Name: Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium exchange massaspectrometrie voor het bestuderen van eiwitstructuur en -dynamica. Deze methode maakt monitoring van milliseconde-reacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Markus Zweckstetter voor het verstrekken van het pdb-coördinatenbestand voor het 'native' tau-ensemble dat werd voorspeld op basis van zijn NMR-werk, met bijdragende analysetools die werden verstrekt door Dr. Adnan Sljoka. Financiering voor dit werk werd verstrekt door het Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant-programma.

LET OP: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Dampen door laserablatie van poly (methylmethacrylaat) (PMMA) kunnen giftig zijn. Zorg ervoor dat de laser graveur is aangesloten op een werkend ventilatiesysteem. Gebruik alle passende veiligheidsmaatregelen in acht bij het bouwen van de microfluïdische apparaat inclusief het gebruik van technische controles (zuurkast, slijpsel container) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, gezichtsmasker, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen). Het is van groot belang voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) rang reagentia te wenden, met welzijn van ACS kwaliteit of hoger om storende verontreinigingen te verminderen tijdens de analyse. 1. Bereiding van de microfluïdische inrichting <ol><li> De bouw van de PMMA microfluïdische Platform <ol><li> Verkrijgen van een standaard PMMA blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) en laser ablateren een ingangskanaal voor het inbrengen van de reagentia, een Proteolysis kamer, en een uitgangskanaal via een lasergraveerder 17, 18. OPMERKING: Ets de proteolyse kamer in een langwerpige ovale vorm (30 x 5 x 0,05 mm). De ingangs- en uitgangskanaal moeten doorlopen tot het einde van de PMMA blok en niet groter dan 75 pm zowel breedte en diepte om een ​​30 GA capillair tegemoet. </li><li> Snijd een 30 GA, roestvrijstalen capillaire in twee stukken van ongeveer 10 cm elk een roterend gereedschap met een 1/64&quot; dik cut-off disc. Gebruik schuurpapier aan de einden van de capillairen (dit kan worden vergemakkelijkt door het bekijken onder een glad lichte microscoop). </li><li> Smelt de capillairen in de geëtste poly (methylmethacrylaat) blok met behulp van een soldeerbout. Het ingangskanaal wordt verbonden met automatische spuitpompen en het uitgangskanaal wordt gebruikt voor het koppelen naar het MS. </li></ol></li><li> De bouw van de doorstroom Tijdsgeresolveerde Kinetic Mixer <ol><li> Het verkrijgen van een gefuseerdesilicaglas capillair (ID: 75 urn, OD: 150 um) van ongeveer 40 cm, en plaats deze in een 28 GA, roestvrijstalen capillair van ongeveer 15 cm. Afhankelijk van de reactietijd vereist, gebruik een langere buitenste metalen capillair of een met een grotere binnendiameter. Opmerking: Het bepalen van de &#39;echte&#39; binnendiameter van de metalen capillaire kritisch is voor het verkrijgen van nauwkeurige reactietijden. Dit kan door het aanbrengen van de metalen capillair een HPLC, vloeiend oplosmiddel hoewel de capillair en het opnemen van de tegendruk. Een tegendruk berekening binnendiameter kan worden gemaakt, en de werkelijke binnendiameter van het capillair metaal bepaald. Dit kan worden berekend met behulp van de Moleculair gewicht Calculator software (voor Windows versie 6.49). </li><li> Maak een 2 mm inkeping behulp laagvermogen lasergraveur instellingen aan één uiteinde van de binnenste glazen capillair en sluit het uiteinde van de binnenste glazen capillair (figuur 2). Als alternatief maakt de inkeping met behulp van een keramische capillairy frees of een roterende molen met een fijne snijblad. </li><li> Opstelling de binnenste glazen capillair met een uiteinde van de metalen capillaire (dit kan worden bevorderd door het bekijken onder een lichtmicroscoop). </li><li> Bevestig deze kinetische menger om een uiteinde van de meng T (figuur 2). </li><li> Bevestig een kwartsglas capillaire (ID: 75 urn, OD: 150 um) van ongeveer 40 cm aan het andere uiteinde van de kinetische mixer op het meng T-stuk. Dit wordt gebruikt om zuur (5% azijnzuur, pH 2,4) te leveren aan de reactie te blussen. OPMERKING: Reactanten worden aan de inrichting met gasdichte spuiten met polytetrafluorethyleen (PTFE) buis met geautomatiseerde infuuspompen. </li></ol></li><li> Pepsin Activation <ol><li> Weeg 20 mg pepsine van het varken maagslijmvlies en suspendeer in 1 ml koppelingsbuffer (0,1 M natriumfosfaat, 0,15 M NaCl, pH 6,0). </li><li> Weeg 50 mg N-hydroxysuccinimide (NHS)-geactiveerde agarose kralen, toevoegen re-suspended protease en draai overnacht voorzichtig bij 4 ° C. </li><li> Spin down bij 1.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur aan de hars te verzamelen. </li><li> Zuig het ongebonden protease. </li><li> Incubeer de agarose in 1 ml blokkerende buffer (1 M Tris-HCl, pH 6,0) en draai voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Spin down bij 1.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur aan de hars te verzamelen. </li><li> Zuig het blokkeerbuffer. </li><li> Incubeer de pepsine-agarose met 1 ml 5% azijnzuur, pH 2,4 gedurende 5 minuten. </li><li> Spin down bij 1.000 xg gedurende 2 minuten om de hars te verzamelen. </li><li> Zuig het supernatant. </li><li> Herhaal stap 1.3.8 - 1.3.10 voor een totaal van drie wasbeurten. </li><li> Bewaar de kralen in 1 ml azijnzuur bij 4 ° C gedurende langdurig gebruik. </li></ol></li><li> Device Assembly <ol><li> Vul het proteolyse kamer met de suspensie van geactiveerde pepsine-agarose kralen in 5% azijnzuur met een steriele spatel. </li><li> Plaats de PMMA microfluïdische platform tussen twee lege blokken PMMA als deksel om de inrichting af te dichten, bekleed met siliconenrubber om een ​​vloeistofdichte afdichting te creëren. </li><li> Gebruik van metalen klemplaten druk-afdichting het apparaat. OPMERKING: De klem is op maat gemaakt om de microfluïdische platform passen en bestaat uit twee platen meten 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. </li><li> Flow 5% azijnzuur, pH 2,4 met een snelheid van 10 pl / min. Flow 50 mM ammonium acetaat buffer (pH 6,9) hoewel het eiwit regel in een hoeveelheid van 1 pl / min. Opmerking: Het is uiterst belangrijk dat het azijnzuur continu stroomt door de inrichting gedurende het geheel van het experiment. Er mogen geen lekkages zijn en fluïdum alleen verlaten van het uitgangskanaal, dat als ESI bron dient. </li><li> Koppelen van de inrichting aan de voorzijde van een gewijzigde quadrupool time-of-flight (Q-TOF) massaspectrometer via instelbare geïsoleerde stadium electrospray optimale omstandigheden te bereiken. LET OP: Een bypassschakelaarwordt ingevoerd om de aanwezigheid van een commerciële bron ESI simuleren. 17 </li></ol></li></ol> 2. Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange <ol><li> Overname van Pepsine en Protein Alleen Spectra OPMERKING: ESI-MS verwerving uitgevoerd in positieve ion modus uitgevoerd met een spanning van 4500-5000, 60 V declustering potentieel en 250 V scherpstellen potentiaal. Spectra worden verworven over een bereik van 350-1,500 m / z met een scansnelheid van 1 s-1. <ol><li> Het verwerven van een pepsine alleen spectrum. Pieken te zien zijn in dit spectrum worden afgetrokken wanneer het eiwit wordt toegevoegd. </li><li> 50-100 pM tau / fosfo-tau-eiwit (zuiveren en bereiden zoals eerder beschreven 13, 19) met een snelheid van 1 ul / min waarbij de 50 mM ammoniumacetaat buffer eerder stroomde. </li><li> Het verwerven van een eiwit alleen spectrum. </li></ol></li><li> acquisitie of Time Points <ol><li> Terwijl 100 pM tau / fosfo-tau-eiwit stroomt 1 uL / min, introduceren D2O met een snelheid van 3 pl / min via een T-connector en laten reageren in kinetische mixer. Mogelijk het systeem in evenwicht komen gedurende ten minste 10 minuten voor overname van het spectrum. OPMERKING: Na de uitwisseling etikettering reactie wordt gedoofd door de stroom van azijnzuur pH 2,4 bij 10 pl / min en digestie van het gelabelde eiwit optreedt in het proteolytische kamer. </li><li> Om de kenmerken te verhogen, handmatig trek de positie van de binnenste glazen capillaire bereiken mengtijden van 42 ms tot 8 s. Mogelijk het systeem in evenwicht komen gedurende ten minste 10 minuten tussen elke pull-back. </li></ol></li></ol> 3. De gegevens en statistische analyse <ol><li> Het identificeren van peptiden en berekening van het percentage van deuterium Exchange <ol><li> Voer MS spectra geanalyseerd met behulp van mMass software, versie 5.5.0 20 </sup&gt;. </li><li> Identificeren van peptiden met de ExPASy FindPept proteomische server en bevestigt botsing geïnduceerde dissociatie (CID) indien nodig 21. LET OP: Hier, deuterium opname incorporatie werd gemeten met behulp van een in-house ontwikkelde FORTRAN software voor isotopenverdeling analyse 22, 23. </li><li> Bereken de theoretische intrinsieke gebaseerd zijn op de primaire sequentie met de GEBIED Webhulpmiddel 22, 24. </li><li> Monteer de gegevens met behulp van enkele exponentiële non-lineaire regressie en normaliseren met behulp van een grafische en statistische software (bijv SigmaPlot). OPMERKING: De verhouding k int / k obs geeft de beschermingsfactor (PF), een semi-kwantitatieve maat voor de mate waarin een bepaalde regio is gestructureerd in de conformationele ensemble. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sapienza, P. J., Lee, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+NMR+to+study+fast+dynamics+in+proteins%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).</li>
<li>Neira, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+tool+to+identify+and+characterize+protein+folding+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).</li>
<li>Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+protein+conformers+be+fractionated+by+crystallization%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Can protein conformers be fractionated by crystallization?</a> Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+conformational+landscape+of+a+dynamic+enzyme+by+multitemperature+and+XFEL+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography.</a> eLife. 4, e07574(2015).</li>
<li>Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+uses+of+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and uses of hydrogen exchange.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).</li>
<li>Engen, J. R., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS.</a> Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li>
<li>Wilson, D. J., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Capillary+Mixer+with+Adjustable+Reaction+Chamber+Volume+for+Millisecond+Time-Resolved+Studies+by+Electrospray+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).</li>
<li>Morgan, C. R., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+solution-phase+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom.+RCM%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+intrinsically+disordered+tau+protein+induces+an+amyloidogenic+shift+in+its+conformational+ensemble%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble.</a> PloS One. 10, e0120416(2015).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).</li>
<li>Hilser, V. J., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+calculation+of+the+equilibrium+folding+pathway+of+proteins.+Correlation+with+hydrogen+exchange+protection+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors.</a> J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Protein+Structural+Models+by+Comparison+of+H%2FD+Exchange+MS+Data+with+Exchange+Behavior+Accurately+Predicted+by+DXCOREX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).</li>
<li>Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microfluidic+chip+for+millisecond+time-scale+kinetic+studies+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).</li>
<li>Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+reactor+for+rapid%2C+low-pressure+proteolysis+with+on-chip+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol.+Clifton+NJ%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mMass+3%3A+a+cross-platform+software+environment+for+precise+analysis+of+mass+spectrometric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data.</a> Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Rob, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Dynamics+in+Weakly+Structured+Regions+of+Proteins+Using+Microfluidics-Enabled+Subsecond+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).</li>
<li>Ferguson, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2FDeuterium+Scrambling+during+Quadrupole+Time-of-Flight+MS%2FMS+Analysis+of+a+Zinc-Binding+Protein+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain.</a> Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17, 75-86 (1993).</li>
<li>Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+isoforms%2C+phosphorylation+and+role+in+neurodegenerative+disorders1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1.</a> Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19551977">Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).</li>
<li>Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+discovery+and+development+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review.</a> Anal. Chim. Acta. , (2016).</li>
<li>Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+and+dynamics+of+interchain+cysteine-linked+antibody-drug+conjugates+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+95+kDa+antigen+in+complex+with+antibody+by+solution-phase+amide+backbone+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+monitored+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).</li>
<li>Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+with+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> The Analyst. 128, 623-628 (2003).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+epitope+mapping+using+site-directed+mutagenesis+and+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis.</a> Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).</li>
<li>Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+and+Type+2+scenarios+in+hydrogen+exchange+mass+spectrometry+studies+on+protein-ligand+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes.</a> The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Hoewel structurele biologie werkwijzen, zoals röntgen kristallografie en NMR zijn voordelig omdat zij zeer gedetailleerd structuren van eiwitten, deze beelden vaak statisch. De karakterisering van voorbijgaande soorten en zwak gestructureerde domeinen blijft ongrijpbaar wanneer onderzocht door deze conventionele werkwijzen. Daarom, met het oog op dynamische inzichten over dit soort systemen te krijgen is het belangrijk om te werken aan een snelle tijdschalen. We hebben met succes Tresi-HDX-MS toegepast op gedetailleerde...

