Name: Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Leer een snel, geautomatiseerd protocol voor kwantificering van spiervezelpopulaties in ratspieren met myosine zware keten immunohistochemie. Deze methode vermindert analyse tijd en gebruikersvariabiliteit aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de christelijke Doppler Research Foundation. We willen graag bedanken Sabine Rauscher van de Core Facility Imaging aan de Medische Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor ondersteuning van het gehele project. Primaire antilichamen werden ontwikkeld door Schiaffino, S., verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank, gecreëerd door de NICHD van de NIH en gehouden op de Universiteit van Iowa, Departement Biologie, Iowa City, IA.

Alle procedures met inbegrip van dierlijke proefpersonen uitgevoerd in overeenstemming met de principes van proefdier zorg zoals aanbevolen door FELASA 26. Goedkeuring werd voorafgaand aan het onderzoek, verkregen door de institutionele review board van de Medische Universiteit van Wenen en het Oostenrijkse ministerie van Onderzoek en Wetenschap (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, referentienummer: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014). 1. Muscle Harvest LET OP: Een eerdere publicatie van Meng et al. 27 is verkrijgbaar beschrijft welk bevriezing van spieren specimens in detail. <ol><li> Verkrijgen gehele spieren of onvoldoende weefsel gehele dwarsdoorsnede direct na euthanasie van de dieren te verkrijgen. <ol><li> Compleet verwijderen spierweefsel of een geanesthetiseerde rat geëuthanaseerd. Verwijderen bindweefsel en pezen rondom de spier met een tang en schaar. Voor eennesthesia of euthanasie, volgt de internationale richtlijnen van FELASA 28. </li></ol></li><li> Weeg spier met behulp van een gekalibreerde precisieweegschaal. Deze snelle stap kunt vergelijkende analyses tussen spier monsters, vooral na interventionele procedures. </li><li> Spier zet in een vat geheel gevuld met OCT-verbinding, volgens de grootte van de spier met een veiligheidsmarge van ongeveer 1 mm om alle kanten (bijvoorbeeld van aluminiumfolie). </li><li> Bevriezen bij ongeveer 2 minuten vooraf gekoelde isopentaan behulp van vloeibare stikstof. De isopentaan moet beginnen om witte kristallen te tonen aan de bodem van de houder. Opmerking: Deze stap is essentieel voor het behoud van de juiste architectuur van de spier waardoor aldus de juiste kleuren en vezels analyses 27. </li><li> WINKEL monsters geconserveerd in oktober gedurende ten minste 24 uur bij -80 ° C. Monsters kunnen echter worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende verscheidene maanden of zelfs jaren, als corre<html> ctly gekoeld. </li><li> 10 urn gesneden dwarsdoorsneden van het middendeel van de spier bij -20 ° C met een cryotoom. Als snijden bij 10 urn niet haalbaar, verhoging van de dikte in stappen van 2 urn tot maximaal 20 pm. Voldoende scherpe messen zijn van essentieel belang voor deze stap. </li><li> Breng de secties kleefstof dia&#39;s door de onderlinge aanpassing van de dia&#39;s om de doorsneden. De doorsneden automatisch vasthouden aan de lijm dia. Bewaar de dia&#39;s bij -20 ° C gedurende de nacht vóór kleuring. </li></ol> 2. kleuring OPMERKING: Een groot aantal antilichamen tegen myosine zware keten eiwitten zijn; echter hoogwaardige antilichamen zijn essentieel voor automatische registratie en verwerking. Voor