Name: Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een In Vitro Model van het menselijk bloed-hersenbarrière (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer lymfocyt extravasatie analyseren met een in vitro model van de menselijke bloed-hersenbarrière. Deze methode biedt inzicht in ontstekingsprocessen in het centrale zenuwstelsel en ondersteunt therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie is ondersteund door het Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 naar H.W. en C.C.G., project B1 naar N.S.).

1. Cell Culture of Human Brain microvasculaire endotheelcellen (HBMEC) <ol><li> Coating van celkweek kolven <ol><li> De fibronectine te bereiden, voeg 10 ml PBS om een ​​15 ml centrifugebuis. Voeg 150 ul fibronectine en meng goed. </li><li> Met het onderdeksel een celkweekkolf T-25 2 ml van de fibronectine-oplossing. Incubeer de celkweek kolf gedurende ten minste 3 uur bij 37 ° C in de incubator. Fibronectine gecoate kolven worden opgeslagen gedurende 2 weken bij 37 ° C / 5% CO2. </li></ol></li><li> Zaaien en celcultuur van HBMEC <ol><li> Aspireren fibronectine oplossing uit de bodem van de celkweek kolf. Voeg 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² gesuspendeerd in 6 ml ECM-b medium (= ECM-b aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine en 1% endothele celgroei supplement). Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2. Controleer celgroei dagelijks met behulp van een microscoop. </li><li> Verander het medium om de 3 dagen.Oogst cellen of splitsen wanneer HBMEC verwachting ongeveer 80% confluentie. HBMEC worden gebruikt tussen passage 1 en 15 tot verlies van fysiologische eigenschap belet. </li></ol></li><li> Harvest HBMEC. <ol><li> Bereid Accutase oplossing door mengen Accutase (1x) met PBS in een verhouding van 1: 1. Houd Accutase oplossing bij 37 ° C in een waterbad tot verder gebruik. </li><li> Transfer ECM-b medium van de celkweek kolf met 15 ml centrifugebuis. HBMEC wassen door toevoeging van 5 ml PBS aan de bodem van de celkweek kolf. Zuig PBS en herhaal de wasstap nog twee keer. </li><li> Voeg 2 ml voorverwarmde oplossing Accutase. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min. Daarna HBMEC worden opnieuw geschorst door stevig de celkweek kolf meerdere malen te tikken. Cell detachement wordt bestuurd met behulp van een microscoop </li><li> De ECM-b-medium eerder opgeslagen in een 15 ml buis naar het celkweekkolf zodra HBMEC beginnen los toegevoegd. Spoel de bodem van de kolf totdat de meeste HBMEC zijngeresuspendeerd. </li><li> Breng de celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeren bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml ECM-b medium. Aantal cellen en verdun de celsuspensie tot een eindconcentratie van 3 x 10 ml per 5 HBMEC ECM-b medium bereiken. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van de Cell Culture Inserts <ol><li> Coating van celkweek inserts Belangrijke opmerking: Raak de membraan van de celkweek inserts. <ol><li> Voeg 100 ul fibronectine-oplossing (zie 1.1.1) aan elke celkweek insert (Figuur 1A) en één putje van een 96 putjes vlakke bodemplaat (optische controle putje). Incubeer gedurende ten minste 3 uur bij 37 ° C. Na incubatie aspiraat fibronectine oplossing. </li><li> Voeg 100 ul HBMEC suspensie aan de celkweek inserts en