Name: Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer een vloeibare overlay-techniek voor uniforme meercellige tumor-sferoïden in 384-well platen. Deze methode vermindert mediumverlies en verbetert de reproduceerbaarheid van 3D-cultuur assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Tsjechische ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport (LO1304) en de technologische Agentschap van de Tsjechische Republiek (TE01020028). De auteurs willen graag bedanken Dr. Lakshman Varanasi voor het nemen van de foto&#39;s van milieu-deksels.

1. Bereiding van agarose gecoate platen <ol><li> Weeg 0,75 g laag-smeltpunt agarose toevoegen aan 100 ml McCoy&#39;s 5A medium (met of zonder fenolrood) zonder serum. Verwarm de oplossing in een magnetron en schud elke 1-2 min de agarose volledig op te lossen. Autoclaaf de oplossing te steriliseren. </li><li> Koel het agarose autoclaaf tot ongeveer 70 ° C en filtreer het door een 500 mL, 0,22 urn filter top door vacuumfiltratie in een laminaire stroming in. Aliquot de 0,75% gefilterde agarose-oplossing (FAS) in kleinere hoeveelheden, zo niet in een keer met behulp van de gehele oplossing. Bewaar deze kant-en-klare agarose oplossing aseptisch in een koude kamer of 4 ° C koelkast gedurende maximaal 4 weken. </li><li> Bevestig een buisje met een kunststof- of metalen top afgeven cassette een Combi reagens dispenser en vul de cassette met 70% ethanol (EtOH) en vervolgens met steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een stroom vak. </li><li> Voor gebruik warmte een opgeslagen hoeveelheid van FAS i<html> n de magnetron om het te smelten. Prime de verstrekking cassette met agarose-oplossing en jas 384-wells, weefselkweek (TC) -behandeld &quot;speciale&quot; microplaten met 15 pi van FAS. Laat de agarose in de plaat afkoelen 15-20 min voor het zaaien van de cellen. Bewaar de agarose-gecoate platen aseptisch, verpakt in een polyethyleen zak in een koude kamer of bij 4 ° C en uit de buurt van direct licht. OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk verwarmen van de 0,75% FAS een verandering in de concentratie van agarose in de voorraadoplossing voorkomen. -Agarose gecoate plaatjes kunnen worden bewaard gedurende maximaal 2 weken bij opslag onder de bovengenoemde omstandigheden. De FAS geen verhitting nodig heeft tijdens het bekleden van platen. </li><li> Maak de verstrekking cassette door priming met 70-80 ° C steriel water om alle resterende agarose in de cassette tips en buizen te verwijderen. </li></ol> 2. Cel Cultuur en MCTS Formation <ol><li> Cultuur HCT116 humane colorectaal carcinoom cellen, zoals eerder beschrevenlass = &quot;xref&quot;&gt; 8. </li><li> Verwijder het vereiste aantal-agarose gecoate, 384 putjes, TC-behandelde microplaten van koel- en evenwicht ze op kamertemperatuur (KT) gedurende 15 min. </li><li> Bereid de Combi reagens dispenser voor cel zaaien door priming een standaard buis doseren cassette met 70% EtOH en steriel PBS. Stel het zaaien volume op het vereiste pi en de afgifte snelheid tot medium met behulp van de handmatige instelling knoppen op de dispenser. OPMERKING: De gehele cel enten wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden en in een laminaire stroming in. </li><li> Distantiëren hechtende cellen uit de weefselkweek kolf met een recombinante cel-dissociatie enzym. Wordt celsuspensie voorraad in een steriele beker met zaad cellen bij een dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen / mL per putje in 50 ul volledig groeimedium. Tijdens zenden meerdere 384-WP, roer de cellen met behulp van een magnetische roerder om te voorkomen dat zich afzet op de bodem van het bekerglas. </li><li> laat deplaten rusten 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer 15 minuten bij 4 x g. </li><li> Ondertussen neemt de verdamping reducerende milieu af en giet het met 8 ml steriel H2O of 5% dimethylsulfoxide (DMSO) bij de korte zijden (links en rechts) met een 5 ml pipet (figuur 1A). Eerst afzien 4 ml vulvloeistof in de linker goot opvegen de pipetpunt langzaam op en neer. Herhaal deze stap met de rechter-side trog. OPMERKING: Zorg dat de vloeistof toegevoegd aan de zijkant troggen niet samen te voegen in het midden van het deksel, en laat een gat voor de gasuitwisseling (Figuur 1A). Toevoegen van een overmaat H 2 O leidt tot lekkage van H2O aan de buitenkant