verdunningen en verwijzing naar antilichamen, zie tabel 1. Voor rekenbladbestand de juiste verdunningen berekenen en bekijk het aantal benodigde hoeveelheid oplossing, ziesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx&quot;&gt;Supplemental File 1. <ol><li> Ontdooien en lucht-drogen ingevroren spiersecties gedurende 10 min vóór de kleuringsprocedure. </li><li> Wassen glijdt voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,05% Triton X gedurende 10 min en vervolgens gedurende 5 minuten. Triton is aangetoond dat de kleuring kwaliteit aanzienlijk te verbeteren. Zie de bespreking voor meer informatie. </li><li> Laat secties lucht drogen gedurende 2 min en bevatten de afzonderlijke dwarsdoorsneden elke dia via een hydrofoob pen (de vereiste hoeveelheid antilichaam minimaliseren) en wordt hem een ​​extra drogen gedurende 15 min. </li><li> Blokkeer alle objectglaasjes met PBS + 0,05% Triton X (PBST) bevattende 10% geitenserum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verdunnen alle primaire antilichamen (Tabel 1) in een cocktail van PBS + 0,05% Triton X (PBST) bevattende 10% geitenserum. Meng voldoende voor gebruik. Triton X is essentieel voor gelijke kleuring van het gehele dwarsdoorsneden. Berekenenongeveer 30 ui primair antilichaam cocktail per doorsnede. </li><li> Voor stappen 2,7-2,13 zorgen voor voldoende bescherming tegen licht. Verduisterde kamer verlichting en bedekt vlekken trays adequate bescherming bieden. Bovendien vult de kleuring bak met vloeistof onder een vochtige omgeving te bieden tijdens kleuring en uitdroogt. </li><li> Toepassen primair antilichaam (Tabel 1) cocktails tot de objectglaasjes gedurende 1 uur in een vochtige vlekken dienblad op kamertemperatuur. </li><li> Was dia&#39;s met PBS + 0,05% Triton X gedurende 10 minuten en daarna met nieuwe PBST gedurende 5 minuten. </li><li> Verdunnen secundaire antilichamen in een cocktail van PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% geitenserum. Bereken 30 ul van primair antilichaam cocktail per doorsnede. </li><li> Breng secundair antilichaam cocktail om de dia&#39;s gedurende 1 uur. </li><li> Was dia&#39;s met PBS + 0,05% Triton X (PBST) gedurende 10 min en nieuwe PBST gedurende nog 5 min. </li><li> Breng een DAPI kleuring van kernen kit (voorkeur lezen te gebruiken oplossingen) for 15 min of volgens de instructies van de fabrikant om celkernen vlek. </li><li> Wassen glijdt kort in PBS + 0,05% Triton X (PBST) gedurende 1 minuut. Daarna laat dia&#39;s kort aan de lucht drogen. </li><li> Breng fluorescerende montage medium en dekglaasjes. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht en voeren imaging optimaal binnen 24-48 uur. </li></ol> 3. Microscopie <ol><li> Load dia&#39;s in slide scanner. Maximaal 12 slides haalbaar afhankelijk van de diascanner. </li><li> Start een nieuw project. Voor voorbeeld stellen de DAPI kanaal en 2.5X lens. Voor een gedetailleerde analyse gebruiken DAPI, GFP, FITC en Cy5-kanalen en 20X objectief. Autofocus is gedurende het hele project in de DAPI kanaal verworven. </li><li> Gebruik de volgende kleuren voor elk kanaal: DAPI -blauw, FITC: groen, Texas Rood: rood, Cy5: geel. </li><li> Voorbeelden maken elk glaasje met de DAPI kanaal. Voor dit doel toe te passen handmatige scherpstelling op het eerste monster en deze gedurende de voorvertoninganalyse om een ​​voorbeeld foto&#39;s van ieder exemplaar te verwerven. </li><li> Outline elke dwarsdoorsnede die