Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Het algemene doel van deze experimentele strategie is om de verschillende functionele complexen waarin een eiwit betrokken kan zijn te onderscheiden via blue native polyacrylamidegelelektroforese-fractionering van affiniteitsgezuiverde eiwitcomplexen en massaspectrometrie-correlatieprofilering. Deze methode kan helpen om organisatorische informatie toe te voegen aan de eiwitlijsten die zijn gegenereerd door affiniteitszuivering-massaspectrometrie-experimenten. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn dat deze eenvoudig uit te voeren is, een goede resolutie heeft en weinig meer arbeid vereist dan conventionele gel CMSMS.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van eiwitcomplexen uit 200 tot 500 miljoen cellen die endogene hoeveelheden van een FLAG-tagged eiwit tot expressie brengen. Voeg na het ontdooien van de celpellet, zoals beschreven in het tekstprotocol, vijf milliliter ijskoud lysisbuffer met DTT en proteaseremmers toe aan de celsuspensie en draai voorzichtig om te mengen. Incubeer de suspensie 10 minuten op ijs.

Breng de celсусpensie over naar een koude homogenisator. Lyseer de cellen met 20 tot 30 slagen met de nauwsluitende stamper totdat er geen merkbare viscositeit meer is, en breng het homogenizaat vervolgens over naar koude microcentrifugebuisjes. Breng na het centrifugeren van de buisjes het geklaarde lysaat over naar een schone koude buis, waarbij ongeveer 50 microliters lysaat wordt achtergelaten.

Bewaar een aliquot van 35 µL lysaat om de proteïneconcentratie te bepalen en de zuivering te monitoren. Verwijder vervolgens de buffer uit de eerder voorbereide beads. Resuspendeer de beads in één milliliter van het lysaat en meng dit daarna met de rest van het lysaat.

Incubeer het mengsel op een draaiend wiel bij 4 °C gedurende één tot twee uur. Verzamel de kraaltjes tegen de zijkant van de buis met een magneet. Neem een aliquot van 30 µL supernatant af en gooi de rest weg.

Resuspendeer de kralen in 0,5 milliliter IPP150-buffer door vier tot zes keer te pipetteren. Draag de suspensie vervolgens over naar een koude buis van 1,5 milliliter. Was de kralen daarna drie keer met 0,5 milliliter FLAG-elutie-nativebuffer.

Breng na de laatste wasbeurt de beads over naar een nieuwe gekoelde buis. Verwijder het buffer volledig. Resuspendeer de beads in 100 µL van 200 µg/mL 3X5-peptide in native elutiebuffer.

Incubeer vervolgens 10 minuten bij vier graden Celsius onder zachte rotatie. Verzamel de beads met de magneet en breng het supernatant over naar een nieuwe koude buis. Herhaal deze stap tweemaal voordat alle eluate worden verzameld.

Concentreer het eluaat tot 25 µL in een centrifugeerfiltereenheid door centrifugatie bij 10.000 ×g bij vier °C. Bereid het monster voor door 4X native sample loading buffer en 0,5% G-250 monsteradditief toe te voegen aan de 25 µL geconcentreerde eluaat. Laad het monster en de native molecuulgewichtmarkers, waarbij een lege put tussen beide wordt gelaten.

Laad vervolgens 10 tot 20 µL 1X native monsterlaadbuffer in alle lege putjes. Vul de kathodekamer voorzichtig met 200 mL 1X native PAGE donkerblauwe kathodebuffer, zodat de monsters niet worden verstoord. Vul de anodekamer met 550 mL 1X native PAGE anodebuffer.

Voer de gelrun uit bij 150 volt gedurende 30 minuten. Verwijder na het stopzetten van de run de donkerblauwe kathodebuffer met een serologische pipette en vervang deze door 1X lichtblauwe kathodebuffer. Nadat de run nog 60 minuten is voortgezet, wordt de gelcassette geopend en een van de cassetteplaten weggegooid.

De gel blijft aan de andere cassetteplaat kleven. Plaats de gel in een tray met voldoende fixeersolution om deze te bedekken en incubeer 30 minuten onder voorzichtig schudden. Verwijder vervolgens de fixeersolution en vervang deze door water voordat de gel wordt gescand.