van het deksel en vervolgens in de buitenste putjes van de 384-well platen TC. </li><li> Vul het vloeistofreservoir van de 384-well TC plaat met steriel H2O en vervang regelmatig plaat deksels met vloeistof gevulde milieu deksels (Figuur 2A). </li><li> Plaats de platen in een 37 ° C roterende incubator met 95% vochtigheid, 5% CO2 en 20% O2, en laat de cellen te aggregeren tot MCTSes gedurende 4 dagen. Vermijd openen van de incubator deur te lang in de daaropvolgende dagen om te voorkomen dat de luchtvochtigheid abrupt daalt. </li></ol> 3. Medium Exchange Met behulp van een robotsysteem <ol><li> Op dag 4 na MCTS vorming, voeg 30 ul van voorverwarmde medium per putje onder toepassing van een geautomatiseerde microplaat ring dispenser. Laat de MCTSes om te groeien voor een extra 3 dagen. Vervang het medium regelmatig elke 3 dagen totdat de gewenste grootte bereiken voor experimenten. </li><li> Om een bepaald volume van het medium uit elk aspireren goed, empirisch passen de z -Hoogte van de wasmachine spruitstuk. Verzamelbak 30 ul van medium per putje en vervangen door 30 pi van verse, voorverwarmde medium. LET OP: Stel de afgifte snelheid en de snelheid waarmee de wasmachine spruitstuk reistin putten tegen het laagste tarief turbulentie in de putten te minimaliseren. </li></ol> 4. High-gehalte beeldvorming van MCTS en Semi-automatische beeldanalyse <ol><li> Beeld de MCTS in een high content geautomatiseerd beeldvormingssysteem met een 4X doelstelling lucht (NA 16). </li><li> Stel de belichtingstijd tot 11 ms en de binning tot 4 x 4. Pas het aantal en de spreiding van de z -stacks en de pixel binning zoals gewenst voor het experiment om een hele MCTS per goed vast te leggen. </li><li> Verwerk de beelden stapsgewijs, zoals beschreven in het &quot;readme,&quot; met een eigen routine geschreven programmeertaal. LET OP: De .m code en .txt readme-bestanden zijn beschikbaar als aanvullende code-bestanden (Figuur 1B). De routine meet de MCTS gebied, grote en kleine assen, perimeter, en stevigheid van de 2D-beelden. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" /> Figuur 1:Bereiding van milieu deksels en een stroomdiagram van de halfautomatische routine. (A) Afbeelding van een verdamping verminderen milieu deksel gevuld met de juiste (links) en een overmaat (rechts) hoeveelheid van het vullen van vloeistof (hier, 5% DMSO). De pijl geeft de kopse goot voor het toevoegen van vloeistof. De asterisk geeft het gat in het midden van het deksel na de toevoeging van de juiste hoeveelheid DMSO. (B) Een werkstroom die de stappen van de semi-automatische beeldanalyse routine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li>
<li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li>
<li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells%2C+Tumor+Cells+%26+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments%3A+Microenvironment%2C+Microvesicles+and+MiRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).</li>
<li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis%3A+High-Throughput+Screening+Assay+Development%2C+Validation%2C+and+Pilot+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li>
<li>Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates%3A+The+Effect+of+Medium+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li>
<li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging-based+platform+for+high-content%2C+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).</li>
<li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li>
<li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057114532352">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li>
<li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li>
<li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li>
<li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids%3A+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Coating 384-Well TC Platen met Filtered Agarose De gangbare praktijk in LOT is een 1-1,5% laag smeltpunt agarose gebruiken om de vacht van de platen, die de agarose en / of apotheekhoudend apparaat heeft verwarmd te worden gehouden aan de geleren van de agarose 6 te voorkomen. Het geleren van de agarose is potentieel problematische tijdens het bereiden van meerdere platen met vloeibare afgeven cassettes met slangetjes openingen variërend tussen 0,2 en 0,4 mm in diameter....