moeten worden opgenomen ter nadere acquisitieproces. Draw niet schetst dicht bij de randen van het monster, om de titel van het gehele gebied van belang te waarborgen. </li><li> Stel blootstellingstijden voor elk kanaal. Meestal blootstellingsparameters van de verschillende kanalen zijn identiek voor alle doorsneden. </li><li> Run automatische beeld acquisitie. Controleer de juiste aanwinst voor het eerste veld van standpunten, om onjuiste overname in het begin van het geautomatiseerde proces te voorkomen. </li><li> Indien nodig is, moet de afstandsbediening gebruik van desktop-mirroring software. Hierdoor kan de bewaking op afstand van de beeldopname proces weerspiegelen het computerscherm van de diascanner op een andere computer via een netwerk of internet. Hoewel, er geen wijzigingen kunnen worden aangebracht in de fysieke installatie met betrekking tot de gebruikte slides, de virtuele omgeving van het beeld acquisitie software maakt het mogelijk het toezicht op de<html> juiste scherpstelling en belichting tijden van de beelden. Bovendien kan de geschatte tijd voor voltooiing regelmatig worden gecontroleerd. </li><li> Na voltooiing van de beeldopname, de controle van de correcte autofocus van alle afbeeldingen handmatig besturen indien de vezel architectuur, afzonderlijke vezels en de verschillende vezeltypen te onderscheiden. </li><li> Re-verwerven verkeerd gericht beeld gebieden voor enkele gezichtsvelden of hele gebieden van belang. Voor de herovering van enkele gebieden, markeren gebieden of beelden in het hele project opnieuw te verwerven gebieden met een handmatige scherpstelling. In de meeste gevallen een extra afbeelding detail in een andere focus niveau leidt tot de ten onrechte scherpe beelden </li><li> Voor elke doorsnede die moeten worden opgenomen in de uiteindelijke analyse, exporteert elk kanaal (exclusief DAPI) afzonderlijk jpeg-bestanden. Naam en bestanden sorteren op basis van de blootgestelde kanalen in mappen met de naam Texas Red, FITC en Cy5. </li></ol> 4. Geautomatiseerde vezelanalyse tent &quot;&gt; NB: De macro kan worden verkregen uit de volgende webpagina: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/ <ol><li> Voorbeeld elk beeld met een gebruikelijke beeldbewerking software voor analyse en letten op voldoende contrast tussen vezels gekleurd en achtergrond. Indien nodig de contrast en de helderheid van het verschil vergroten behulp helderheids- en contrastregeling commando. </li><li> Open ImageJ of Fiji. Open de macro met de opdracht &quot;Plugins - Macro&#39;s -. Edit&quot; Dit toont de macro&#39;s broncode en zorgt voor een snelle aanpassing van parameters. Verander indien nodig de map directory voor elk kanaal in de broncode van de macro. OPMERKING: Waarden voor spiervezel analyses zijn gebaseerd op ratten biceps en lumbricale spieren, of andere soorten spieren kunnen verschillende waarden vereisen. </li><li> Gebruik de opdracht &quot;run&quot; om de macro te starten. Alle beelden van de map worden nu geladen in de macro en gekwantificeerd in een opeenvolgende volgorde. De resultaten zijn shown in een nieuw venster. Deze stap kan van seconden tot enkele uren, afhankelijk van de hoeveelheid data te analyseren. </li><li> Exporteer het raam resultaten als een spreadsheet-bestand. Identificeert instellingen voor het positief geteld Cy5 (langzaam), FITC (tussenproduct) en Texas Red (snel) vezels en samenvatten van totaal aantal vezels. </li></ol>

