Name: Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer macrofagen isoleren en karakteriseren uit leverweefsel bij metabole ontsteking. Deze methode optimaliseert enkelcelopbrengst voor immunologisch onderzoek naar chronische ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedank de Stroom Cytometry Core faciliteit in de Pennsylvania State Universiteit Millennium wetenschap Complex.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li>
<li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+with+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease.</a> Nature. 444 (12), 875-880 (2006).</li>
<li>Jung, U., Choi, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Its+Metabolic+Complications%3A+The+Role+of+Adipokines+and+the+Relationship+between+Obesity%2C+Inflammation%2C+Insulin+Resistance%2C+Dyslipidemia+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).</li>
<li>Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+link+between+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome.</a> Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).</li>
<li>Vieira-Potter, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+macrophage+modulation+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues.</a> Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation+%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+at+the+fork+in+the+road+to+health+or+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages at the fork in the road to health or disease.</a> Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).</li>
<li>Italiani, P., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+monocytes+to+M1%2FM2+macrophages%3A+Phenotypical+vs.+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation.</a> Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).</li>
<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+remodeling+of+white+adipose+tissue+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).</li>
<li>Fujisaka, S., Usui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+for+Adipose+Tissue+M1+and+M2+Macrophages+in+Diet+Induced+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice.</a> Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotipic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Qureshi, K., Abrams, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+of+obesity+and+role+of+adipose+tissue+in+the+pathogenesis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).</li>
<li>Bedossa, P., Paradis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+extracellular+matrix+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver extracellular matrix in health and disease.</a> J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).</li>
<li>Tilg, H., Moschen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammation+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+The+multiple+parallel+hits+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis.</a> Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).</li>
<li>Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+Biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+atherosclerosis+and+the+vascular+endothelium%3A+mechanisms+of+reduced+nitric+oxide+bioavailability+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obesity%22%5BJournal%5D)">Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans.</a> Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).</li>
<li>Mestas, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis.</a> Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/ni/journal/v14/n10/full/ni.2705.html">Tissue-resident macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+Identification%2C+and+Excision+of+Murine+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots.</a> J Vis Exp. (94), e52174(2014).</li>
<li>Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://munin.uit.no/handle/10037/4575">http://munin.uit.no/handle/10037/4575</a> 1-10 (2012).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. <a target="_blank" href="http://www.aidic.it/cet/14/38/042.pdf">Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II.</a> Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).</li>
<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Free+Brown+and+White+Fat+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Isolation of Free Brown and White Fat Cells.</a> Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).</li>
<li>Seglen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yu, S., Allen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity%2C+Atherosclerosis%2C+and+Hepatosteatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+%26%2334%3BM2c%26%2334%3B+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires &#34;M2c&#34; polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).</li>
<li>Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+markers+to+delineate+murine+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages.</a> PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).</li>
<li>Rőszer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mysterious+M2+Macrophage+through+Activation+Markers+and+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms.</a> Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).</li>
<li>Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24480353">Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages.</a> Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).</li>
<li>Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+Flow+Cytometry%3A+A+Practical+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13(2014).</li>
<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen belangenconflict openbaar te maken.

Dieet-geïnduceerde stofwisselingsziekte modellen die co morbiditeit zoals atherosclerose, eenvoudige steatosis, steatohepatitis nabootsen en diabetes type 2 worden uitgebreid gebruikt voor een beter begrip van de moleculaire mechanismen van progressie van de ziekte. Collagenase afhankelijke spijsvertering wordt vaak gebruikt om weefsels te bevrijden van de cellen van de extracellulaire matrix (ECM)16,27te distantiëren. Enzymen zoals collagenase verstoren collagee...

