Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking
3 april 2017
Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.
Het algemene doel van deze procedure is om macrofagen effectief te isoleren en te karakteriseren uit weefsels die gewoonlijk worden beïnvloed door door voeding veroorzaakte ontstekingen, zoals de lever. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie en ontsteking over hoe het fenotype van weefsel-residente macrofagen de progressie van chronische ontstekingsziekten kan bepalen. Het grote voordeel hiervan is dat de procedure de isolatie-stappen optimaliseert die nodig zijn voor het verkrijgen van suspensies van enkele cellen die zijn afgeleid van weefsels die zijn aangetast door obesitas-gemediëerde lage graad chronische ontsteking.
De procedure wordt gedemonstreerd door Joselyn Allen, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om de lever te isoleren, plaatst u eerst een met ethanol doordrenkte muis in rugligging op een polystyreen schuim snedebord en zet de voor- en achterpoten vast. Gebruik vervolgens een pincet met mediumpunt om de buikhuid nabij de opening van de urethra vast te grijpen en gebruik scherpe snede schaar om een kleine incisie te maken in de opgetilde huid.
Plaats de onderste blad van de schaar in de incisie tussen de huid en het buikvlies en maak een laterale incisie van de lies naar de kin. Trek voorzichtig de huid terug om de intacte buikholte en borstwand bloot te leggen en maak een laterale incisie door het buikvlies. Til het borstbeen op en snij voorzichtig in het middenrif.
Verplaats vervolgens de spijsverteringsorganen opzij en lokaliseer de subhepatische inferieure vena cava of IVC. Gebruik hemostatische klemmetjes om de suprahepatische IVC te klemmen om een lokale perfusie te handhaven en bevestig een spuit gevuld met voorverwarmde perfusiebuffer aan een 23 gauge bloedopname- en infuusset. Druk voorzichtig op de zuiger totdat de slang en de naald zijn gevuld met perfusiebuffer en steek de naald parallel aan de subhepatische IVC in.
Juiste canulerings van de IVC zorgt ervoor dat de dissociatiebuffer lokaal wordt verdeeld door de lever en perifere weefsels, waardoor de weefseldissimatie wordt geoptimaliseerd. Gebruik een vier centimeter hemostaticum om de naald op zijn plaats te bevestigen en druk voorzichtig op de zuiger om de perfusie te starten. Als de naald correct is gepositioneerd, zal de kleur snel uit de lever spoelen en zullen de lobben vergrooten.
Snij snel de poortader door om de perfusiebuffer vrij door de lever te laten stromen, masseer af en toe voorzichtig de lobben tussen de duim en wijsvinger om de verwijdering van het bloed te vergemakkelijken. Wanneer er nog maar vijf milliliter perfusiebuffer over is, vervang de perfusiebuffer-spuit door een spuit gevuld met voorverwarmde dissociatiebuffer, blijf voorzichtig de lobben masseren en de lever perfunderen totdat deze volledig is gedigesteerd. Bevestig een succesvolle digestie door voorzichtig de stompe rand van een tang in de linker laterale lob te drukken.
Er zou een indrukking moeten verschijnen op het oppervlak dat langzaam vult zodra de tang is verwijderd. Verwijder vervolgens de naald en gebruik een kort rechte mes van een paar snede schaar om voorzichtig de verbindingsligamenten door te snijden om de hele lever en galblaas te verwijderen. Breng de lever over naar een 10 centimeter schaaltje met 10 milliliter ijskoud DMEM en gebruik getande tang om de afgesneden suprahepatische IVC vast te grijpen.
Gebruik een pincet met mediumpunt en breng een snelle strijkbeweging toe op elke lob om de cellen los te maken van de Glisson's Capsule en laat het verzadigde DMEM door een 70 micrometer cel zeef in een 50 milliliter kegelbuisje op ijs lopen. Hoge opbrengsten van levensvatbare cellen kunnen alleen worden bereikt door de levercellen goed los te maken van de Glisson's Capsule. Wanneer alle cellen zijn verzameld, keer de buis om om de celsuspensie voorzichtig te mengen en pel de cellen door centrifugatie.
Breng het supernatant over naar een nieuwe 50 milliliter kegelbuis voor nog drie lage-snelheid centrifugaties. Na de laatste centrifugatie, breng het supernatant over naar een nieuwe 50 milliliter buis en centrifugeer de cellen nog een keer bij een hogere snelheid. Sla de niet-parenchymale cel pellet vervolgens op in FACS buffer voor telling en verdun de levercellen tot de juiste concentratie volgens hun downstream toepassing in gelabelde vijf milliliter ronde bodem polystyreen buisjes.