<ol><li>Kung, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Unit+Changes+Seen+With+Skeletal+Muscle+Sarcopenia+in+Oldest+Old+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).</li>
<li>Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+muscle+fiber+clustering+in+the+diaphragm+muscle+of+sarcopenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice.</a> Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).</li>
<li>Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+Between+Muscle+Fiber+Type+and+Reactive+Balance%3A+A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mot+Behav%22%5BJournal%5D)">Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study.</a> J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).</li>
<li>Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+Muscle+Overuse+Causes+Bilateral+Changes+in+Muscle+Fiber+Composition+and+Vascular+Supply%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply.</a> PLoS ONE. 9 (12), 116455(2014).</li>
<li>Hopker, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+training+status%2C+age%2C+and+muscle+fiber+type+on+cycling+efficiency+and+endurance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).</li>
<li>Pette, D., Staron, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms%2C+muscle+fiber+types%2C+and+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions.</a> Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).</li>
<li>Suga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-predominant+promoter+activity+in+lentiviral-mediated+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse.</a> PLoS One. 6 (3), 16908(2011).</li>
<li>Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+muscle+fiber+type+measurements+with+clinical+and+molecular+genetic+data+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).</li>
<li>Rader, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cleft+palate+repair+on+the+susceptibility+to+contraction-induced+injury+of+single+permeabilized+muscle+fibers+from+congenitally-clefted+goat+palates%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac+J%22%5BJournal%5D)">Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates.</a> Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).</li>
<li>Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+type+II+muscle+fiber+damage+from+plyometric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Athl+Train%22%5BJournal%5D)">Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise.</a> J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).</li>
<li>Lieber, R. L., Fridén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+skeletal+muscle+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of skeletal muscle architecture.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+types+in+skeletal+muscle%3A+a+personal+account%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Fibre types in skeletal muscle: a personal account.</a> Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).</li>
<li>Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+velocity+and+myosin+heavy+chain+and+alkali+light+chain+isoform+composition+in+rat+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres.</a> J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).</li>
<li>Larsson, L., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+velocity+of+shortening+in+relation+to+myosin+isoform+composition+in+single+fibres+from+human+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles.</a> J Physiol. 472, 595-614 (1993).</li>
<li>Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+methods+for+the+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+size+and+metabolic+type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).</li>
<li>Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieber%2C+RL+%22Skeletal+muscle+structure%2C+function%2C+and+plasticity%22">Skeletal muscle structure, function, and plasticity</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).</li>
<li>Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+muscle+fiber+typing+by+quantitative+enzyme+assays+and+by+myosin+ATPase+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining.</a> J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).</li>
<li>Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+typing+in+routinely+processed+skeletal+muscle+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies.</a> Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).</li>
<li>Likar, B., Pernuš, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+serial+transverse+sections+of+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Registration of serial transverse sections of muscle fibers.</a> Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fiber-type-specific+cross-sectional+area+assessment+and+myonuclei+counting+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), 35273(2012).</li>
<li>Bergmeister, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+muscle+fiber+type+population+analysis+with+ImageJ+of+whole+rat+muscles+using+rapid+myosin+heavy+chain+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry.</a> Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+guidelines+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA guidelines and recommendations.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), e51586(2014).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Ribarič, S., ČebaŠek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+Myosin+Heavy+Chain+Isoforms+in+Single+Muscle+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections.</a> Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Hier tonen we een algemeen toegankelijke methode te bestuderen automatisch kwantificeren spiervezel populaties ratten doorsneden door immunohistochemie in een tijd efficiënte manier. Voor reproduceerbaarheid presenteren wij een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving en mogelijke modificaties voor toepassingen in andere soorten niet beschreven in deze studie. Verder bespreken we de voordelen van de werkwijze voorwaarden voor een optimale werking en beperkingen. Momenteel is een aantal...

