RNA-Seq

RNA-sequencing, of RNA-seq, is een techniek die informatie kan verschaffen over de sequentie en hoeveelheid van elk tot expressie gebracht RNA, bekend als de “transcriptoom,” in een celpopulatie. In tegenstelling tot andere expressieprofileringsmethoden zoals microarrays, die het onderzoeken van bekende RNA-sequenties inhouden, kan RNA-seq het genexpressieprofiel van organismen met niet-gesequencede genomen profileren. Bovendien kan RNA-seq nauwkeurig een groter bereik van transcriptexpressieniveaus meten dan microarrays, vooral bij zeer lage of zeer hoge niveaus.

Deze video behandelt de principes van RNA-seq, een protocol voor het voorbereiden van een RNA-seq-bibliotheek en het analyseren van de data, en enkele toepassingen van deze techniek.

Laten we eerst enkele principes achter RNA-seq bekijken. Transcriptoomsequencing vereist het isoleren van een populatie transcripten waarvan de niveaus gemeten moeten worden. Het meeste RNA in cellen is ribosomale RNA, of rRNA, het centrale onderdeel van de eiwitproductiemachinerie van de cel. Om het herstel van andere soorten transcripten te vergemakkelijken, wordt rRNA meestal verwijderd voorafgaand aan sequencing door het monster te hybridiseren met complementaire oligonucleotiden die aan magnetische kralen zijn bevestigd, en een magneet te gebruiken om de rRNA te scheiden van de rest van het monster.

Alternatief kan een specifieke populatie RNA worden geselecteerd voor sequencing. Bijvoorbeeld, proteïne-coderende boodschapper-RNA's, of mRNA's, kunnen worden gevangen met “oligo-dT”— korte reeksen van deoxy-T nucleotiden die binden aan de sequentie van A-basen bekend als een poly-A-staart aan het einde van deze transcripten. Het besmettende rRNA wordt vervolgens verwijderd. MicroRNA's, die 22-nucleotide regulerende RNA's zijn, kunnen selectief worden geïsoleerd voor sequencing op basis van hun grootte. Omdat RNA inherent gevoelig is voor afbraak, wordt het eerst omgekeerd getranscribeerd naar dubbelstrengs DNA.

Oligonucleotidensequenties die adapters worden genoemd, worden vervolgens aan de DNA-fragmenten gelieerd. De adapters bevatten constante gebieden die dienen als primer-bindplaatsen voor daaropvolgende PCR-amplificatie, en deze zijn meestal asymmetrisch zodat de “strengheid” van de sjabloon wordt behouden. De adapters bevatten ook unieke sequenties, bekend als “barcodes,” die alle fragmenten identificeren die afkomstig zijn uit een enkele monster. De bibliotheek wordt vervolgens geamplificeerd door PCR.

Een sequencing-chip, waarop oligonucleotiden complementair zijn aan de adapters, wordt gebruikt om het bibliotheekmonster te immobiliseren, dat wordt verdund zodat de DNA-moleculen bij lage dichtheid aan de chip binden. Het DNA wordt amplificeerd op de chip via een proces genaamd “brug-amplificatie” om “klonale clusters” te vormen. Korte fragmenten, elk 30-150 basen lang, worden vervolgens gesynthetiseerd van een of beide uiteinden van deze DNA-sjablonen, waardoor honderden miljoenen producten ontstaan die bekend staan als sequencing-reads.

De sequencingresultaten worden vervolgens geanalyseerd op kwaliteit en de data worden verwerkt. Analyse van de sequenties kan een breed scala aan informatie onthullen, inclusief verschillen in expressieniveaus van RNA's tussen monsters en eerder onbekende transcripten of vormen van transcripten.

Nu we hebben gezien hoe RNA-seq werkt, laten we een protocol doornemen voor het voorbereiden van een RNA-seq-bibliotheek en het analyseren van de sequentiedata. RNA wordt eerst verkregen uit het monster van belang, en de kwaliteit wordt gecontroleerd door middel van elektroforese, bijvoorbeeld door gebruik te maken van een microfluidics-apparaat genaamd een bioanalyzer. Het RNA moet van hoge kwaliteit zijn voor nauwkeurige sequencingresultaten. Om de afwezigheid van DNA-besmetting te garanderen, wordt RT-PCR voor een geëxprimeerd gen uitgevoerd met of zonder reverse transcriptase. Er mogen geen producten zijn bij afwezigheid van reverse transcriptase.

Om poly-A RNA te selecteren, worden de monsters gebonden aan oligo-dT sondes die aan magnetische kralen zijn bevestigd. Het geselecteerde RNA wordt gefragmenteerd tot stukken van 200 nucleotiden bij hoge temperatuur in de aanwezigheid van magnesiumionen, waardoor lengteafhankelijke voorkeuren in daaropvolgende reacties en analyses worden verminderd. De fragmenten worden vervolgens omgezet in dubbelstrengs DNA en adapters worden gelieerd. De bibliotheek wordt geamplificeerd door PCR en de kwaliteit ervan wordt gecontroleerd op een bioanalyzer en door qPCR uit te voeren. De bioanalyzerresultaten moeten een piek van producten onthullen bij de grootte die verwacht wordt op basis van de gemiddelde fragmentgrootte en lengte van de adapters.

Bibliotheken uit verschillende monsters, die verschillende barcode-adapters bevatten, kunnen worden gemengd, samen met een monster van referentie-DNA dat in lage concentratie is toegevoegd als kwaliteitscontrole voor volgende stappen van het proces, zoals klonale clustergeneratie en de sequencingreacties. Het mengsel wordt toegevoegd aan een sequencing-chip en geladen in de machine.

Tijdens de sequencingreactie wordt de dichtheid van DNA-clusters gecontroleerd: deze mag niet te hoog zijn, wat kan leiden tot kruisbesmetting, of te laag, wat kan leiden tot onvoldoende data. De kwaliteit van de sequencing wordt gegeven door de Q-score, die de kans aangeeft dat een onjuiste base wordt geïdentificeerd. De Q-scores voor de meeste basen moeten groter zijn dan 30, wat overeenkomt met een kans van minder dan 1 op 1000 voor een onjuiste lezing. Herstel van de referentie-DNA-sequenties met de verwachte snelheid geeft aan dat alle bibliotheeksequenties gelijkmatig vertegenwoordigd zijn.

Reads gegenereerd door sequencing worden vervolgens met elkaar overlappend gelegd om het RNA dat is gesequenced te deduceren. Voor organismen met beschikbare genoominformatie kunnen reads worden uitgelijnd op het referentiegenoom. Het aantal reads per transcript wordt geteld om de abundantie van elk RNA te meten.

Nadat we hebben gezien hoe RNA-seq werkt, laten we een aantal manieren bekijken waarop het wordt gebruikt.