In de afgelopen jaren zijn aanzienlijke vooruitgangen geboekt bij de ontwikkeling van analytische technieken ter eiwitstructuur en dynamica 1, 2, 3, 4 meten. Terwijl röntgenkristallografie blijft het principe voor het bepalen van eiwitstructuur worden hoge concentraties van eiwitten nodig en uitgebreide optimalisering vereist diffractie Kristallen produceren. Eiwitten die moeilijk te kristalliseren zijn, zoals membraangeassocieerd en intrinsiek ontvouwen eiwitten zijn klassiek bestudeerd door waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) NMR 5. Echter, de laatste decennia koppeling van electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) naar HDX is snel aan populariteit 6, 7. Massaspectrometrie biedt een oplossingveel van de beperkingen veroorzaakt door röntgen kristallografie en NMR. Vooral MS zeer gevoelig (nM tot pM concentraties vereist), en er vrijwel geen grens aan eiwitgrootte. Daarnaast is de hoge inschakelduur MS analyse maakt de mogelijkheid bestuderen eiwitten ze enzymatisch omzet, verkeerd vouwen, complexering en andere biologisch relevante processen ondergaan. Deze processen treden vaak op de milliseconde tweede tijdschaal en vereisen snel mengen van reagentia voorafgaand aan analyse. De ontwikkeling van tijdsopgeloste elektrosprayionisatie (Tresi) door Wilson en KONERMANN in 2003 toegestaan ​​reacties te kunnen houden in pseudo-real time door ESI-MS. Hun opstelling opgenomen een capillair mixer met een traploos verstelbare reactiekamer volume 8. De inrichting bestaat uit twee concentrische capillairen, met binnencapillair afgesloten en een inkeping in de zijkant gesneden om voor het mengen in de smalle inter-capillairy ruimte van de inkeping aan het uiteinde van de binnenste capillair (typisch 2 mm). Toegepast op HDX experimenten, de binnencapillair draagt het eiwit van belang, de uitwendige capillaire draagt het etiket D2O oplossing, die vervolgens ondergaat mengen met het eiwit alvorens de instelbare reactiekamer waardoor HDX etiket vóór directe overdracht in de ESI bron. In het kort HDX voert backbone amide waterstoffen ondergaan uitwisseling met deuterium atomen in oplossing 9, 10. De uitwisseling van base gekatalyseerde bij fysiologische pH, met een zuur-katalyse steeds heersende pH beneden ongeveer 2,6. De koers is gebaseerd op vier factoren: pH, temperatuur, oplosmiddel toegankelijkheid en intramoleculaire waterstofbinding. Als de eerste twee factoren gedurende het experiment, de koers, vooral in peptide hoofdketen amide posities constant worden gehouden, primair dependentaan eiwitstructuur 11. Strak gevouwen gebieden met uitgebreide, stabiele waterstofbinding netwerken α-helices en β-sheets zal nemen deuterium in hoofdzaak langzamer vergeleken met lussen en ongeordende gebieden (en soms helemaal niet) 12. Dit maakt globale eiwitanalyse, waarbij verstoringen in structuur (bijv., Na aggregatie of substraatbinding) leiden tot verschillende deuterium opname (figuur 1). De kinetische capillaire menger in een microfluïdisch platform met een proteolytisch kamer voor lokalisatie van het deuterium opname worden opgenomen. Deze proteolytische kamer wordt gehouden bij lage pH om effectief blussen de uitwisselingsreactie en vereist een geïmmobiliseerd zuur protease om het eiwit te verteren in gelokaliseerde peptiden (figuur 2). Monitoring backbone uitwisseling op milliseconde naar tweede tijdschalen is vooral belangrijk voor dekarakterisering van conformationele veranderingen binnen moeilijk lusgebieden gesmolten globules en intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) 13, 14 te karakteriseren. Als alternatief kunnen Tresi-HDX ook worden gebruikt om eiwitten die momenteel een opgelost atoomstructuur door de werkwijzen van röntgenkristallografie en NMR geen kenmerkend gebruik deuterium uitwisseling gekoppeld met de COREX-algoritme (DX-COREX) benadering 15, 16. Deze gedetailleerde protocol Tresi-HDX gelden voor tau, een IDP bestuderen, zowel in het oorspronkelijke vorm, alsmede het pathogene hypergefosforyleerde toestand. Terwijl inheemse tau is een van de meest goed bestudeerd ontheemden, is er weinig bekend over de amyloïdogene tegenhanger 13.