Skeletspier samenstelling ondergaat diepgaande veranderingen in fysiologische processen zoals veroudering 1, 2, oefening 3, 4, 5, 6, 7 of pathofysiologische processen zoals de ziekte van 8, 9, 10 of 11 trauma. Vandaar dat een aantal onderzoeksgebieden concentreren op de structurele effecten van deze processen naar functionele veranderingen te begrijpen. Een van de belangrijkste aspecten van het bepalen van de spierfunctie is de samenstelling van de spiervezels. Spiervezels express zware keten (MHC) eiwitten verschillende myosine en worden daardoor geclassificeerd in langzame, tussengelegen of snelle vezels 7, 12, 13 </sup<html> &gt;, 14, 15, 16, 17. Fysiologisch spieren verschillende spiervezels samenstelling afhankelijk van hun functie in het lichaam. Gebruik spiervezels typen, kan vezelpopulaties worden gekwantificeerd aanpassing identificatie van fysiologische of pathofysiologische processen 7, 17. Historisch gezien een aantal tijdrovende methoden toegepast om onderscheid te maken tussen types spiervezels. Hiertoe werden spiervezels geclassificeerd hetzij reactiviteit van myosine ATPase bij verschillende pH-niveaus of spier enzymactiviteit. Aangezien verschillende vezelkwaliteiten niet een enkel kon worden vastgesteld, werden meerdere doorsneden nodig om alle spiervezels te identificeren en toe handmatig kwantificering 14, 16, 17,= &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20, 21, 22. Daarentegen recente publicaties gebruikt immunohistochemie (IHC) tegen myosine zware keten eiwit snel vlek meerdere soorten vezels in één dwarsdoorsneden. Op basis van de voordelen van deze procedure, wordt nu beschouwd als de gouden standaard in de spiervezels populatie-analyse 19, 23, 24. Middels verbeterde IHC kleuringsprotocollen, waren we recent aantonen dat de volledig automatische verwerving van volledige spieren dwarsdoorsneden en daaropvolgende automatische spiervezels kwantificering mogelijk van de open source platform ImageJ. Vergeleken met handmatige kwantificering onze procedure een significant kortere periode (circa 10% van handmatige analyses) nodig per slede terwijl nauwkeurigheid van ± 4% 25 </sup&gt;. Het algemene doel van deze werkwijze is een snelle, betrouwbare, gebruikersonafhankelijke lijst automatisch spiervezel te kwantificeren geheel rat spieren beschrijven het gebruik van een open source platform. Daarnaast beschrijven we mogelijke modificaties dat het gebruik van andere monsters zoals muizen of menselijke spieren zou toelaten.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>Tissue-Tek, Sakura, Netherlands</td><td></td><td>Voor het inbedden van spierweefsel</td></tr><tr><td>Isopentaan</td><td></td><td></td><td>voor voldoende bevriezing van spierweefsel</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus slides</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>1014356190</td><td>adhesief schuifje</td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>85112</td><td>Detergens Oplossing</td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>50197Z</td><td>Geitenserum</td></tr><tr><td>DAKO Fluorescent Mounting Medium</td><td>Dako Denmark</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Dako pen</td><td>Dako Denmark</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>TissueFAXSi plus</td><td>TissueGnostics, Wenen, Oostenrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, VS)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, VS)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, VS)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa&nbsp;Fluor&nbsp;633&nbsp;Geit Anti-Muis IgG2b&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>A-21146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Geit Anti-Muis IgG1&nbsp;(&gamma;1)</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Geit Anti-Muis IgM (&micro; keten)</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagens</td><td>Thermo Scientific, Germany</td><td>R37606</td><td></td></tr></tbody></table>

