Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten

Het algemene doel van deze procedure is om de schaalbaarheid en reproduceerbaarheid van uniforme sferoïdevorming te verbeteren door middel van een vloeibare overlay-techniek in 384-well platen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de overmatige mediumheroperatie van meerdere platen vermindert en daardoor de reproduceerbaarheid van sferoïdevorming verbetert. We hebben de methode ontwikkeld en gevalideerd voor het kweken van 3D-sferoïden voor arthropoden screeningtesten in ons laboratorium en ons onderzoek was om te evalueren wat het randeffect is in de platen van de meercellige culturen.

Vandaag zal ik de procedure demonstreren samen met Sona, een poster uit het laboratorium. Begin deze procedure door nul punt zeven vijf gram laag smeltpunt agarose af te wegen en toe te voegen aan 100 milliliter mccoy's 5a medium met of zonder fenolrood en zonder serum. Verwarm de oplossing in een magnetron en slinger hem elke één tot twee minuten om de agarose volledig op te lossen.

Steriliseer de oplossing vervolgens door middel van autoclavage. Laat de geautoclaveerde agarose afkoelen tot ongeveer 70 graden Celsius, filter hem vervolgens door een 500 milliliter nul punt twee micrometer flesfilter in een laminaire stroomkast. Als de hele oplossing niet in één keer wordt gebruikt, verdeel deze vervolgens in aliquoten.

Bewaar deze klaar voor gebruik agarose-oplossing aseptisch in een koude kamer of een koelkast van vier graden Celsius gedurende maximaal vier weken. Installeer in een laminaire stroomkast een plastic of metaalbetipte dispensercassette in een combireagensdispenser. Plaats het slanggewicht in een vat met 70 procent ethanol en prime vervolgens de cassette.

Verplaats vervolgens het slanggewicht naar een vat met PBS en prime het opnieuw. Verwarm vervolgens een opgeslagen aliquot van gefilterde agarose-oplossing in de magnetron om het te smelten. Prime de dispensercassette met agarose-oplossing en start vervolgens het protocol om 384 well weefselkweekbehandelde microplaten te coaten met 15 microliters gefilterde agarose-oplossing.

Laat de agarose in de plaat 15 tot 20 minuten afkoelen voordat u de cellen zaait zoals beschreven in de volgende sectie van de video, of sla ze op bij vier graden Celsius en uit de buurt van direct licht. Om de dispensercassette schoon te maken, plaats u het slanggewicht in 70 tot 80 graden Celsius steriel water en druk op de prime-knop op de dispenser. Dit zal eventueel overgebleven agarose in de cassettetips en de buizen verwijderen.

Het volgende celzaaiproces moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden en in een laminaire stroomkast. Begin door het vereiste aantal agarose-gecoate 384 well weefselkweekbehandelde microplaten uit de koude opslag te verwijderen en ze 15 minuten te laten acclimatiseren tot kamertemperatuur. Bereid in de tussentijd de combireagensdispenser voor celzaaien door een standaard buisdispensercassette te primen met 70 procent ethanol en steriel PBS.

Vervolgens, met behulp van de manuele instelknoppen op de dispenser, pas het zaaivolume aan op de vereiste microliter en de doseersnelheid op medium. Gebruik recombinant celdissociatie-enzym om adherente humane colorectale carcinoom HCT116-cellen van een weefselkweekflacon te verwijderen. Maak in een steriele beker een celsuspensievoorraad met cellen met een dichtheid van 2,5 maal 10 tot de vierde cellen per milliliter per putje in 50 microliters compleet groeimedium.

Als er meer dan één 384 well plaat wordt gezaaid, gebruik dan een magnetische roerder om te voorkomen dat ze op de bodem van de beker bezinken. Gebruik een dispenser om de 25 duizend cellen toe te voegen aan elke putje van een 384 well plaat. Laat de platen 30 minuten rusten bij kamertemperatuur.

Gebruik ondertussen een verdampingsreducerende omgevingsmicroplaatdeksel en gebruik een vijf milliliter pipet om vier milliliter vijf procent dimethylsulfoxide in de linkerzijdebak te doseren, langzaam op en neer vegend. Herhaal dit proces met de rechterzijdebak. Zorg ervoor dat de vloeistof die aan de zijbakken wordt toegevoegd niet samenvloeit in het midden van het deksel en laat een opening voor gasuitwisseling.

Als er te veel vloeistof wordt toegevoegd, zal deze naar de buitenkant van het deksel sijpelen en vervolgens de buitenste putje van de 384 weefselkweekplaat binnendringen. Nadat 30 minuten zijn verstreken, onderzoekt u de cellen onder een microscoop. Het rusten van de platen gedurende 30 minuten zorgt ervoor dat de cellen volledig op de bodem van de putjes bezinken en dicht bij elkaar, wat belangrijk is voor de vorming van enkele sferoïden per putje.

Centrifugeer de gezaaide platen gedurende 15 minuten bij vier keer G.Na het centrifugeren, vult u het vloeistofreservoir van de 384 weefselkweekplaat met steriel water en vervangt u de reguliere platendekken met de met vloeistof gevulde omgevingsdekken. Plaats de platen in een roterende incubator van 37 graden Celsius met 95 procent vochtigheid, vijf procent CO2 en 20 procent zuurstof en laat de cellen gedurende vier dagen aggregaten tot meercellige tumor sferen of MCTS's. Vermijd het openen van de incubatordeur gedurende te lange tijd in de daaropvolgende dagen, zodat het vochtniveau niet abrupt daalt.

Op dag vier na de vorming van NCTS, gebruikt u een geautomatiseerde microplaatwasmachine om 30 microliter voorverwarmd medium aan elke putje toe te voegen. Plaats de MCTS's terug in de incubator en laat de MCTS's groeien tot ze de gewenste grootte bereiken voor experimenten. Om de medium te vervangen, stelt u elke drie dagen de Z-hoogte van de wasmachinemanchet empirisch in en stelt u de doseersnelheid en de snelheid waarmee de wasmanchet de putjes in beweegt in op de laagste snelheid om turbulentie in de putjes te minimaliseren.

Zuig 30 microliter medium per putje af en vervang het met 30 microliter vers, voorverwarmd medium. Breng vervolgens de cellen terug naar de incubator. Beeld de MCTS's af in een hoog inhoud geautomatiseerd beeldvormingssysteem met behulp van een vier X luchtobjectief met een numerieke apertuur van 16.

Stel met behul