Muismodellen zijn uitvoerig gebruikt om de dynamiek van ziekten bij de mens te bestuderen. Goede isolatie van resident weefselcellen van muizen in een zieke toestand kan een platform bieden voor het begrip van de moleculaire en cellulaire bijdragen aan de pathogenese van een ziekte1. Een stoornis die is van cruciaal belang is obesitas. De incidentie van obesitas blijft stijgen wereldwijd parallel met insulineresistentie en type 2 diabetes mellitus, hart-en vaatziekten en vette lever ziekte2,3. Overmatige consumptie van nutriënten is verder vertekend door verminderde fysieke activiteit triggering veranderde signalen afkomstig van vetweefsel, die de cellulaire omgeving van andere perifere weefsels zoals de aorta en de lever4 veranderen kan. Dergelijke verstoring van metabole homeostase resulteert in een chronische lage rang systemische ontsteking5.
Klassieke activering van macrofagen ingezetene aan de aorta en lever evenals hun aanwerving aan witte adipeus weefsel (WAT) heeft aangetoond dat niet alleen initiëren disregulatie van metabole signalen maar ook ondersteunen ontsteking6,7. De fenotypische en functionele heterogeniteit van macrofagen is sterk geassocieerd met de pathogenese van obesitas gerelateerde co-morbiditeit7. De dynamische plasticiteit in macrofaag polarisatie voorziet in deze cellen te exposeren een aantal geactiveerde fenotypen die de progressie coördineren en resolutie van ontsteking8. Terwijl klassiek geactiveerd (M1) macrofagen zijn betrokken bij de verspreiding van de ontsteking, zijn als alternatief geactiveerd (M2) macrofagen geassocieerd met resolutie en weefsel reparatie9,10.
Als het lichaam metabole stress ondergaat, witte vetweefsel abnormaal worden bij elkaar opgeteld. De uitgebreide adipeus weefsel aantrekt en behoudt ontstekingscellen die normale adipocyte functie ter bevordering van insulineresistentie, hyperglycemie en uiteindelijk diabetes mellitus type 2, insulineresistentie of hyperglykemie11, ingrijpend te veranderen 12. Parallel, witte vetweefsel vernieuwt in reactie op inflammatoire signalen vrijgegeven door geïnfiltreerd klassiek geactiveerd (M1) adipeus weefsel macrofagen (geldautomaten)13,14. Deze multi-cellulaire orgel oefent een cascade van signalen die de normale functie van andere lichaamsorganen zoals de aorta en de lever4ontspoort.
De lever is een metabole powerhouse dat zich aanpast in reactie op prikkels afkomstig van de nabijgelegen dysregulated WAT15. Hepatische macrofagen of Kupffer cellen, in reactie op metabolische veranderingen, afscheiden van inflammatoire cytokines die transformeren van beide parenchymal en niet-parenchymal cel fenotype en bevordering van de weefsel remodeling. Hepatische lipide accumulatie, ontsteking, overmatige extracellulaire matrix deposito's, necrose en uiteindelijke functie verlies volgt de inflammatoire beledigingen bij te dragen tot het brede spectrum van leverschade gekoppeld aan non-alcoholische vette leverziekte 16,17,18.
Parallel aan gecompromitteerde WAT en leverfunctie accumuleren grote arteriën lipiden binnen de arteriële muur als het lichaam chronische metabole stress19 ondergaat. Arteriële lipide accumulatie activeert de secretie van chemokines door geactiveerde endotheliale cellen en latere indienstneming van monocyten20. Zodra aangeworven, monocyten vermenigvuldigen, onderscheiden, inslikken lipoproteïnen en schuim cellen. Atherogenese is gestart en wordt ondersteund door de pro-inflammatoire activiteit van aangeworven en weefsel resident lipide-beladen macrofagen. Bezwijken aan de extracellulaire en intracellulaire stress signalen doorgegeven in dit atherogene communicatie, deelnemen deze macrofagen vervolgens aan een apoptotic cascade signalering. Als deze schuim cellen sterven, dragen zij hun lipide gevuld inhoud aan de necrotische kern van de laesie, wat vervolgens tot plaque breuk, hartinfarct en beroerte leidt.
De heterogeniteit van de macrofaag fenotypen regisseert collectief, gedeeltelijk de obesitas geïnduceerd door ontstekingsreactie waargenomen in dysregulated weefsels zoals WAT, lever en aorta8,21. Karakterisering van aangeworven en weefsel resident macrofagen kunnen inzicht geven in mogelijke moleculaire doelwitten die macrofaag fenotype1 manipuleren. Effectief karakteriseren macrofagen van obesitas-geïnduceerde ontstoken weefsels, kan een eencellige schorsing verkregen worden door enzymatische spijsvertering. Dergelijke dissociatie protocollen moet effectief in voldoende vernederende bindweefsel terwijl het minimaliseren van immuun celdood en bieden optimale cel opbrengst. Het enzym mengsel is afhankelijk van het soort weefsel en de structurele make-up. Veerkrachtig weefsel zoals de aorta vereist sterkere enzymatische activiteit, in vergelijking met de lever en WAT, om weefsel dissociatie. Uit de eencellige suspensie, kunnen het weefsel resident macrofagen ondubbelzinnig worden gekenmerkt of geïsoleerd voor verder stroomafwaarts analyses uitgevoerd, zoals transcriptionele profilering.