een rapid automated protocol voor muscle fiber population analysis in rat muscle dwarsdoorsneden met behulp van zware keten van myosine immunohistochemie

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Kwantificatie van spiervezel populaties verschaft meer inzicht in de gevolgen van de ziekte, trauma en verschillende andere invloeden op skeletspier samenstelling. Diverse tijdrovende methoden zijn van oudsher gebruikt om vezelpopulaties studeren op vele terreinen van het onderzoek. Echter, recent immunohistochemische methoden op basis van myosine zware keten eiwitexpressie ontwikkeld te snel alternatief voor meerdere vezeltypes is uit een enkele sectie. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare en reproduceerbare protocol voor betere kleuring kwaliteit, waardoor automatisch ophalen van hele dwarsdoorsneden en automatische kwantificatie van vezelpopulaties met ImageJ. Hiertoe zijn ingebed skeletspieren gesneden dwarsdoorsneden, gekleurd met myosine zware ketens kunnen antilichamen met fluorescente secundaire antilichamen en DAPI kleuring van celkernen. Hele dwarsdoorsneden automatisch gescand met diascanner hoge resolutie composiet te verkrijgenfoto&#39;s van het gehele monster. Vezels populatie analyses worden vervolgens uitgevoerd om langzame, intermediaire en snelle vezels behulp van een geautomatiseerde macro voor ImageJ kwantificeren. We hebben eerder aangetoond dat deze methode vezelpopulaties betrouwbare wijze identificeren mate van ± 4%. Daarnaast is deze methode minder inter-user variabiliteit en tijd per analyses aanzienlijk van de open source platform ImageJ.

Hele rattenspier doorsneden werden gekleurd met immunohistochemie snel identificeren MHC I, IIA en IIB spiervezels. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop diascanner, werden gehele doorsneden automatisch verkregen geautomatiseerde spiervezels analyses ImageJ. Het concept van de procedure is gebaseerd op een eenvoudige, betrouwbare en tijdbesparende workflow voor het kwantificeren van spiervezels. Werkstroom van de procedur...

Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Het algemene doel van deze methode is om op een snelle en betrouwbare manier de kwantificering van spiervezels in volledige ratspieren te begeleiden, op een automatische en gebruikersonafhankelijke wijze met behulp van een open-source platform. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het neuromusculaire veld over defecten door veroudering, ziekte of trauma in skeletspieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om spiervezelpopulaties betrouwbaar te analyseren en om beelden van hoge kwaliteit van spierdwarsdoorsneden te genereren.Na voldoende ontdooiing worden de monsters voorzichtig gespoeld in PBS aangevuld met Triton X, of PBST, gedurende één wasbeurt van 10 minuten en één wasbeurt van vijf minuten. Na de tweede wasbeurt worden de coupes twee minuten aan de lucht gedroogd. Gebruik vervolgens een hydrofobe pen om de individuele dwarsneden te omcirkelen.Na nog eens 15 minuten aan de lucht te hebben gedroogd, wordt aspecifieke binding geblokkeerd met PBST aangevuld met geitenserum gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de coupes en voeg de juiste primaire antilichaamcocktail toe aan elk monster voor een kleuring van één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Spoel de coupes aan het einde van de incubatie af met één wasbeurt van 10 minuten en één wasbeurt van vijf minuten met PBST.Label vervolgens de spiersneden gedurende één uur, beschermd tegen licht, met het passende cocktail van secundaire antilichamen. Nadat de objectglaasjes twee keer zijn gewassen in PBST, zoals gedemonstreerd, worden de glaasjes drooggeblazen en vervolgens worden de kernen gekleurd met een DAPI-kernkleuringskit volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder het overtollige DAPI met een PBST-wasbeurt van één minuut, gevolgd door een kortstondige lucht-droging.Dek de monsters vervolgens af met fluorescent monteermedium en dekglas, en bewaar de preparaten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Laad de preparaten binnen 24 tot 48 uur na de kleuring in een slide-scanner en open een nieuw project in de programmasoftware. Selecteer voor het voorbeeld van het preparaat het DAPI-kanaal en de 2,5x lens, en stel handmatig scherp op het eerste specimen.Kader elke doorsnede af die moet worden opgenomen voor het gedetailleerde acquisitieproces en stel de belichtingstijden voor elk kanaal in. Start nu de automatische beeldacquisitie en controleer of het eerste gezichtsveld correct wordt opgenomen, om een foutieve acquisitie aan het begin van het geautomatiseerde proces te voorkomen. Wanneer de beeldacquisitie is voltooid, controleer dan handmatig of de autofocus van de doorsneden correct is en of de individuele vezels duidelijk te onderscheiden zijn.Het is essentieel dat de autofocus voor elke afbeelding handmatig wordt gecontroleerd en indien nodig wordt gecorrigeerd. Het geautomatiseerde proces voor de kwantificering van spiervezels vereist afbeeldingen van hoge kwaliteit om optimale resultaten te verkrijgen. Exporteer vervolgens voor elke dwarsdoorsnede die in de uiteindelijke analyses moet worden opgenomen elk kanaal, behalve DAPI, afzonderlijk als JPEG-bestanden; benoem en sorteer de bestanden in de bijbehorende mappen op basis van de belichte kanalen.Voordat u begint met het proces voor de kwantificering van spiervezels, bekijkt u elke afbeelding in de geschikte beeldbewerkingssoftware om te bevestigen dat er voldoende contrast is tussen de gekleurde vezels en de achtergrond. Gebruik vervolgens in ImageJ het commando Plugins&gt;Macros&gt;Edit om de broncode van de macro weer te geven en wijzig de mapdirectory voor elk kanaal in de broncode van de macro. Gebruik nu het commando Run om de macro te starten.Alle afbeeldingen in de map worden in de macro geladen en in opeenvolgende volgorde gekwantificeerd. Exporteer aan het einde van de kwantificering de resultaten naar de geschikte spreadsheetsoftware en bepaal de waarden voor de positief getelde langzame, intermediaire en snelle vezels. Het totale aantal vezels kan vervolgens worden berekend.De immunofluorescente kleuring van spiervezels verloopt snel met minimale kruisreactiviteit, en de resulterende beelden vertonen een hoog contrast tussen de gekleurde vezels en het omringende weefsel, evenals een sterk onderscheid tussen de verschillende vezeltypen. Automatische analyse maakt de detectie van de relatieve spiervezelpopulaties mogelijk met een nauwkeurigheid van plus of minus 4% vergeleken met de handmatige analyse, waarbij de totale absolute aantallen hoger liggen dan bij de handmatige analyse. De relatieve aantallen blijven echter vergelijkbaar, binnen een bereik van plus of minus 4%.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze methode kunt gebruiken om de kwantificering van spiervezels te automatiseren. Vergeet niet dat het werken met DAPI gevaarlijk kan zijn. Draag daarom de juiste beschermingsmiddelen tijdens het uitvoeren van de kleuring.