Kankercellen in tumoren fysiologisch gerangschikt in een complex, 3-dimensionale (3D) structuur omgeven door extracellulaire matrix en interagerende cellen. Daar bijna alle cellen in weefsels in een 3D-omgeving bevinden, is de behoefte aan meer fysiologisch relevante in vitro tumormodellen die tumor eigenschappen nabootsen geleid tot de ontwikkeling van verschillende 3D kweektechnieken 1, 2, 3. Deze modellen worden nu fundamenteel onderzoeksinstrumenten voor het bestuderen van de rol van de tumor micro op metastase en celrespons op therapeutica 3D 2. Bovendien, in vergelijking met 2-dimensionale (2D) celculturen 4, 3D apparaten kan een beter begrip van tumor-stroma interacties, welke cel signaalroutes beïnvloeden. Multicellulaire bolvormige tumoren (MCTSes) kankercellijnen worden vaak gebruikt in 3D cel cultuur modellen als gevolg van hun relatieve nabijheid van in vivo tumoren. Van de verschillende technieken gebruikt, is de vloeistof-overlaytechniek (LOT) MCT generatie on-agarose gecoate platen significant belang voor lead optimalisatie en targetvalidatie 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 bereikt. Dit blijkt uit de recente studies die met succes kunnen pilot-schermen van collecties van chemische moleculen draaien in MCTS culturen met behulp van LOT 6, 7 waren. Echter, well-to-well variabiliteit in MCTS morfologie en groei als gevolg van de verdamping veroorzaakte ongelijke verlies van het medium komen vaak hindernissen die de LOT met behulp van microtiterplaten (MPS) te begeleiden. Bijgevolg is de vorming van niet-uniforme MCTSes compromitteert de betekenis en relevantiegegevens van farmacologische assays 8, 12, 13. Naast de reproduceerbaarheid kwesties ander praktisch probleem dat LOT-based high-throughput assays beïnvloedt is de bekleding van de MPs met agarose bij automatische vloeibare toedieningseenheden. Hoewel de afgifte-eenheid verwarmd tot de gelering agarose voorkomen kan worden gehouden, het verstoppen van de afgifte cassette leidingen is een potentiële zorg voor robotsystemen 6. Om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, hebben we onlangs bedacht een paar wijzigingen in de LOT voor MCTS cultuur 8. Deze wijzigingen zijn voornamelijk gebaseerd op de mogelijkheden om ongelijke medium verlies van MPs gebruiken instrumenten die gewoonlijk worden aangetroffen in screeningslaboratoria high-throughput voorkomen. Een gedetailleerde procedure van de gewijzigde LOT voor het genereren van uniforme grootte en reproduceerbare MCTSes over 384-well platen (WP) wordt hier gepresenteerd. Het manuscript geeft een semi-automatische routine voor de evaluatie van MCTS grootte, met name in gedeeltelijk gedesintegreerde, geneesmiddelbehandelde MCTSes dat geen duidelijke begrenzing voor het meten van de doorsnede hebben.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Low-melting</td></tr><tr><td>McCOY's 5A Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>&ldquo;rapid&rdquo; Filtermax filter</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0.22 &mu;m, 500 mL</td></tr><tr><td>Multidrop&trade; Combi Reagent Dispenser&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small Tube Dispensing cassette&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>Metal tip&nbsp;</td></tr><tr><td>384-well TC plate&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6057308</td><td>Plate type- CellCarrier</td></tr><tr><td>Standard Tube Dispensing Cassette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime Environmental Lid</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Incubator (SteriStore )</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>Serienummer: D00384</td></tr><tr><td>Microplate Washer Dispenser&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Ongespecificeerd</td><td>Model: EL406&nbsp;</td></tr><tr><td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td>Ongespecificeerd</td><td>Model: CV7000</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>New England Biolabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; Express recombinant cell dissociation reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Fenol vrij</td></tr></tbody></table>

verdamping-reducerende cultuur voorwaarde verhoogt de reproduceerbaarheid van meercellige sferoïde formation in microtiterplaten

