Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een In Vitro Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Het algemene doel van deze transmigratietest is om de extravasatie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het verbeteren van ons begrip van inflammatoire ziekten van het centrale zenuwstelsel en bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen. Enkele voordelen van deze techniek zijn dat deze gemakkelijk toegankelijk is en dat het de analyse van zeldzame lymfocytenpopulaties op enkelcelniveau mogelijk maakt.

Deze methode kan inzicht geven in de transmigratie van lymfocyten door de bloed-hersenbarrière en kan worden toegepast op de studie van transmigratie via de bloed-hersenvloeistofbarrière. Bovendien kan Evans blauw permeabiliteitsanalyse worden uitgevoerd om de integriteit van het bloed-hersenbarrièremodel te beoordelen. Begin door de bodem van een T-25 celkweekfles te bedekken met twee milliliter vers bereide fibronectineoplossing voor een incubatie van minimaal drie uur in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Aan het einde van de incubatie, vervang de fibronectineoplossing met 7,2 keer 10 tot de vierde menselijke hersenmicrovasculaire endotheelcellen, of HBMEC, in zes milliliter volledig ECM-b medium, en plaats de fles terug in de incubator. Wanneer de HBMEC een 80% confluency bereiken, draag de supernatant over naar een 15-milliliter kegelbuis en was de adherante cellen drie keer met vijf milliliter PBS. Na de derde wassing, voegt u twee milliliter voorverwarmde Accutase-oplossing toe aan de cellen gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius.

Tik vervolgens stevig meerdere keren op de fles, bevestig de celafscheiding door lichtmicroscopie. Wanneer de cellen beginnen op te komen van de bodem van de fles, gebruikt u het geoogste supernatant om de fles herhaaldelijk te spoelen totdat de meeste HBMEC opnieuw worden gesuspendeerd. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 15-milliliter kegelbuis voor centrifugatie en suspendeer de pellet in één milliliter vers ECM-b medium voor telling.

Om de celkweekinzetstukken voor een transmigratietest voor te bereiden, voegt u eerst 100 microliter fibronectineoplossing toe aan elk inzetstuk en aan één put van een 96-wels platte bodemplaat. Na drie uur bij 37 graden Celsius, vervang de fibronectineoplossing met 100 microliter HBMEC en voeg 600 microliter vers ECM-b medium toe aan de onderste compartimenten van de celkweekinzetstukken. Breng vervolgens de platen terug naar de celkweekincubator voor drie tot vier dagen.

Om te testen of de barrière-integriteit is bereikt, aspireer het medium van de onderste en bovenste compartimenten van één celkweekinzetstuk en voeg 100 microliter vers bereide Evans blauw oplossing toe aan het inzetstuk. Voeg 600 microliter PBS aanvulling met B27 toe aan het onderste compartiment en plaats de plaat terug in de incubator. Na een uur, gebruikt u een pincet om voorzichtig het inzetstuk te verwijderen en brengt u 100 microliter PBS B27 van het onderste compartiment over naar twee individuele putjes van een zwarte, polystyrol, 96-wels platte bodemplaat.

Laad vervolgens de plaat in een multi-mode microplaatlezer en bepaal de optimale z-positie. Om de HBMEC barrièrefunctie te bepalen, meet u de excitatie van de Evans blauw verfoplossing met de juiste instellingen en vergelijkt u de verkregen gegevens met een standaardcurve die Evans blauw permeabiliteit door de HBMEC weergeeft op verschillende tijdstippen na het zaaien. Na bevestiging van de vorming van de celmonolaag, suspendeert u de perifere bloedmononucleaire cel, of PBMC, steekproef tot een vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie in RPMI medium aangevuld met B27.

Vervolgens aspireer u het medium van de onderste en bovenste compartimenten van het juiste aantal celkweekinzetstukken die de confluente HBMEC monolaag bevatten en voegt u 100 microliter PBMC per donor toe aan de celkweekinzetstukken en aan één putje van een 24-wels plaat per in vitro controle. Voeg 600 microliter RPMI plus B27 toe aan de onderste compartimenten van de celkweekinzetstukken en 500 microliter aan de in vitro controlepotten en plaats de platen terug in de celkweekincubator gedurende zes uur. Aan het einde van de incubatie, gebruikt u een pincet om de celkweekinzetstukken te verwijderen, spoelt u de bodems voorzichtig af met 400 microliter PBS zonder de membranen aan te raken.

Meng vervolgens grondig 20 microliter Flow-Count Fluorospheres met de cellen in de experimentele en in vitro controlepotten en breng een milliliter van de resulterende PBMC suspensies over naar de juiste corresponderende flowcytometriebuizen. Verzamel de cellen door centrifugatie en voeg de geconjugeerde fluorochromenantilichamen van belang toe in 100 microliter flowcytometriebuffer aan elk monster. Na 30 minuten bij vier graden Celsius, was de cellen met 250 microliter vers flowcytometriebuffer en suspendeer de pellets in het juiste volume flowcytometriebuffer voor analyse.

Wanneer alle gegevens zijn verzameld, opent u de juiste flowcytometrieanalysesoftware. Om de NK-celsubpopulatietransmigratie te analyseren, selecteert u eerst de lymfocyten in een zijde versus voorwaartse verstrooiingskanaalplot en toont u de cellen in een CD3 versus CD56 stipplot. Selecteer vervolgens de CD56-positieve, CD3-negatieve NK-cellen.

Om de transmigreerde NK-celsubpopulaties te onderscheiden, toont u de cellen in een CD56 versus CD16 plot en gate voor de CD56bright, CD16dim of negatieve, en CD56dim, CD16-positieve cellen. Selecteer vervolgens de Flow-Count Fluorospheres uit een voorwaarts versus zijwaartse verstrooiingsplot. Om het aantal kralen te bepalen, toont u de geselecteerde gegevens in een plot van een kanaal dat een emissiegolflengte tussen 525 en 700 nanometer versus tijd bedekt.

Bepaal ten slotte het percentage gemigreerde NK-cellen als de verhouding tussen het totale aantal gemigreerde cellen en het totale aantal cellen in de in vitro controle. Na drie tot vier dagen kweek, hebben de HBMEC de strakke verbinding