a-rapid-automated-protocol-for-muscle-fiber-population-analysis-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Dit protocol schetst een methode om Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopers (MP's) te isoleren uit de skeletspieren van ratten. Het gebruik van de rat in spierletselmodellen zorgt voor een verhoogde beschikbaarheid van weefsel van atrofische spieren voor de analyse en een groter repertoire van gevalideerde methoden om spierkracht en gang bij vrij bewegende dieren te beoordelen.

Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

Het protocol toont een methode om ruimtelijke correlatie tussen de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en peri-synaptische Schwann-cellen in de mediale gastrocnemius-spier van de rat te onderzoeken met behulp van fluorescerende immunohistochemie met verschillende biomarkers, namelijk neurofilament 200, vesiculaire acetylcholinetransporter, alfa-bungarotoxine en S100.

Visualisatie van de morfologische kenmerken van neuromusculaire overgang in rat mediale gastrocnemiusspier

Hier presenteren we een protocol om veranderingen in mitochondriale dichtheid en longitudinale distributie te analyseren door middel van beeldvorming van levende skeletspieren met behulp van confocale microscopie voor het scannen van mitochondriale netwerken.

Analyse van de mitochondriale dichtheid en longitudinale verdeling in levende skeletspiervezels van ratten door confocale microscopie

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Leer een snel, geautomatiseerd protocol voor kwantificering van spiervezelpopulaties in ratspieren met myosine zware keten immunohistochemie. Deze methode vermindert analyse tijd en gebruikersvariabiliteit aanzienlijk.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie (Video) | JoVE Journal

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Meer video's verkennen