Ter voorbereiding op massaspectrometrie plaatst u eerst een 96-wells plaat met kegelvormige bodem bovenop een andere 96-wells plaat om het afval op te vangen. Doorboor de bodem van de wells van de 96-wells plaat met kegelvormige bodem met een naald van 21 gauge. Voeg vervolgens 200 µL van 50% acetonitril, 0,25% mierenzuur toe aan de wells van de doorboorde plaat.

Incubeer de stapel platen in een schudder gedurende 10 minuten. Centrifugeer de plaat vervolgens bij 500 ×g gedurende één minuut, zodat de vloeistof door de gaten in de opvangplaat voor afval stroomt. Nadat de wasstappen twee keer zijn herhaald, vult u de putjes van de geperforeerde 96-well plaat met 150 µL 50 mM ammoniumbicarbonaat.

Plaats vervolgens de gel op een schoon oppervlak. Snijd de baan met de sample in 48 identieke plakjes. Snijd elk plakje in twee of drie kleinere stukjes, met uitzondering van de laatste vijf plakjes aan de bovenzijde van de gel.

Plaats elke plak opeenvolgend in een putje van de geperforeerde, gewassen 96-wellplaat. Voeg 50 µL acetonitril toe aan elk putje en incubeer de plaat onder schudding gedurende 30 tot 60 minuten. Na het verwijderen van de vloeistof door centrifugatie, voegt u 200 µL 2 mM TSEB en 50 mM ammoniumbicarbonaat toe aan elk putje.

Incubeer de plaat onder schudding gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat de vloeistof zoals eerder beschreven via centrifugatie wordt verwijderd. Dehydrateer de gelstukjes door 200 µL zuiver acetonitril toe te voegen en incubeer onder schudding bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat de gelstukjes wit en opaak zijn. Voeg na het verwijderen van het acetonitril 150 µL trypsine in koud ammoniumbicarbonaat toe aan elke put.

Incubeer de plaat onder schudding bij 37 °C gedurende twee uur. Plaats vervolgens een schone plaat met een kegelvormige bodem onder de plaat met de gel, waarbij u erop let dat de platen correct georiënteerd zijn. Verzamel vervolgens de vloeistof die de peptiden bevat door centrifugatie bij 200 ×g gedurende één minuut.

Plaats de plaat met de peptiden in een centrifugeverdampaar en laat de vloeistof verdampen terwijl u de volgende stap uitvoert. Voeg 150 µL van 50% acetonitril, 0,25% mierenzuur toe aan de gelstukjes. Incubeer onder schudcondities bij 37 °C gedurende 30 minuten.

Verzamel de vloeistof in de gedeeltelijk gedroogde plaat door centrifugatie bij 200 ×g gedurende één minuut. Laat de plaat met de peptiden verder verdampen terwijl de volgende stap wordt uitgevoerd. Breng de peptide-oplossingen over naar de gewassen centrifugale filtratieplaat.

Plaats een schone plaat met kegelvormige bodem eronder om de peptiden op te vangen en centrifugeer de stapel platen zoals voorheen. Verdampt de vloeistof in de plaat met kegelvormige bodem totdat de wells volledig droog zijn. Zodra ze droog zijn, kan de plaat worden afgesloten met een siliconen deksel en worden bewaard bij minus 20 °C tot aan het uitvoeren van de massaspectrometrie en data-analyse zoals beschreven in het tekstprotocol.

Representatieve resultaten van de hiërarchische clustering van blue native PAGE-migratieprofielen van Mta2 en copurificerende eiwitten worden hier weergegeven als een dendrogram en een heatmap die de eiwitintensiteiten representeren. Het migratieprofiel van Mta2 vertoont twee pieken die duiden op twee verschillende complexen. Sommige NuRD-subunits vertonen een vergelijkbaar patroon met de hoogste abundantie in de assemblage met het laagste moleculaire gewicht.

Daarentegen zijn andere NuRD-subunits in grotere hoeveelheden aanwezig in de NuRD-assemblage met een hoger molecuulgewicht. Aan de andere kant is de Mta2-interactor, Cdk2ap1, alleen aanwezig in de NuRD-assemblage met een hoger molecuulgewicht. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee en een halve dag worden uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle monsters en reagentia op ijs te houden om dissociatie van proteïnecomplexen te voorkomen. Deze procedure kan worden toegepast op elk proteïne van belang, mits dit vanuit het affiniteitsmedium kan worden geanalyseerd via competitieve elutie onder natieve condities. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals reverse of sequentiële co-immunoprecipitatie, worden uitgevoerd om de geïdentificeerde subcomplexen te valideren.