Genetische screening

Genetische screenings zijn belangrijke hulpmiddelen voor het identificeren van genen en mutaties die verantwoordelijk zijn voor fenotypes van belang, en voor het begrijpen hoe genen functioneren in biologische processen. Screenings worden uitgevoerd in verschillende modelsystemen, waaronder vliegen, wormen, planten en celkweek, en hebben geleid tot de ontdekking van nieuwe cellulaire paden en mogelijke doelwitten voor geneesmiddelen voor menselijke ziekten.

Deze video geeft een overzicht van de verschillende soorten genetische screenings, legt twee algemene protocollen voor screenings in nematoden uit en laat enkele manieren zien waarop screenings tegenwoordig in laboratoria worden toegepast.

Eerst bekijken we wat genetische screenings zijn en wat we ervan kunnen leren.

Genetische screenings zijn gebaseerd op voorwaartse of omgekeerde genetica. In een voorwaartse of “klassieke” genetische screening worden mutaties willekeurig gegenereerd in het DNA van een organisme met behulp van straling of chemicaliën die bekend staan als mutageen. Er kunnen ook extra basen in het DNA worden ingevoegd, bijvoorbeeld met behulp van sequenties die bekend staan als transposons, die op verschillende posities in het genoom kunnen integreren en de functie van genen waarin ze worden ingebracht, verstoren. Deze soorten invoegingen worden vaak gekoppeld aan fluorescerende reporters om directe detectie van gemuteerde organismen mogelijk te maken. Wanneer een mutant een fenotype van belang vertoont, kan het onbekende gen dat gemuteerd is, worden toegewezen aan een chromosoom en worden gesequenced.

De tegenovergestelde benadering van screening is een omgekeerde genetische screening, waarbij onderzoekers de expressie van veel kandidaatgenen verstoren en vervolgens zoeken naar mutante fenotypes die het gevolg zijn van deze manipulaties.

Naast “functieverlies” mutaties die de activiteit van een gen verstoren, kunnen genetische screenings ook gebaseerd zijn op “functieverhoging” mutaties, die ervoor zorgen dat de expressie of functionaliteit van een gen toeneemt. Dit kan worden bereikt door willekeurig gen-regulerende elementen in het genoom in te voegen, wat de overexpressie van een gen zou veroorzaken waarvan het element zich stroomopwaarts bevindt.

Alternatief, in een methode genaamd “expressiescreening,” maken onderzoekers gebruik van bibliotheken van plasmiden die de eiwitcoderende sequenties van verschillende genen bevatten en introduceren deze in cellen waar de genen sterk zullen worden geëxpresseerd. Resulterende fenotypes kunnen vervolgens worden gebruikt om de genfunctie te begrijpen.

Om meer informatie over een bekend gen of een mutatie te ontdekken, kunnen modificatorscreningen worden gebruikt. Een suppressorscreen begint met een gekarakteriseerd mutant en identificeert aanvullende mutaties die het mutante fenotype minder ernstig maken. Een suppressormutatie die in hetzelfde gen als de oorspronkelijke mutatie wordt gevonden, wordt “intragenic” genoemd, terwijl een suppressormutatie die zich in een ander gen bevindt, als “extragenic” wordt beschouwd.

In tegenstelling hiermee identificeren enhancerscreenings aanvullende mutaties die de ernst van een mutant fenotype verhogen. Deze kunnen nuttig zijn om genen te bepalen die overbodig zijn of functioneel kunnen interageren. Als de combinatie van twee of meer mutaties resulteert in ernstig beperkte groei of zelfs de dood, wordt deze toestand “synthetische ziekte of letaliteit” genoemd. Een screening voor synthetische zieke of letale mutaties onthult genen die functioneren in redundante, maar essentiële, biologische paden. Dit is bijvoorbeeld nuttig bij het identificeren van meerdere genproducten die gelijktijdig met geneesmiddelen kunnen worden aangevallen om kankercellen te doden.

Nu u enkele veelvoorkomende genetische screeningsstrategieën begrijpt, laten we een algemeen protocol bekijken voor een voorwaartse screening in een populair modelorganisme, de nematodeworm.

In dit voorbeeld wordt chemische mutagenese uitgevoerd met ethylmethanesulfonaat of EMS, dat werkt door guanine nucleotiden chemisch te modificeren, waardoor ze onjuist paren met thymine in volgende rondes van DNA-replicatie. Omdat EMS een mutageen en een mogelijk carcinogeen is, moet het alleen worden gehanteerd met een dubbele laag handschoenen, en moet het werk worden uitgevoerd in een afzuigkap.

Om te beginnen worden grote aantallen wormen in het laatste larvale stadium geselecteerd, gewassen en verzameld. EMS wordt vervolgens aan de wormen toegevoegd en de wormen worden enkele uren geïncubeerd om mutaties te induceren. Na mutagenese moet EMS uit de wormen worden verwijderd en geïnactiveerd met natriumhydroxide. Wormen worden vervolgens meerdere keren gewassen in groeimedium en op agarplaten geplaatst.

Vervolgens worden gezond uitziende wormen overgebracht naar nieuwe platen die vers zijn gezaaid met bacteriën als voedselbron en mogen zich voortplanten. Nakomelingen van de tweede generatie kunnen visueel worden gescreend op mutante fenotypes, zoals bewegingsstoornissen.

Laten we nu een protocol doornemen voor een omgekeerde genetische screening in nematoden.

Een veelgebruikte benadering om omgekeerde screenings in wormen uit te voeren, is om de dieren een bibliotheek van bacteriën te voeren die dubbelstrengs RNA's uitdrukken, één per bacteriestam, die de expressie van één kandidaatgen per worm zullen onderdrukken. Deze bibliotheken zijn vaak commercieel verkrijgbaar en kunnen worden gecultiveerd voor gebruik in screenings.

Om te beginnen worden enkele kolonies bacteriën die individuele bibliotheekklonen bevatten gekweekt en wordt dubbelstrengs RNA-productie geïnduceerd. Cultures worden vervolgens op afzonderlijke putjes van een plaat met nematoden groeimedium gespot en mogen drogen in een steriele afzuigkap.

Vervolgens worden wormen op de bacteriën geplaatst en mogen drie tot vier dagen in een bevochtigde kamer voeden. Mutante fenotypes kunnen snel worden waargenomen, hetzij in de oorspronkelijke wormen die op de voedings