de optische controleputje. Voeg 600 ul ECM-b medium naar het onderste compartiment van de celcultuur inserts. Incubeer gedurende 3-4 dagen bij 37 ° C / 5% CO2 totdat integriteit van de barrière (figuur 1B) wordt bereikt, controleer celgroei door microscopische evaluatie van de HBMEC in de optische controlewell. Let op: de groei van de cel langer dan vier dagen wordt niet aanbevolen. </li><li> Optioneel: bootsen ontstekingen Zuig het medium van het onderste compartiment en vervang deze ECM-b medium aangevuld met 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 uur voor de migratieassay. </li></ol></li></ol> 3. Quality Control met Evans Blue op de Dag van de transmigratie Assay <ol><li> Bereiding van Evans Blue oplossing <ol><li> PBS / B27-oplossing mengsel 10 mL PBS bereid met 200 ul B27 supplement met een 15 ml centrifugebuis. Evans Blue verdunde voorraadoplossing (20 mg / ml PBS) 1: 1000 met PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans blue permeabiliteitstest <ol><li> Zuig het medium uit het onderste compartiment gevolgd door het bovenste compartimentéén celkweek insert met een confluente monolaag HBMEC. Voeg 100 ul Evans Blue oplossing voor de celkweek insert. </li><li> Voeg 600 ul PBS / B27 naar het onderste compartiment en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C / 5% CO2. Verwijder voorzichtig de celkweek insert behulp van een tang. </li></ol></li><li> Evans blauw meting <ol><li> Verwijder PBS / B27 uit het onderste compartiment en breng 100 ui elk van twee putjes van een zwarte polystyreen met 96 putjes met vlakke bodemplaat. Inzetplaat in een Tecan Infinite M200 Pro plaatlezer en bepaalt een optimale Z-positie. </li><li> Maat excitatie Evans Blue gebruik respectieve instellingen (bijvoorbeeld: excitatie: 620 nm, emissie: 680 nm, excitatiebandbreedte: 9 nm, emissie bandbreedte van 20 nm, 175x vergroting, 25 flitsen, integratietijd: 20 ps). </li><li> Bepalen HBMEC barrièrefunctie vergelijk verzamelde gegevens met een standaardcurve afbeelding van Evans Blue permeatie door HBMEC op verschillende tijdstippen na zaading cellen (Figuur 1B, rechts). </li></ol></li></ol> 4. Migratie Assay <ol><li> Bereiding van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). <ol><li> Voeg 10 ml RPMI in een 15 ml centrifugebuis en voeg 200 ul B27 supplement. PBMC tellen en centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten. Resuspendeer PBMC tot een eindconcentratie van 5 x 10 6 cellen / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Set-up van de migratieassay <ol><li> Aspireren medium uit het onderste compartiment gevolgd door het bovenste compartiment van celkweek inserts samenvloeiende monolagen HBMEC (Figuur 1A). Per donor voeg 100 ul PBMC suspensie elk voor celkweek inserts alsook op één putje van een plaat met 24 putjes per (in vitro controle). </li><li> Voeg 600 pl RPMI / B27 naar het onderste compartiment van de celkweek inserts en 500 pi aan de PBMC van de in vitro controle en incubeer 6 uur bij 37 ° C / 5% CO2. </li&gt; </ol></li><li> Oogsten van gemigreerde PBMC <ol><li> Haal de celkweek insert met behulp van een tang en voorzichtig de bodem met 400 pi PBS te spoelen zonder het aanraken van het membraan. Gooi de celkweek insert. </li><li> Voeg 20 ul stroom count FluoroSpheres (ongeveer 1000 kralen / ul) aan het onderste