Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Het algemene doel van deze procedure is om effectief macrofagen te isoleren en te karakteriseren uit weefsels die vaak worden getroffen door dieet-geïnduceerde ontsteking, zoals de lever. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de velden van immunologie en ontsteking over hoe het fenotype van weefselresidenten macrofagen het verloop van chronische ontstekingsziekten kan bepalen. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat de procedure de isolatiestappen optimaliseert die nodig zijn voor het verkrijgen van enkelcel-suspensies afgeleid van weefsels die zijn beïnvloed door obesitas-gemedieerde chronische laaggradige ontsteking.

De procedure wordt gedemonstreerd door Joselyn Allen, een promovendus uit mijn laboratorium. Om de lever te isoleren, plaats je eerst een met ethanol gedrenkte muis in rugligging op een dissectieplank van polystyreen schuim en fixeer je de voor- en achterpoten. Gebruik vervolgens een pincet met een medium punt om de abdominale huid nabij de urethraopening vast te pakken en maak met scherpe dissectieschaaren een kleine incisie in de opgetilde huid.

Steek het onderste blad van de schaar in de incisie tussen de huid en het peritoneum en maak een laterale incisie van de lies tot aan de kin. Trek de huid voorzichtig terug om de intacte peritoneumholte en de thoraxwand bloot te leggen en maak een laterale incisie door het peritoneum. Til het sternum op en incideer voorzichtig het diafragma.

Verschuif vervolgens de maagdarmorganen naar de zijkant en localizeer de subhepatische vena cava inferior of IVC. Klem met hemostatische forceps de suprahepatische IVC af om een gelokaliseerde perfusie te behouden en bevestig een spuit gevuld met voorverwarmde perfusiebuffer aan een bloedafname- en infusieset met een 23 gauge naald. Druk voorzichtig op de zuiger totdat de slang en de naald gevuld zijn met perfusiebuffer en voer de naald parallel aan de subhepatische IVC in.

Correcte canulatie van de IVC zorgt ervoor dat de dissociatiebuffer lokaal door de lever en perifere weefsels wordt verspreid, waardoor de weefseldigestie wordt geoptimaliseerd. Gebruik een hemostatische klem van vier centimeter om de naald op zijn plaats te fixeren en druk voorzichtig op de zuiger om de perfusie te starten. Als de naald correct is geplaatst, zal de kleur snel uit de lever verdwijnen en zullen de lobben groter worden.

Snijd prompt de poortader door om de perfusiebuffer vrij door de lever te laten stromen, waarbij de lobben af en toe voorzichtig tussen duim en wijsvinger worden gemasseerd om de verwijdering van het bloed te vergemakkelijken. Wanneer er nog slechts vijf milliliter perfusiebuffer over is, wordt de spuit met perfusiebuffer vervangen door een spuit gevuld met voorverwarmde dissociatiebuffer; ga door met het voorzichtig masseren van de lobben en het perfunderen van de lever totdat deze volledig is verteerd. Bevestig een succesvolle digestie door de stompe zijde van een pincet voorzichtig in de linker laterale lob te drukken.

Er moet een inkeping op het oppervlak verschijnen die langzaam weer opvult zodra de pincet wordt verwijderd. Verwijder vervolgens de naald en gebruik een kort recht blad van een dissectieschaar om voorzichtig door de verbindende ligamenten te snijden om de gehele lever en de galblaas te excideren. Breng de lever over naar een schaal van 10 centimeter met 10 milliliter ijskoud DMEM en gebruik een gekartelde pincet om de doorgesneden suprahepatische IVC vast te pakken.

Gebruik een pincet met een medium punt en maak een snelle strijkende beweging over elke lob om de cellen uit het kapsel van Glisson los te maken, en breng het verzadigde DMEM via een 70 micrometer cell strainer over in een 50 milliliter conische buis op ijs. Hoge opbrengsten van levensvatbare cellen kunnen alleen worden bereikt door de levercellen correct te dissociëren van het kapsel van Glisson. Wanneer alle cellen zijn verzameld, keer dan de buis om om de celsuspensie voorzichtig te mengen en pellet de cellen door centrifugatie.

Breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter voor drie extra centrifugaties op lage snelheid. Na de laatste centrifugatie wordt het supernatant overgebracht naar een nieuwe buis van 50 milliliter en worden de cellen nogmaals gecentrifugeerd bij een hogere snelheid. Resuspendeer vervolgens de pellet van niet-parenchymale cellen in FACS-buffer voor het tellen en verdun de levercellen tot de juiste concentratie, afhankelijk van de daaropvolgende toepassing, in gelabelde polystyreen buisjes met een ronde bodem van vijf milliliter.

Muizen die een vetrijk dieet of een dieet met een hoog vet- en cholesterolgehalte kregen, vertonen een verhoogde infiltratie van klassiek geactiveerde M1-macrofagen in aangetaste weefsels zoals de aorta. RON-receptor-expresserende aortische CD45-positieve F4/80-positieve macrofagen, die een anti-inflammatoir fenotype vertonen, zijn verminderd bij muizen die een dieet met een hoog vet- en cholesterolgehalte kregen, terwijl pro-inflammatoire CD45-positieve F4/80-positieve CD11c-positieve macrofagen in verhoogde aantallen worden aangetroffen in aorta's die uit deze dieren zijn geïsoleerd. Bovendien vertonen gesorteerde RON-receptor-expresserende macrofagen, afkomstig uit gedigesteerde aorta's, een verhoogde expressie van het Arginase 1-gen, een goed vastgestelde M2-macrofaagmarker.

Inderdaad, de karakterisering van lever-residente macrofagen onthult het overheersende fenotype van RON-receptor-expresserende subpopulaties met CD11c-positieve pro-inflammatoire macrofaagpopulaties, waarbij een verminderde expressie van genen wordt aangetoond die sterk geassocieerd zijn met het anti-inflammatoire M2-fenotype. Vergelijkbare trends worden waargenomen in de macrofaagpopulaties die zijn geïsoleerd uit gedigesteerd wit vetweefsel, waarbij macrofaagpopulaties met een pro-inflammatoir fenotype een verminderde oppervlakte-expressie van de RON-receptor vertonen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in 20 tot 30 minuten per dier worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flowcytometrie, fluorescentie-geactiveerde celsortering en/of kwantitatieve PCR worden uitgevoerd om het fenotype van de geïsoleerde leverafgeleide weefselresidente macrofagen verder te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u weefselresidente macrofagen correct kunt isoleren uit zieke levers. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.