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumormodellen die nauw nabootsen in vivo omstandigheden worden steeds populairder in geneesmiddelen en ontwikkeling voor de screening van potentiële geneesmiddelen tegen kanker. Meercellige bolvormige tumoren (MCTSes) effectief te bootsen de fysiologische omstandigheden van solide tumoren, waardoor ze uitstekend in vitro modellen voor lead optimalisatie en target validatie. Van de verschillende technieken beschikbaar voor het MCTS cultuur, de vloeistof-overlay methode op agarose is een van de meest goedkope werkwijzen voor MCTS genereren. Echter, de betrouwbare overdracht van MCTS culturen die vloeibare-overlay voor high-throughput screening worden beïnvloed door een aantal beperkingen, waaronder de bekleding van microtiterplaten (MPs) met agarose en irreproducibility uniforme MCTS formatie in putten. MPs significant gevoelig voor effecten die resulteren uit overmatige verdamping van medium vanaf de buitenzijde van de plaatrand, die het gebruik van de gehele dienblad drugproeven. Dit manuscript bevat gedetailleerde technische verbeteringen aan de vloeistof-overlay techniek om de schaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van uniforme MCTS vorming verhogen. Daarnaast, details op een eenvoudige, semi-automatische en universeel toepasbare software tool voor de evaluatie van MCTS beschikt na de behandeling met geneesmiddelen wordt gepresenteerd.

De ongelijke verlies van medium, in het bijzonder van de perifere putjes, is een veel voorkomende probleem in Kamerleden met kleine cultuur volumes. Substantieel verbeterde kweekomstandigheden, zoals incubatoren met goed gecontroleerde temperatuur / bevochtigingsystemen en verdamping verminderen MPs en plaat deksels, verminderen significant verlies drager in putjes 8. De relatieve verdamping te meten, gelijke volumes Orange G (OG) werden aan elk putje toegevoegd e...

De ongelijke verlies drager van microtiterplaten beïnvloedt de reproduceerbaarheid van uniforme multicellulaire bolvormige tumoren ontstaan. Verbetering kweekomstandigheden aanzienlijk medium verlies zal de reproduceerbaarheid van sferoïde vorming en de resultaten van sferoïde-gebaseerde testen met de vloeistof-overlay techniek te verbeteren verminderen.

Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Het algemene doel van deze procedure is om de schaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de vorming van uniforme sferoïden te verbeteren met behulp van een liquid overlay-techniek in 384-wells platen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het overmatig herhaaldelijk medium-gebruik uit meerdere platen vermindert, waardoor de reproduceerbaarheid van de sferoïdevorming wordt verbeterd. Wij hebben in ons laboratorium de methode voor het kweken van 3D-sferoïden voor arthropode screeningtests ontwikkeld en gevalideerd, en ons onderzoek was gericht op het evalueren van het randeffect in de platen van de multicellular culturen.Vandaag zal ik de procedure demonstreren samen met Sona, een poster uit het laboratorium. Begin deze procedure door 0,75 g laagsmeltende agarose af te wegen en voeg dit toe aan 100 mL McCoy's 5A medium met of zonder fenolrood en zonder serum. Verhit de oplossing in een magnetron en draai de vloeistof elke één tot twee minuten om de agarose volledig op te lossen.Autoclaveer vervolgens de oplossing om deze te steriliseren. Laat de geautoclaveerde agarose afkoelen tot ongeveer 70 °C en filter deze vervolgens door een 500 ml 0,22 µm bottle top filter in een laminaire flow-kast. Verdeel de oplossing vervolgens in aliquoten als de gehele hoeveelheid niet in één keer wordt gebruikt.Bewaar deze gebruiksklare agarose-oplossing aseptisch in een koelruimte of een koelkast van vier graden Celsius gedurende maximaal vier weken. Installeer, terwijl u in een flowbox werkt, een doseercassette met plastic of metalen tip in een combi-reagentendispenser. Plaats het slanggewicht in een vat met 70 procent ethanol en ontlucht vervolgens de cassette.Plaats vervolgens het buisgewicht in een vat met PBS en ontlucht het opnieuw. Verwarm daarna een bewaarde aliquot van de gefilterde agarose-oplossing in de magnetron om deze te smelten. Ontlucht de doseercassette met de agarose-oplossing en start vervolgens het protocol om 384-wells weefselkweekbehandelde microplaten te coaten met 15 µL gefilterde agarose-oplossing.Laat de agarose in de plaat 15 tot 20 minuten afkoelen voordat de cellen worden uitgezaaid zoals beschreven in het volgende gedeelte van de video, of voordat deze worden bewaard bij vier graden Celsius en uit direct licht. Om ten slotte de doseercassette te reinigen, plaatst u het slanggewicht in steriel water van 70 tot 80 graden Celsius en drukt u op de prime-knop van de dispenser. Hiermee wordt alle resterende agarose uit de cassettetippen en de slangen verwijderd.Het volgende proces voor het uitzaaien van cellen moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden en in een laminaire flowkast. Begin met het verwijderen van het benodigde aantal agarose-gecoate 384-wells weefselkweek-behandelde microplaten uit de koude opslag en laat deze 15 minuten lang acclimatiseren naar kamertemperatuur. Bereid ondertussen de combi-reagensdispenser voor het uitzaaien van cellen door een standaard buisdispenser-cassette te primen met 70 procent ethanol en steriele PBS.Stel vervolgens met de handmatige instellingsknoppen op de dispenser het doseervolume in op de vereiste microliter en de doseersnelheid op medium. Gebruik recombinant celdissociatie-enzym om adherente humane colorectale carcinoom HCT116-cellen uit een weefselkweekfles te verwijderen. Maak in een steriel bekerglas een cellsuspensie-stock met cellen bij een dichtheid van 2,5 × 10⁴ cellen per milliliter per putje in 50 µL compleet groeimedium.Als er meer dan één 384-wells plaat wordt gezaaid, gebruik dan een magnetische roerder om te voorkomen dat de cellen naar de bodem van het bekerglas zakken. Voeg met een dispenser 2500 cellen toe aan elke well van een 384-wells plaat. Laat de platen 30 minuten rusten bij kamertemperatuur.Neem ondertussen een microplaatdeksel dat verdamping vermindert en breng met een pipet van 5 mL 4 mL 5% dimethylsulfoxide aan in het linkerzijreservoir, waarbij u langzaam op en neer beweegt. Herhaal dit proces voor het rechterzijreservoir. Zorg ervoor dat de vloeistof in de zijreservoirs in het midden van het deksel niet samenvoegt, zodat er een opening blijft voor gasuitwisseling.Als er te veel vloeistof wordt toegevoegd, zal deze in de buitenkant van het deksel sijpelen en vervolgens in de buitenste put van de 384-weefselkweekplaat terechtkomen. Onderzoek de cellen na 30 minuten onder een microscoop. Door de platen 30 minuten te laten rusten, kunnen de cellen volledig naar de bodem van de put zakken en dicht bij elkaar komen, wat essentieel is voor de vorming van enkele sferoïden per put.Centrifugeer de gezaaide platen gedurende 15 minuten bij vier keer G. Vul na het centrifugeren het vloeistofreservoir van de 384-wells weefselkweekplaat met steriel water en vervang de normale plaatdeksels door vloeistofgevulde omgevingsdeksels. Plaats de platen in een roterende incubator bij 37 °C met 95 % luchtvochtigheid, 5 % CO2 en 20 % zuurstof, en