compartiment van de celkweek te voegen en om de in vitro controle en meng goed. Breng 1 ml PBMC verkregen suspensie stroomcytometrie buizen. </li></ol></li></ol> 5. Flowcytometrie <ol><li> monstervoorbereiding <ol><li> Centrifugeer PBMC bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid antilichaamoplossing door toevoeging fluorochroom geconjugeerde antilichamen aan 100 pl flowcytometrie buffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per monster. Voor de onder 1 pi CD4-FITC gepresenteerde resultaten, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ul CD56-PC7, 1 pl CD8-A700 en 1 ul CD16-A750 werden gebruikt per monster. </li><li> Re-schorten PBMC in 100 pi van de antilichaamoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 250 ul flowcytometrie buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li></ol></li><li> sample overname <ol><li> Resuspendeer PBMC in de vereiste hoeveelheid (afhankelijk van de gebruikte flowcytometer) van flowcytometrie buffer. </li><li> Verwerven gekleurd PBMC met een flow cytometer met een actieve detector van 525 tot 700 nm golflengte stroming count FluoroSpheres detecteren (excitatie 488 nm, emissie 525-700 nm). (De volgende stappen zijn een voorbeeld wanneer een Gallios flowcytometer bediend Kaluza G software wordt gebruikt. (1) Start de computer (2) Wanneer het besturingssysteem volledig is geladen, start de flowcytometer door op de &quot;cytometer op&quot; knop . (3) Laad de respectievelijke overname protocol door op &quot;open protocol&quot; te drukken. (4) Kies de gewenste protocol en selecteer &quot;open&quot;. (5) Dubbele het protocol voor elk monster door het klikken met de rechtermuisknop op de protocol zichtbaar in de virtuele carrousel en een links-klik op het veld &quot;duplicate&quot;. (6) Label elke monster in het monster lijst. (7) Breng de monsters op de aangegeven plaatsen van de carrousel en start de acquisitie.) </li></ol></li><li> monsteranalyse <ol><li> Open resulterende flowcytometrie gegevens met behulp van de betreffende software. Bepaal aantal subpopulaties van belang voor transmigrated PBMC en cellen uit in vitro controleputjes en stromen telling FluoroSpheres met de respectievelijke analysesoftware. (Een voorbeeld van de gating strategie wordt gegeven in de resultaten gedeelte (Figuur 1 C: Aan de transmigratie van NK-cel subsets analyseren eerst selecteren lymfocyten in een zijwaartse verstrooiing kanaal (SSC) versus voorwaartse verstrooiing kanaal (FSC) diagram Lymfocyten zijn. vervolgens verschijnt een CD3 versus CD56 plot en CD56 + CD3 -. NK cellen gekozen Ter onderscheiding van NK-cel subsets worden NK cellen weergegeveneen CD56 versus CD16 plot en CD56 heldere CD16 dim / - evenals CD56 dim CD16 + NK-cellen zijn geselecteerd. Daarnaast zijn stroom telling FluoroSpheres gekozen uit een FSC-SSC versus grafiek en vervolgens weergegeven in een grafiek van een kanaal met een emissie van 525 tot 700 nm versus tijd hun aantal te bepalen.) </li><li> Het totale aantal cellen van elk monster te berekenen, normaliseren het gedetecteerde aantal cellen met behulp stroming count FluoroSpheres: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Bepalen percentage gemigreerde cellen als verhouding tussen het totale gemigreerde cellen en totale cellen in het in vitro controle. </li></ol></li></ol>

