Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in eiwitfunctie en het algemene doel van Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry is om snelle structurele veranderingen te onderzoeken die functie aansturen in geordende en ongeordende eiwitten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van structurele biologie, zoals de craterisatie van tijdelijke eiwitbevestigingen, wat niet mogelijk is met minimale tot klassieke hoge resolutietechnieken zoals elektrocistografie en NMR. Het grote voordeel van deze techniek is dat reacties kunnen worden gemonitord op milliseconden tijdschaal, wat belangrijk is voor het karakteriseren van lusruggen, Moltinglobyals en intrinsiek ongeordende eiwitten.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van neurodegeneratieve aandoeningen. Aangezien deze vaak betrekking hebben op het verkeerde vouwen of aggregatie van intrinsiek ongeordende eiwitregio's. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in wekelijks gestructureerde eiwitten, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals enzymen die katalytische omzetting ondergaan, of de karakterisering van eiwit-, eiwit- en eiwit-liganinteracties.

Om deze procedure te starten, graveert u een plaat door een invoerkanaal voor het introduceren van de reagentia, een pro dialysekamer en een uitvoerkanaal, op een standaard PMM8-blok, met behulp van een lasergraveerder. Snijd vervolgens een 30 gauge roestvrijstalen metalen capillair in twee stukken van 10 centimeter met behulp van een rotatiegereedschap voor de 164e inch dikke afsnijdschijf. Gebruik schuurpapier om het uiteinde van de capillairen glad te maken, wat kan worden vergemakkelijkt door onder een lichtmicroscoop te kijken.

Smelt nu die capillairen in het geëtste PMM8-blok met behulp van een sauntering iron. Om een continue stroom, tijdsafhankelijke kinetische menger te construeren, plaatst u een 40 centimeter gefuseerde cilica glas capillair in een 28 gauge, stalen, metalen capillair van ongeveer 15 centimeter. Produceer vervolgens een twee millimeter inkeping, met behulp van laagvermogen lasergraveerinstellingen aan één uiteinde van de binnenste glas capillair en verzegel dit uiteinde van de binnenste glas capillair.

Dit is een kritische stap die orthogonaal en efficiënt mengen van het eiwit verzekert, dat uittreedt door de inkeping met een gemeenschappelijke deterior. De twee millimeter inter capillaire ruimte tussen de inkeping en het uiteinde van de capillair is de mix en het volume. Bevestig geschikte maat fittingen en buishulzen en integreer een T-connector, die zal worden gebruikt om deterium af te leveren.

Lijn vervolgens de binnenste glas capillair uit met het uiteinde van de metalen capillair, wat kan worden vergemakkelijkt door onder een lichtmicroscoop te kijken. Markeer dit als de nul millimeter positie. Bevestig deze kinetische menger aan het ene uiteinde van de meng-T. Bevestig vervolgens een 40 centimeter gefuseerd silica glas capillair aan het andere uiteinde van de kinetische menger op de meng-T. Voor pepsine activering, suspendeert u 20 milligram pepsine uit Porsena gassische mucosa in één milliliter koppelingsbuffer.

Voeg 50 milligram NHS geactiveerde agrosnelheden toe aan de gesuspendeerde proteïnen en roteren voorzichtig gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Op de volgende dag, centrifugeer de mengsel bij duizend keer G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur om de hars te verzamelen. Aspibeer vervolgens de ongebonden proteïnen.

Volgend hierop, incubeer de agro's in één milliliter blokkeringsbuffer en roteren voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende één uur. Na het verzamelen van de hars en het aspireren van de blokkeringsbuffer, incubeer de pepsine aggres met één milliliter vijf procent acetische zuur gedurende vijf minuten. Centrifugeer de mengsel bij 1.000 keer G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur om de hars te verzamelen, aspibeer vervolgens het supernatent.

Na het herhalen van de vorige stappen, voor een totaal van drie wasbeurten, bewaar de kralen in één milliliter acetisch zuur bij vier graden Celsius voor langdurig gebruik. Om het apparaat te assembleren, vul een protialysekamer met een suspensie van geactiveerde pepsine aggres kralen in vijf procent acetisch zuur met behulp van een steriele spatel. Plaats de PMMA micro falitic platform tussen twee lege PMMA blokken als een deksel om het apparaat te verzegelen, bekleed met siliconenrubber om een vloeistofdichte verzegeling te creëren.

Gebruik metalen klemplaten om het apparaat onder druk te verzegelen. Bevestig vervolgens de meng-T, aan de ingang van het apparaat met behulp van geschikte fittingen. Laat nu vijf procent acetisch zuur door de zuurlijn stromen met een snelheid van tien microliters per minuut.

Laat vervolgens 50 millimeter ammoniak zuur buffer door de eiwitlijn stromen met een snelheid van één microliter per minuut. Koppel het apparaat aan de voorkant van een gemodificeerde, quadrapole time of flight, of Qtof massaspectrometer, met behulp van een instelbare geïsoleerde trap om optimale elektrospraycondities te bereiken. Na het instellen van de ESI-MS-condities, verwerft u een pepsine-alleenspectrum.

Introduceer vervolgens 50 tot 100 micromoler van tau, of fosfo-tau-eiwit met een snelheid van één microliter per minuut, waar de 50 millimeter ammoniumacetaatbuffer eerder stroomde. Laat het systeem minimaal 10 minuten gelijkwaardig worden voordat het verwerven, verwerft u eiwit-alleenspectrum. Terwijl de Tao, of fosfo tao-eiwit stroomt, introduceert u duteriumoxide met een snelheid van drie microliters per minuut, via de T-connector, en laat het reageren in de kinetische menger.

Om de markeringstijd te verhogen, trekt u handmatig de positie van de binnenste glas capillair terug om mengtijd van 42 milliseconden tot acht seconden te bereiken, waardoor het systeem minimaal 10 seconden tussen elke terugtrekking kan gelijkwaardig worden. Deze animatie toont de workflow voor een typisch experiment. Eiwit treedt uit door de inkeping en mengt met het binnenkomende duterium.

Backbone M8 waterstof wordt uitgewisseld tijdens de toegewezen reactietijd, die kan worden gevarieerd door de eiwit