Genetische kruisingen

Een genetische kruising is de doelbewuste paring van twee individuen die resulteert in de combinatie van genetisch materiaal in het nageslacht. Kruisingen kunnen worden uitgevoerd in veel modelsystemen—inclusief planten, gist, vliegen en muizen—en kunnen worden gebruikt om genetische processen te ontleden of organismen met nieuwe eigenschappen te creëren.

Deze video behandelt enkele van de principes van genetische kruisingen, onderzoekt een methode voor het uitvoeren van kruisingen die bekend staat als tetrad-analyse en bespreekt verschillende toepassingen van deze techniek.

Laten we eerst de basisprincipes van overerving introduceren die genetische kruisingen mogelijk maken.

Het fenotype, of samenstelling van eigenschappen, van een organisme wordt beïnvloed door zijn genetische samenstelling of genotype. Bij de meeste seksueel voortplantende organismen produceert de oudergeneratie haploïde gametcellen, die één exemplaar van elk verschillend chromosoom hebben. Deze versmelten tijdens de paring om een diploïde nakomeling te produceren met twee homologe kopieën van elk chromosoom. Als beide chromosomen dezelfde allel, of variantvorm van een gen, bevatten, is het organisme 'homozygoot' op dat genetische locus; anders is het 'heterozygoot'.

Om de cyclus opnieuw te beginnen, genereert het diploïde organisme opnieuw haploïde gameten via meiose. Tijdens dit proces ondergaan de twee homologe chromosomen 'recombinatie', waarbij stukjes equivalente sequenties tussen het paar worden uitgewisseld. Dit proces schuift de door de ouders geërfde allelen die door elke nakomeling worden geërfd, door elkaar, waardoor hun genetische diversiteit toeneemt.

Een van de eerste mensen die systematische genetische kruisingen uitvoerde, was de 'vader van de genetica', Gregor Mendel. Door gebruik te maken van de gemakkelijk te manipuleren erwt en het onderzoeken van een reeks eigenschappen met consistente overervingspatronen, was Mendel in staat om drie basiswetten van overerving af te leiden die de basis zouden vormen van de genetica.

Mendels eerste wet is de Wet van Uniformiteit, die stelt dat de heterozygote nakomelingen van de eerste, of F1, generatie van twee homozygote individuen het fenotype van slechts één ouder zullen hebben. Het allel dat dit fenotype vestigt, wordt 'dominant' genoemd, terwijl het 'verborgen' allel 'recestief' is. We weten nu dat dominantie-relaties vaak minder duidelijk zijn, met gevallen zoals onvolledige dominantie, waarbij heterozygoten een gemengd fenotype vertonen; en codominantie, waarbij beide fenotypes worden weergegeven.

De Wet van Segregatie stelt dat aan elke gameet willekeurig een allel wordt toegewezen. Door waar te nemen dat de F2-nakomelingen van de zelfbevruchting van heterozygote F1-individuen een 3:1 fenotypisch rationeel toonden, maar dat twee van de fenotypisch dominante individuen eigenlijk heterozygoten zijn, leidde Mendel af dat de twee ouderlijke allelen afzonderlijk moeten worden geërfd. Tegenwoordig weten we dat segregatie optreedt tijdens meiose, wanneer de twee homologe chromosomen van de diploïde ouder willekeurig worden verdeeld in haploïde dochtercellen, waarbij elk een van de twee allelen erft.

Mendels derde wet is de Wet van Onafhankelijke Assortiment, die stelt dat individuele eigenschappen onafhankelijk worden geërfd. We weten nu dat absolute onafhankelijkheid alleen bestaat voor eigenschappen die worden gecontroleerd door genen op afzonderlijke chromosomen in de haploïde set, die onafhankelijk worden verdeeld naar dochtercellen tijdens meiose. Voor twee genen op hetzelfde chromosoom is de afstand tussen hen omgekeerd evenredig aan de kans dat ze worden gecombineerd op verschillende homologe chromosomen en, bij uitbreiding, hoe waarschijnlijk ze samen worden geërfd in hetzelfde nageslacht. Daarom biedt het analyseren van de vier meiotische producten van een diploïde organisme een manier voor wetenschappers om de locatie van genen in kaart te brengen.

Na het bekijken van de principes achter genetische kruisingen, laten we een protocol voor tetrad-analyse bekijken.

Deze techniek wordt meestal toegepast op bepaalde eencellige algen of schimmels, zoals gist, om de vier haploïde meiotische producten, of sporen, te ontleden, die in deze soorten samen blijven als een 'tetrade' binnen een enkele cellichaam.

Om tetrad-analyse in gist uit te voeren, worden de gewenste stammen eerst gekweekt op geschikte media. Gistcellen van individuele kolonies worden tot paring toegelaten, bijvoorbeeld door elke stam in een kruisende patroon op een nieuwe plaat te strijken. Deze plaat wordt vervolgens gerepliceerd op selectieve media om alleen het diploïde product van de kruising te isoleren.

Geselecteerde diploïde cellen worden gekweekt op voedselarm medium om sporulatie en tetrad-vorming te induceren. De asci, die de structuren zijn die de tetrades van sporen bevatten, worden verteerd in oplossingen die het enzym zymolyase bevatten. Na vertering worden individuele asci gemanipuleerd met behulp van een tetrad-dissectiemicroscoop. Ze worden gerangschikt op specifieke locaties op een groeiplak en worden vervolgens ontbonden om de individuele sporen vrij te maken. Deze kunnen in een rasterachtig patroon worden geplaatst, waarbij elke spore een individuele kolonie zou genereren die verder kan worden geanalyseerd.

Nu u weet hoe tetrad-analyse wordt uitgevoerd, laten we enkele van de vele toepassingen of aanpassingen van deze techniek bekijken.

Handmatig dissecteren van tetraden is tijdrovend, en onderzoekers hebben hoogwaardige alternatieven bedacht, zoals barcode-ingerichte sequencing van tetraden. In deze methode werd de diploïde nakomelingen van een gistkruising getransformeerd met een bibliotheek van plasmiden, elk met een korte, unieke sequentie, bekend als een 'barcode', die fungeert als een identificerende markering voor elke nakomeling. De plasmiden drukken ook GFP uit, waardoor gist-asci kunnen worden geselecteerd via flow