De auteur(s) verklaarden de volgende potentiële belangensconflicten met betrekking tot het onderzoek, de auteurschap en/of de publicatie van dit artikel: A.S.-M. en U.B. hebben geen financiële onthullingen. T. S.-H. ontving reis- en congreskosten van Biogen. N.S. ontving sprekers- en adviesraadhonoraria van Biogen en Novartis Pharma, evenals reiskosten van Biogen. H.W. ontving compensatie voor het deelnemen aan wetenschappelijke adviesraden/stuurgroepen voor Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis en Sanofi-Genzyme. Hij ontving ook sprekershonoraria en reisondersteuning van Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis en Sanofi-Genzyme. Hij ontving compensatie als consultant van Biogen, Merck Serono, Novartis en Sanofi-Genzyme. H.W. ontving onderzoeksondersteuning van Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany en Sanofi US. C.C.G. ontving sprekershonoraria en reiskosten voor het bijwonen van bijeenkomsten van Genzyme, Novartis Pharma GmbH en Bayer Health Care.

Hier presenteren we een techniek om de transmigratie van lymfocyten over het menselijk bloed-hersenbarrière te onderzoeken. In vitro analyse van lymfocyt migratie naar het CZS is belangrijk basisprocessen van lymfocyten extravasatie mogelijke ziektegerelateerde veranderingen en nieuwe therapeutische benaderingen bestuderen. Verschillende modificaties van de bloed-hersenbarrière model mogelijk. Bijvoorbeeld kunnen cellen van het bovenste compartiment worden geanalyseerd om de samenst...

Lymfocytenmigratie uit het bloed naar de weefsels is cruciaal voor immuun surveillance. Een reeks van specifieke moleculaire interacties zorgt plaatsspecifieke extravasatie in kleine darm, huid, lymfeknopen, het centrale zenuwstelsel (CZS) en andere weefsels 1. Veranderingen in lymfocytenmigratie betrokken zijn bij de pathofysiologie van een aantal wijdverbreide ziekten 2. Migratie in de immuun-geprivilegieerde CNS wordt strak gereguleerd en dus veranderingen van deze werkwijze zijn betrokken bij CZS-gerelateerde ziekten zoals encefalomyelitis 3, neuromyelitis optica, beroerte en multiple sclerosis (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Daarom is het belangrijk om lymfocyten extravasatie bestuderen om beter te begrijpen ziekte pathofysiologie en hulpmiddelen voor een te ontwikkelen<html> melioration ziektelast 8, 9, 10, 11, 12. Lymfocyten migreren in het CNS via verschillende routes. Extravasatie tot postcapillaire venules in de subarachnoïdale ruimte via de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière in de choroid plexus en over de bloed-hersenbarrière zijn beschreven 1, 13, 14, 15. Migratie over de bloed-hersenbarrière wordt uitgevoerd door de interactie van lymfocyten aan endotheelcellen 14. In tegenstelling tot endotheliale cellen in de periferie, endotheliale cellen van het CNS tot expressie grote hoeveelheden tight junction moleculen, waardoor strikte beperking van het aantal cellen en eiwitten die in staat de bloed-hersenbarrièrelass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Ontsteking leidt tot loskomen van nauwe overgangen en induceert de expressie van adhesiemoleculen; dus verbeteren lymfocytenmigratie in het CZS 1, 17, 18. Extravasatie via de bloed-hersenbarrière is een meerstaps werkwijze. Lymfocyten tether de endotheelcellen en rol langs het endotheel in een proces in hoofdzaak gemedieerd door selectinen 1, 15. Vervolgens interacties tussen chemokinen uitgescheiden door het endothelium en de respectieve chemokinereceptoren tot expressie gebracht op lymfocyten conformatieveranderingen van integrinen, waardoor stevige adhesie aan endotheelcellen bevorderen 1. Tenslotte lymfocyten ofwel kruipen langs de endotheliale barrière tegen de bloedstroom voordat transmigrerende in de perivasculaire ruimte of onmiddellijk en rechtstreeks verzendende kraamigrate op de plaats van stevige adhesie 1, 19, 20. Al deze stappen lymfocyt extravasatie kan worden geanalyseerd in vitro gebruik van verschillende technieken 21. Time-lapse video microscopie wordt gebruikt om de initiële tethering en rollen 15 te bestuderen. Hechting testen leveren gedetailleerde informatie over firma arrestatie belemmeringen 22 endotheel. Transmigratie assays zoals hier getoond laten analyse van immuuncel transmigratie 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Met het menselijke in vitro bloed-hersenbarrière model konden we onlangs laten zien dat een hogere migrAtory aantal CD56 heldere CD16 dim / - NK-cellen in vergelijking met hun CD56 dim CD16 + tegenhangers werd gereflecteerd door een overwicht van deze NK-cel subsets in de intrathecale ruimte 21. Zo, onze experimentele opstelling lijkt geschikt zijn om de in vivo situatie na te bootsen zijn.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>zonder CaCl2 of MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>uit runderplasma</td></tr><tr><td>T-25 cellcultuurkolf</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endotheliaal cel groei supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>doorzichtig, 6,5 mm diameter, 3,0 &micro;m poriegrootte</td></tr><tr><td>96-wells platte bodem plaat</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>voorraadoplossing: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x geconcentreerd</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-wells zwarte platte bodem plaat</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-wells plaat</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-kleur flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>klon UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>klon N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>klon 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>klon RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>klon B9.11</td></tr></tbody></table>

analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; in vitro</em&gt; model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Extravasatie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) is essentieel voor immuun surveillance. Ziekte-gerelateerde veranderingen van lymfocyten extravasatie kan resulteren in pathofysiologische veranderingen in het centrale zenuwstelsel. Aldus onderzoek lymfocytenmigratie in het CZS is belangrijk inflammatoire CNS-ziekten te begrijpen en nieuwe therapie benaderingen te ontwikkelen. Hier presenteren we een in vitro model van het menselijk bloed-hersenbarrière lymfocyten extravasatie bestuderen. Menselijk brein microvasculaire endotheelcellen (HBMEC) worden confluent gekweekt op een poreuze polyethyleentereftalaat Transwell voegen aan het endotheel van de bloed-hersenbarrière nabootsen. Barrièrefunctie wordt gevalideerd door zonula occludens immunohistochemie transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en analyse van Evans blauw permeatie. Dit model maakt het mogelijk onderzoek naar de diapedesis van zeldzame lymfocyten zoals CD56 heldere CD16 dim / - NK-cellen. Furthermerts, de werking van andere cellen, cytokines en chemokines, ziektegerelateerde veranderingen en verschillende behandelingsregimes op het trekkende capaciteit van lymfocyten kunnen worden bestudeerd. Tenslotte kan het effect van inflammatoire stimuli evenals verschillende behandelingsregimes op de endotheliale barrière te analyseren.

Representatieve resultaten tonen transmigratie van NK-cellen en T-cel subsets met het menselijk bloed-hersenbarrière model (Figuur 1A) getoond. De integriteit van de monolaag HBMEC werd bevestigd door kleuring van de nauwe overgang molecuul ZO-1, transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en Evans Blue permeatie (Figuur 1B). Na 3-4 dagen kweek HBMEC sprak de nauwe overgang molecuul ZO-1 (Figuur 1B, links). Bovendien HBMEC gegro...