Hier wordt een weefsel-specifieke protocol beschreven dat collagenase-afhankelijke weefsel spijsvertering en polychromatische stroom cytometry gebruikt om effectief te isoleren en karakteriseren van weefsel-ingezeten macrofagen verkregen uit traditionele dieet geïnduceerde obesitas, atherosclerose, eenvoudige steatosis en steatohepatitis Muismodellen. Gelijktijdige kleuring van oppervlakte markeringen in een cel met antilichamen tegen leukocyten-(CD45 en/of CD11b) en macrofaag - specifieke antigenen (F4/80) wordt vaak gebruikt om te identificeren macrofaag populaties22. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) is een krachtige strategie gebruikt voor het sorteren van deze geïdentificeerde risicopopulaties hoge zuiverheid. De gesorteerde bevolking kan vervolgens worden geëvalueerd voor fenotype specifiek gen profielen met behulp van downstream moleculaire analyse (zoals kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie)23. Hoewel de standaard stroom cytometry en stroom cytometry gebaseerde cel Sorteren krachtige hulpmiddelen macrofagen binnen een sterk heterogene celsuspensie onderscheid aan te brengen zijn, moeten de voormalige protocollen worden geoptimaliseerd zodat succesvolle uitvoer. In deze studie worden protocollen dat effectief isoleren en karakteriseren van levensvatbare weefsel specifieke macrofagen beschreven; wat nog belangrijker is, biedt deze studie cruciaal inzicht in technische kwesties die vaak ontstaan, evenals strategieën van de proactieve en oplossen van problemen te voorkomen en/of lossen ze.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 in Needles</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Gebaat voor canulering van subhepatisch IVC tijdens leverperfusie</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 in. Needles</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit met rubberen stoppen</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spuiten</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD16/32 Fc Block&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Armenian Hamster IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Rat IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfaat Buffered Saline (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 μm celzeef</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube&nbsp;</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Gebaat voor algemene dissectiedoeleinden</td></tr><tr><td>Micro Forceps, 4 inches, volledige curve, 0.8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>Gebaat voor algemene dissectiedoeleinden</td></tr><tr><td>Spring dissection scissors – 3 mm Snijrand&nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Gebaat voor aorta dissectie Stappen 1.3.3.17 tot 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Gebogen 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>11297-10</td><td>Gebaat voor aorta dissectie Stappen 1.3.3.17 tot 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps (gebogen)</td><td>Fine Science Tool</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natriumzout</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Celkweek/Petri schotels</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen Petri schotels (10 cm) met deksel</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Kegelvormige Centrifugebuizen (Polypropyleen)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Kegelvormige Centrifugebuizen&nbsp;(Polypropyleen)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Ronde Bodem Polystyreen Buizen&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Gedenatureerd, Anyhydrous)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Rundserum Albumine</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL beker&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Hemostatic clamp</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Getande pincet</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 μm Wegwerpfilters</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride Kalium (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp;</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Scheermessen (0.22 mm (0.009"))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Live/Dead kleurstof</td><td></td><td></td><td>Rode levensvatbaarheidskleurstof (in Figuur 1A)</td></tr></tbody></table>

isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesitas bevordert een chronische inflammatoire staat die is grotendeels gemedieerd door weefsel-ingezeten macrofagen evenals monocyt-afgeleide macrofagen. Dieet-geïnduceerde obesitas (DIO) is een waardevol model bij het bestuderen van de rol van macrofaag heterogeniteit; voldoende macrofaag isolatie zijn echter moeilijk te verwerven van ontstoken weefsels. In dit protocol, duidelijk naar voren komt de isolatie stappen en de nodige richtlijnen voor troubleshooting afgeleid van onze studies voor het verkrijgen van een geschikt bevolking van weefsel-ingezeten macrofagen van muizen na 18 weken van hoog-vet (HFD) of hoog-vet/hoog-cholesterol) HFHCD) dieet interventie. Dit protocol is gericht op drie hallmark weefsels in zwaarlijvigheid en atherosclerose, met inbegrip van de lever en wit vetweefsel (WAT) de aorta bestudeerd. We benadrukken hoe dualistische gebruik van stroom cytometry kan bereiken een nieuwe dimensie van isolatie en karakterisatie van weefsel-ingezeten macrofagen. Een fundamentele deel van dit protocol adressen de fijne kneepjes onderliggende weefsel-specifieke enzymatische spijsvertering en macrofaag isolatie en latere celoppervlak antilichaam kleuring voor flow cytometrische analyse. Dit protocol adressen bestaande complexiteit onderliggende TL-activated cell sorting (FACS) en presenteert deze complexe situatie teneinde de karakterisering van de breed scala van voldoende gesorteerde cel populaties verduidelijkingen. Verrijking van de alternatieve methoden zijn opgenomen voor het sorteren van de cellen, zoals de dichte lever, waardoor flexibiliteit en time management bij het werken met FACS. Kortom, dit protocol helpt de onderzoeker te evalueren macrofaag heterogeniteit uit een veelheid van ontstoken weefsels in een bepaalde studie en biedt inzichtelijke tips voor probleemoplossing die zijn geslaagd voor gunstige cellulaire isolatie en karakterisatie van immuuncellen in DIO-gemedieerde ontsteking.