Muizen die een hoog vet dieet of een hoog vet hoog cholesterol dieet krijgen, vertonen een verhoogde infiltratie van klassiek geactiveerde M1 macrofagen in aangetaste weefsels zoals de aorta. RON-receptor expresserende aortische CD45 positieve F4/80 positieve macrofagen die een anti-inflammatoire fenotype vertonen, zijn verminderd in muizen die een hoog vet hoog cholesterol dieet krijgen, terwijl pro-inflammatoire CD45 positieve F4/80 positieve CD11c positieve macrofagen in verhoogde aantallen worden aangetroffen in aorta's geïsoleerd uit deze dieren. Verder vertonen gesorteerd RON-receptor expresserende macrofagen afkomstig van gedigesteerde aorta's een verhoogde expressie van het Arginase 1-gen, een goed gevestigde M2-macrofaagmarker.
Inderdaad, de karakterisering van lever-residente macrofagen onthult het overheersende fenotype van RON-receptor expresserende subpopulaties met CD11c positieve pro-inflammatoire macrofagenpopulaties die een verminderde expressie vertonen van genen die sterk geassocieerd zijn met het anti-inflammatoire M2-fenotype. Vergelijkbare trends worden waargenomen in de macrofagenpopulaties geïsoleerd uit gedigesteerd wit vetweefsel, waarbij pro-inflammatoire macrofagenpopulaties een verminderde oppervlakte-expressie van de RON-receptor vertonen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 20 tot 30 minuten per dier worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.
Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flowcytometrie, fluorescentie-geactiveerde celsortering en/of kwantitatieve PCR worden uitgevoerd om het fenotype van de geïsoleerde lever-afgeleide weefsel-residente macrofagen verder te karakteriseren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u weefsel-residente macrofagen uit zieke lever kunt isoleren. Bedankt voor het bekijken en veel succes met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol stelt onderzoekers in staat om tissue-residente macrofagen te isoleren en te karakteriseren uit ontstoken weefsels die zijn aangetast door voedingsgeïnduceerde metabole stoornissen. De methode richt zich op het optimaliseren van isolatie-stappen voor het verkrijgen van single-cell suspensies uit weefsels die zijn aangetast door obesitas-gemedieerde ontsteking.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Ontsteking
- Metabole Stoornissen
Achtergrond
- Tissue-residente macrofagen spelen een cruciale rol bij chronische ontstekingsziekten.
- Diet-geïnduceerde ontsteking beïnvloedt verschillende weefsels, met name de lever.
- Inzicht in macrofagen-fenotypen kan behandelingsstrategieën informeren.
- Dit protocol verbetert de efficiëntie van het isoleren van macrofagen voor onderzoek.
Doel van de Studie
- Om macrofagen te isoleren en te karakteriseren uit ontstoken weefsels.
- Om de rol van macrofagen in chronische ontsteking te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het verkrijgen van single-cell suspensies.
Gebruikte Methoden
- Isolatie van leverweefsel uit door dieet geïnduceerde modellen.
- Gebruik van ethanol-geweekte muizen voor weefselextractie.
- Dissectietechnieken om weefselmonsters te verkrijgen.
- Karakterisering van macrofagen-fenotypen na isolatie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van macrofagen uit leverweefsel.
- Karakterisering van macrofagen-fenotypen gekoppeld aan ontsteking.
- Geoptimaliseerd protocol verbetert de efficiëntie van celisolatie.
- Inzichten in de rol van macrofagen bij metabole stoornissen.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van tissue-residente macrofagen.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van chronische ontstekingsziekten.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methodologie voor verdere inzichten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Macrophage heterogeneity in obesity-driven inflammation is a critical determinant of disease progression and therapeutic targeting in metabolic and cardiovascular disorders. This protocol enables robust isolation and phenotypic characterization of tissue-resident macrophages from inflamed liver, aorta, and adipose tissue, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. Reliable access to well-characterized immune cell populations enhances translational continuity and de-risks mechanistic hypotheses across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of macrophage-driven inflammatory pathways in disease-relevant tissues.
- Supports functional target validation by distinguishing pro- and anti-inflammatory macrophage phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative phenotypic analysis of immune cell subsets.
- Improves predictive confidence for portfolio triage in metabolic and cardiovascular indications.
Screening & Assay Development
- Provides standardized single-cell suspensions for downstream flow cytometry and FACS workflows.
- Ensures reproducibility and quantitative output for immune cell profiling assays.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for compound screening.
- Supports reliable evaluation of immunomodulatory agents in disease-relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns macrophage phenotyping with translational biomarker strategies in metabolic disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of immune targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking cellular phenotypes to disease progression.
- De-risks preclinical models by enabling precise immune cell characterization.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from hypothesis testing to lead identification and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of macrophage function in inflamed tissues.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immune cell readouts for assay development.
- Analytics: Provides flow cytometry and gene expression data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects immune cell phenotypes to preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for immune cell isolation across metabolic disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes and streamlines immune cell isolation for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune-modulating therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and flow cytometry analysis.
- Demands access to FACS instrumentation and quantitative PCR capabilities for downstream characterization.
- Necessitates cross-team standardization of isolation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to multiple inflamed tissue types, including liver, aorta, and adipose tissue.
- Dependent on careful troubleshooting to optimize cell yield and viability from dense or fibrotic tissues.