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Het algemene doel van deze transmigratie-assay is om de extravasatie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken. Deze methode kan bijdragen aan het verdiepen van ons begrip van inflammatoire aandoeningen van het centrale zenuwstelsel en aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen. Enkele voordelen van deze techniek zijn de goede toegankelijkheid en de mogelijkheid om zeldzame lymfocytpopulaties op enkelcelniveau te analyseren.Deze methode kan inzicht bieden in de transmigratie van lymfocyten door de bloed-hersenbarrière en kan worden toegepast bij de studie naar transmigratie via de bloed-hersenvochtbarrière. Daarnaast kan een Evans blue-permeatieanalyse worden uitgevoerd om de integriteit van het bloed-hersenbarrièremodel te beoordelen. Begin met het bedekken van de bodem van een T-25 kweekfles met twee milliliters vers bereide fibronectine-oplossing voor een incubatie van ten minste drie uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.Vervang aan het einde van de incubatie de fibronectine-oplossing door 7,2 × 10⁴ menselijke cerebrale microvasculaire endotheelcellen (HBMEC) in zes milliliter compleet ECM-b medium en plaats de kolf terug in de incubator. Wanneer de HBMEC een confluentie van 80% bereiken, wordt het supernatant overgebracht naar een conische buis van 15 milliliter en worden de adherente cellen drie keer gewassen met vijf milliliter PBS. Voeg na de derde wasbeurt twee milliliter voorverwarmde Accutase-oplossing toe aan de cellen gedurende twee minuten bij 37 °C.Tik vervolgens stevig meerdere keren tegen de kolf en bevestig de loslating van de cellen via lichtmicroscopie. Wanneer de cellen beginnen los te komen van de bodem van de kolf, gebruik dan het geoogste supernatant om de kolf herhaaldelijk te spoelen totdat de meeste HBMEC zijn geresuspendeerd. Draag de celsuspensie vervolgens over naar een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie en resuspendeer de pellet in één milliliter vers ECM-b medium voor het tellen.Om de celkweekinserts voor een transmigratie-assay voor te bereiden, voegt u eerst 100 µL fibronectine-oplossing toe aan elke insert en aan één putje van een 96-wells vlakke bodemplaat. Na drie uur bij 37 °C vervangt u de fibronectine-oplossing door 100 µL HBMEC en voegt u 600 µL vers ECM-b medium toe aan de onderste compartimenten van de celkweekinserts. Plaats de platen vervolgens gedurende drie tot vier dagen terug in de celkweekincubator.Om te testen of de barrière-integriteit is bereikt, zuigt u het medium uit de onderste en bovenste compartimenten van één cellijn-insert en voegt u 100 µL vers bereide Evans blue-oplossing toe aan de insert. Voeg 600 µL PBS aangevuld met B27 toe aan het onderste compartiment en plaats de plaat terug in de incubator. Na één uur verwijdert u de insert voorzichtig met een pincet en brengt u 100 µL PBS B27 uit het onderste compartiment over naar twee afzonderlijke wells van een zwarte polystyreen 96-well plaat met een platte bodem.Plaats vervolgens de plaat in een multi-mode microplaatlezer en bepaal de optimale z-positie. Om de barrièrefunctie van de HBMEC te bepalen, wordt de excitatie van de Evans blue-kleuringsoplossing gemeten met de juiste instellingen, waarna de verkregen gegevens worden vergeleken met een standaardcurve die de permeatie van Evans blue door de HBMEC weergeeft op verschillende tijdspunten na het uitzaaien. Na bevestiging van de vorming van de cellaag wordt het monster van perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC, geresuspendeerd tot een concentratie van 5 × 10⁶ cellen per milliliter in RPMI-medium aangevuld met B27.Aspire vervolgens het medium uit de onderste en bovenste compartimenten van het juiste aantal celkweekinserts die de confluente HBMEC-monolagen bevatten, en voeg 100 µL PBMC per donor toe aan de celkweekinserts en aan één putje van een 24-wells plaat per in vitro controle. Voeg 600 µL RPMI plus B27 toe aan de onderste compartimenten van de celkweekinserts en 500 µL aan de in vitro controleputjes, en plaats de platen voor zes uur terug in de celkweekincubator. Gebruik aan het einde van de incubatie een pincet om de celkweekinserts te verwijderen en spoel de bodems voorzichtig af met 400 µL PBS zonder de membranen aan te raken.Meng vervolgens 20 µL Flow-Count Fluorospheres grondig met de cellen in de experimentele putjes en de in vitro controleputjes, en breng één ml van de resulterende PBMC-suspensies over naar de bijbehorende flowcytometriebuisjes. Pel de cellen door middel van centrifugatie en voeg de gewenste