<table><tbody><tr><td>Poly(methyl methacrylate) of PMMA</td><td>Professional Plastics</td><td>SACR.250CCP</td><td>8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm</td></tr><tr><td>Fused Silica Glass Capillaire</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID: 75 &micro;m, OD: 150 &micro;m</td></tr><tr><td>Metal Capillaires</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Buizen</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007&rdquo;, OD: 1/16&rdquo; ID: 0.020&rdquo;, OD: 1/16&rdquo;</td></tr><tr><td>Standaard Polymeer Buizensnijder</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>voor 1/16&rdquo; en 1/8&rdquo; OD buizen</td></tr><tr><td>Micro Statische Menging Tee</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>voor 1/16&rdquo; OD buizen</td></tr><tr><td>of</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen Tee, 0,25&nbsp;mm Boorgat</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>voor 1/16&rdquo; OD buizen</td></tr><tr><td>PEEK Tee voor 1/16&rdquo; OD Buizen</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 Vrouwelijk naar Vrouwelijk Luer</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK Tweekleufmoer</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule voor 1/16&rdquo; OD Buizen</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>100 Series Roterend Gereedschap</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>Afsnijdschijven</td><td>Jobmate</td><td></td><td>1/64&rdquo; dikte</td></tr><tr><td>Stereomaster Digital Zoom Microscoop</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>Solderbout</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser</td><td>Universal Laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuiten</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp;&micro;L capaciteit</td></tr><tr><td>Spuitpompjes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-geactiveerde Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>Pepsine uit Varkensmaagslijmvlies</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Grade Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software/Online Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molecuulgewicht Calculator</td><td></td><td>Versie 6.49</td><td>Open Source MS Tool</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>Versie 5.5.0</td><td>Open Source MS Tool</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>Swiss Institute of Bioinformatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software</td><td>Versie 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml;dinger</td><td>Versie 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Instrumenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium exchange massaspectrometrie voor het bestuderen van protein structure en dynamics

