Daarna, gebruik de micromanipulator om de pijp met het membraanpatch weg van de cel te tillen.

Plaats