fluorochroom-geconjugeerde antilichamen in 100 µL flowcytometriebuffer toe aan elk monster. Was de cellen na 30 minuten bij 4 °C met 250 µL verse flowcytometriebuffer en resuspendeer de pellets in het juiste volume flowcytometriebuffer voor analyse.Wanneer alle gegevens zijn verzameld, opent u de geschikte software voor flowcytometrie-analyse. Om de transmigratie van de NK-celsubset te analyseren, selecteert u eerst de lymfocyten in een plot van side scatter versus forward scatter en toont u de cellen in een CD3 versus CD56 dot plot. Selecteer vervolgens de CD56-positieve, CD3-negatieve NK-cellen.Om onderscheid te maken tussen de transmigreerde NK-cel-subsets, worden de cellen weergegeven in een CD56 versus CD16 plot en wordt er gegated voor de CD56bright, CD16dim of negatieve, en de CD56dim, CD16-positieve cellen. Selecteer vervolgens de Flow-Count Fluorospheres uit een forward versus side scatter plot. Om het aantal beads te bepalen, worden de geselecteerde gegevens weergegeven in een plot van een kanaal met een emissiegolflengte tussen 525 en 700 nanometer versus tijd.Bepaal slutतः het percentage gemigreerde NK-cellen als de ratio tussen het totale aantal gemigreerde cellen en het totale aantal cellen in de in vitro controle. Na drie tot vier dagen cultuur vertoonden de HBMEC het tight junction-molecuul Zonula occludens-1 en groeiden ze in monolagen die transendotheliale elektrische weerstand en een verminderde permeatie van Evans blue-kleurstof vertoonden. Stimulatie van de endotheliale cellaag met interferon gamma en TNF alpha gedurende 24 uur voorafgaand aan een volledige PBMC-transmigratie-assay resulteert in een verhoogde migratie van alle geanalyseerde lymfocytpopulaties.Interessant is dat CD56bright, CD16dim of negatieve NK-cellen een hogere migratiecapaciteit vertonen dan CD16-positieve CD56dim NK-cellen, zowel in ongestimuleerde als cytokine-geactiveerde HBMEC. Hoewel de relatieve toename van transmigratie door een ontstoken cellaag in het algemeen hoger is voor de CD56dim-cellen, weerspiegelt dit de in vivo observaties dat CD56bright, CD16dim-negatieve NK-cellen verrijkt zijn in het intrathecale compartiment. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen 10 uur worden voltooid.Voorbehandeling van de in vitro transmigratie-opstelling met interferon gamma en TNF alpha maakt het mogelijk om lymfocytmigratie onder inflammatoire omstandigheden te bestuderen. Ons protocol kan worden aangepast door schuifkrachten toe te passen of door co-cultivatie met andere cellen van de bloed-hersenbarrière, zoals astrocyten, om een verfijnd model te bieden voor lymfocyttransmigratie naar het centrale zenuwstelsel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe lymfocyttransmigratie kan worden onderzocht met behulp van een in vitro model van de menselijke bloed-hersenbarrière.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an experimental investigation of lymphocyte transmigration across a blood-brain barrier (BBB) endothelium model. A monolayer of human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) is generated in vitro, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) containing lymphocytes are added to the monolayer. The cells are then incubated to allow lymphocyte transmigration, and the migrated cells are quantified using flow cytometry.

Studying Lymphocyte Transmigration Across a Microvascular Endothelial Cell Monolayer

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

We presenteren een fluorescentie test om aan te tonen dat Lucifer Yellow (LY) een robuuste marker is om de schijnbare paracellulaire permeabiliteit van hCMEC/D3 celmonolagen te bepalen, een in vitro model van de menselijke bloed-hersen barrière. We gebruikten deze assay om de kinetiek van een confluente monolaag-formatie in gekweekte hcmec/D3-cellen te bepalen.

Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

Er is een methode ontwikkeld om kleurstofextravasatie als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) te visualiseren door twee fluorescerende kleurstoffen op verschillende tijdstippen aan muizen toe te dienen. Het gebruik van glycerol als cryoprotectant vergemakkelijkte immunohistochemie op hetzelfde monster.

Evaluatie van de afbraak van de bloed-hersenbarrière in een muismodel van licht traumatisch hersenletsel

Leer lymfocyt extravasatie analyseren met een in vitro model van de menselijke bloed-hersenbarrière. Deze methode biedt inzicht in ontstekingsprocessen in het centrale zenuwstelsel en ondersteunt therapeutisch onderzoek.

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een

Meer video's verkennen