laat de cellen gedurende vier dagen aggregeren tot multicellular tumor spheroids of MCTS's. Vermijd het te lang openhouden van de incubatordeur in de daaropvolgende dagen, zodat het vochtigheidsniveau niet abrupt daalt.Voeg op dag vier na de vorming van de NCTS met een automatische microplate-wasser/dispenser 30 microliters voorverwarmd medium toe aan elke well. Plaats de MCTS terug in de incubator en laat de MCTS groeien totdat ze de gewenste grootte voor de experimenten hebben bereikt. Pas elke drie dagen, bij het vervangen van het medium, de Z-hoogte van het wasmanifold empirisch aan en stel de doseersnelheid en de snelheid waarmee het wasmanifold in de wells zakt in op de laagste stand om turbulentie in de wells te minimaliseren.Aspireer 30 µL medium per well en vervang dit door 30 µL vers, voorverwarmd medium. Plaats de cellen vervolgens terug in de incubator. Beeld de MCTS'en af in een high-content geautomatiseerd beeldvormingssysteem met een 4X luchtobjectief met een numerieke apertuur van 16.Stel met de imaging-software de belichtingstijd in op 11 milliseconden en de binning op vier bij vier. Pas het aantal en de tussenruimte van de z-stacks en de pixelbinning naar wens aan voor het experiment om een volledige MCTS in elke put vast te leggen. Verwerk de 2D-afbeeldingen stapsgewijs om het oppervlak, de hoofdas en nevenas, de omtrek en de soliditeit van de MCTS te meten.Raadpleeg de bijbehorende m-code en tekst-readmebestanden voor specifieke instructies. Om de potentiële toepasbaarheid van de routine te bepalen, werden zeven dagen oude MCTS'en gedurende vier dagen behandeld met verschillende concentraties van de antikankermiddelen Paclitaxel (PTX), Vincristine (VCR), Oxalyplatin (OXA), Doxyrubicin (DOX) en vijf-fluorouracil (5-FU), elk in drie verschillende concentraties. Afbeeldingen van de MCTS'en worden hier getoond.Deze beelden werden geanalyseerd om het oppervlak, de hoofd- en nevenassen, de omtrek en de soliditeit van met geneesmiddelen behandelde MCTS'en te bepalen in vergelijking met de controles, CTL'en. De hoofd- en nevenassen werden gebruikt om het geometrische volume te berekenen. Er was een concentratieafhankelijke afname van het oppervlak en volume van de MCTS'en na behandeling met het geneesmiddel.Hoewel 0,01 µg/mL Vincristine, 0,4 µg/mL Doxorubicine en 5-Fluorouracil resulteerden in een toename van het MCTS-oppervlak, nam het volume significant toe alleen na toediening van 0,001 µg/mL Vincristine. De MCTS-omtrek was significant verschillend alleen bij de hoogste concentraties Paclitaxel, Doxorubicine en 5-Fluorouracil, welke de MCTS-grootte volledig beïnvloedden. Behandeling met Paclitaxel en Vincristine bij 0,25 µg/mL en 0,06 µg/mL, en Doxorubicine en 5-Fluorouracil bij 100 µg/mL, resulteerde in een significante afname van de soliditeit, wat duidt op een volledige tot gedeeltelijke desintegratie van de MCTS'en.Samen tonen deze gegevens het nut van deze methode aan bij het onderzoeken van potentiële antikankermedicijnen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk op te merken dat niet alle cellijnen geschikt zijn voor een specifieke 3D-kweekmethode en dat verschillende cellijnen sferoïden vormen die verschillen in vorm, grootte, histologie en groeikinetiek.De stimuleringsroutine die wij hebben ontwikkeld, maakt een effectieve evaluatie van de sferoïdegrootte mogelijk, in het bijzonder bij gedeeltelijk gedesintegreerde, met geneesmiddelen behandelde sferoïden die geen duidelijk gedefinieerde grens hebben voor de meting van het dwarsdoorsnede-oppervlak. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het feit dat de hier gepresenteerde modificatie geen extra apparatuur of verbruiksartikelen vereist en routinematig kan worden geïmplementeerd in uw arthropoden-screeninglaboratorium.

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.

De productie van grote aantallen grote gecontroleerde bolvormige tumoren met behulp microputjesplaten

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is van essentieel belang voor het begrip van microbiële fysiologie als een verschijnsel systemen-niveau. Een protocol voor experimentele manipulatie en een analytische aanpak worden ingevoerd, waardoor nauwkeurige, high-throughput analyse van bacteriële groei, die een belangrijke onderwerp van belang in de systeembiologie.

Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Deze protocollen zullen gebruikers helpen bij het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankercellijn-afgeleide sferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse.

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Leer een vloeibare overlay-techniek voor uniforme meercellige tumor-sferoïden in 384-well platen. Deze methode vermindert mediumverlies en verbetert de reproduceerbaarheid van 3D-cultuur assays.

Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten (Video) | JoVE Journal

Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten

Meer video's verkennen