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) zijn lang een uitdaging structurele biologen vanwege hun gebrek aan stabiele secundaire structuurelementen. Waterstof deuterium uitwisseling (HDX) gemeten bij snelle tijdschalen is bij uitstek geschikt voor structuren en waterstofbinding netwerken die kort worden bevolkt detecteren, waardoor de karakterisering van voorbijgaande conformeren in natieve ensembles. Koppeling van HDX aan massaspectrometrie biedt een aantal belangrijke voordelen, waaronder een hoge gevoeligheid, lage monster consumptie en geen beperking op eiwit grootte. Deze techniek is sterk gevorderd in de afgelopen tientallen jaren, inclusief de mogelijkheid om HDX etikettering de gaten te houden op de milliseconde tijdschaal. Bovendien, door het opnemen van de HDX werkstroom naar een microfluïdisch platform behuizing een zuur protease microreactor, kunnen wij dynamische eigenschappen lokaliseren peptideniveau. In deze studie tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie (Tresi-MS) gekoppeld aan HDX was gebruikt om een ​​gedetailleerd beeld van de resterende structuur in het tau-eiwit, alsook de conformationele veranderingen geïnduceerd na hyperfosforylering verschaffen.

Digestie profielen van natieve en fosfo-tau waren vergelijkbaar, hetgeen een sequentie dekking van 77,1 en 71,7% respectievelijk. Deuterium opnamewaarden van elk peptide werd bepaald door het aanpassen van de waargenomen isotopische verdelingen met de theoretische verdelingen gegenereerd met behulp van een intern ontwikkelde FORTRAN software. De best passende verdelingen worden getoond (Figuur 3a) samen met de bijbehorende deuterium opnamewaarden. Opname kinetische profi...

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwitfunctie en het algemene doel van tijd-opgeloste elektro-sprayionisatie waterstof-deuteriumuitwisselingsmassaspectrometrie is het onderzoeken van snelle structurele veranderingen die de functie in geordende en ongeordende eiwitten aansturen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de structurele biologie, zoals de karakterisering van transiënte eiwitconformaties, die niet toegankelijk zijn voor klassieke technieken met een hoge resolutie zoals röntgenkristallografie en NMR. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat reacties op de milliseconde-tijdschaal kunnen worden gemonitord, wat essentieel is voor het karakteriseren van loop-regio's, molybden-clusters en intrinsiek ongeordende eiwitten.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van neurodegeneratieve aandoeningen, aangezien deze vaak gepaard gaan met het misvouwen of aggregeren van intrinsiek ongeordende eiwitregio's. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in zwak gestructureerde eiwitten, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals enzymen die een katalytische omzetting ondergaa

time-resolved-electrospray-ionization-hydrogen-deuterium-exchange

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Leer tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium exchange massaspectrometrie voor het bestuderen van eiwitstructuur en -dynamica. Deze methode maakt monitoring van milliseconde-reacties mogelijk.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics (Video) | JoVE Journal

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Meer video's verkennen