Bij het gebruik van apolipoproteïne E gebrekkige (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) muizen gehandhaafd op een hoog vet hoog cholesterol dieet (HCHFD of HCD) 18 weken, 1 x 104 - 2 x 104 CD45+F4/80+ aorta macrofagen kunnen worden geïsoleerd wanneer twee steekproeven behoren gebundeld. Levers van HFHCD-gevoed ApoE KO muizen, ontleed geproduceerd groter is dan 5 x 105 gesorteerd op Kupffer cellen (die afhankelijk van beschikbare sorteren tijd). Wann...

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Het algemene doel van deze procedure is om effectief macrofagen te isoleren en te karakteriseren uit weefsels die vaak worden getroffen door dieet-geïnduceerde ontsteking, zoals de lever. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de velden van immunologie en ontsteking over hoe het fenotype van weefselresidenten macrofagen het verloop van chronische ontstekingsziekten kan bepalen. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat de procedure de isolatiestappen optimaliseert die nodig zijn voor het verkrijgen van enkelcel-suspensies afgeleid van weefsels die zijn beïnvloed door obesitas-gemedieerde chronische laaggradige ontsteking.De procedure wordt gedemonstreerd door Joselyn Allen, een promovendus uit mijn laboratorium. Om de lever te isoleren, plaats je eerst een met ethanol gedrenkte muis in rugligging op een dissectieplank van polystyreen schuim en fixeer je de voor- en achterpoten. Gebruik vervolgens een pincet met een medium punt om de abdominale huid nabij de urethraopening vast te pakken en maak met scherpe dissectieschaaren een kleine incisie in de opgetilde huid.Steek het onderste blad van de schaar in de incisie tussen de huid en het peritoneum en maak een laterale incisie van de lies tot aan de kin. Trek de huid voorzichtig terug om de intacte peritoneumholte en de thoraxwand bloot te leggen en maak een laterale incisie door het peritoneum. Til het sternum op en incideer voorzichtig het diafragma.Verschuif vervolgens de maagdarmorganen naar de zijkant en localizeer de subhepatische vena cava inferior of IVC. Klem met hemostatische forceps de suprahepatische IVC af om een gelokaliseerde perfusie te behouden en bevestig een spuit gevuld met voorverwarmde perfusiebuffer aan een bloedafname- en infusieset met een 23 gauge naald. Druk voorzichtig op de zuiger totdat de slang en de naald gevuld zijn met perfusiebuffer en voer de naald parallel aan de subhepatische IVC in.Correcte canulatie van de IVC zorgt ervoor dat de dissociatiebuffer lokaal door de lever en perifere weefsels wordt verspreid, waardoor de weefseldigestie wordt geoptimaliseerd. Gebruik een hemostatische klem van vier centimeter om de naald op zijn plaats te fixeren en druk voorzichtig op de zuiger om de perfusie te starten. Als de naald correct is geplaatst, zal de kleur snel uit de lever verdwijnen en zullen de lobben groter worden.Snijd prompt de poortader door om de perfusiebuffer vrij door de lever te laten stromen, waarbij de lobben af en toe voorzichtig tussen duim en wijsvinger worden gemasseerd om de verwijdering van het bloed te vergemakkelijken. Wanneer er nog slechts vijf milliliter perfusiebuffer over is, wordt de spuit met perfusiebuffer vervangen door een spuit gevuld met voorverwarmde dissociatiebuffer; ga door met het voorzichtig masseren van de lobben en het perfunderen van de lever totdat deze volledig is verteerd. Bevestig een succesvolle digestie door de stompe zijde van een pincet voorzichtig in de linker laterale lob te drukken.Er moet een inkeping op het oppervlak verschijnen die langzaam weer opvult zodra de pincet wordt verwijderd. Verwijder vervolgens de naald en gebruik een kort recht blad van een dissectieschaar om voorzichtig door de verbindende ligamenten te snijden om de gehele lever en de galblaas te excideren. Breng de lever over naar een schaal van 10 centimeter met 10 milliliter ijskoud DMEM en gebruik een gekartelde pincet om de doorgesneden suprahepatische IVC vast te pakken.Gebruik een pincet met een medium punt en maak een snelle strijkende beweging over elke lob om de cellen uit het kapsel van Glisson los te maken, en breng het verzadigde DMEM via een 70 micrometer cell strainer over in een 50 milliliter conische buis op ijs. Hoge opbrengsten van levensvatbare cellen kunnen alleen worden bereikt door de levercellen correct te dissociëren van het kapsel van Glisson. Wanneer alle cellen zijn verzameld, keer dan de buis om om de celsuspensie voorzichtig te mengen en pellet de cellen door centrifugatie.Breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter voor drie extra centrifugaties op lage snelheid. Na de laatste centrifugatie wordt het supernatant overgebracht naar een nieuwe buis van 50 milliliter en worden de cellen nogmaals gecentrifugeerd bij een hogere snelheid. Resuspendeer vervolgens de pellet van niet-parenchymale cellen in FACS-buffer voor het tellen en verdun de levercellen tot de juiste concentratie, afhankelijk van de daaropvolgende toepassing, in gelabelde polystyreen buisjes met een ronde bodem van vijf milliliter.Muizen die een vetrijk dieet of een dieet met een hoog vet- en cholesterolgehalte kregen, vertonen een verhoogde infiltratie van klassiek geactiveerde M1-macrofagen in aangetaste weefsels zoals de aorta. RON-receptor-expresserende aortische CD45-positieve F4/80-positieve macrofagen, die een anti-inflammatoir fenotype vertonen, zijn verminderd bij muizen die een dieet met een hoog vet- en cholesterolgehalte kregen, terwijl pro-inflammatoire CD45-positieve F4/80-positieve CD11c-positieve macrofagen in verhoogde aantallen worden aangetroffen in aorta's die uit deze dieren zijn geïsoleerd. Bovendien vertonen gesorteerde RON-receptor-expresserende macrofagen, afkomstig uit gedigesteerde aorta's, een verhoogde expressie van het Arginase 1-gen, een goed vastgestelde M2-macrofaagmarker.Inderdaad, de karakterisering van lever-residente macrofagen onthult het overheersende fenotype van RON-receptor-expresserende subpopulaties met CD11c-positieve pro-inflammatoire macrofaagpopulaties, waarbij een verminderde expressie van genen wordt aangetoond die sterk geassocieerd zijn met het anti-inflammatoire M2-fenotype. Vergelijkbare trends worden waargenomen in de macrofaagpopulaties die zijn geïsoleerd uit gedigesteerd wit vetweefsel, waarbij macrofaagpopulaties met een pro-inflammatoir fenotype een verminderde oppervlakte-expressie van de RON-receptor vertonen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in 20 tot 30 minuten per dier worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals flowcytometrie, fluorescentie-geactiveerde celsortering en/of kwantitatieve PCR worden uitgevoerd om het fenotype van de geïsoleerde leverafgeleide weefselresidente macrofagen verder te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u weefselresidente macrofagen correct kunt isoleren uit zieke levers. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

Vetweefsel (AT) is een site van intense immuun cel activatie en interactie. Vrijwel alle cellen van het immuunsysteem aanwezig zijn in AT en hun verhoudingen worden veranderd door obesitas. Goede isolatie, kwantificering en karakterisering van AT immuuncelpopulaties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van hun rol in immunometabolic ziekte.

Isolatie van Vetweefsel immuuncellen

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Macrofagen zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij de pathogeniteit van de gastheer. Macrofagen vertonen fenotypische en functionele diversiteit die kan worden geanalyseerd en gedetecteerd door middel van proteomische analyse. Dit artikel beschrijft hoe je 2D-elektroforese uitvoert van primaire culturen van humane macrofagen die zijn gedifferentieerd in M1- of M2-fenotype.

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Leer macrofagen isoleren en karakteriseren uit leverweefsel bij metabole ontsteking. Deze methode optimaliseert enkelcelopbrengst voor immunologisch onderzoek naar chronische ziekten.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Meer video's verkennen