Name: Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer eiwitcomplexen oplossen door blue native PAGE en massaspectrometrie-correlatieprofilering. Deze methode verbetert de resolutie van eiwitinteracties en organiseert proteomics-gegevens effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust (WT098051).

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we het gebruik van affiniteitszuivering gevolgd door blauwe natieve gelelektroforese in combinatie met kwantitatieve massaspectrometrie eiwitcomplexen lossen. Deze aanpak biedt een methode om eendimensionale eiwit interactie lijsten te ontrafelen in functionele verzamelingen van eiwitten. We tonen de methode gebaseerd op het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten. Echter, als een cellijn die een gecodeerde eiwit niet beschikbaar is, kan een alternatief zijn om antilichamen te gebruiken tegen het eiwit van belang, op voorwaarde dat er een peptide beschikbaar voor inheemse concurrerende elutie bereiken. De hoeveelheid uitgangsmateriaal en de hoeveelheid korrels zouden moeten worden aangepast afhankelijk van het expressieniveau van het doeleiwit. Wij doorgaans voeren dit protocol met 2-5 x 10 8 cellen uitgangsmateriaal, en dit is zelfs voldoende voor eiwitten met laag expressieniveau. De lysisbuffer samenstelling dient empirisch worden gekozen verwezenlijkenin de buurt van oplosbaar maken van het aas te voltooien. Dit kan een uitdaging voor sommige soorten van eiwitten, in het bijzonder chromatine binden of membraaneiwitten. Alternatieven omvatten het verhogen van de hoeveelheid zout, mits het eiwitcomplex onderzochte stabiel in hoog zoutgehalte, of via sonificatie en / of nuclease behandeling van chromatine bindende eiwitten 20, 29. Bij membraaneiwitten, schakelen detergens DDM of digitonine kan wenselijk 30 zijn. In het geval van DNA-bindende eiwitten is het nuttig om een nuclease zoals Benzonase tijdens de zuiveringsstap 20 omvatten. Volledige verwijdering van nucleïnezuren garandeert dat de waargenomen wisselwerkingen plaatsvinden tussen eiwitten en niet gemedieerd door DNA. Een cruciaal element om te overwegen bij het gebruik van deze aanpak is de stabiliteit van het complex in onderzoek. De procedure is lang en kan preservin betrekkeng het eiwitcomplex een nacht. We hebben goede succes met twee chromatine remodeling complexen (D. Bode en M. Pardo, gegevens niet getoond) bereikt, maar dit moet worden geëvalueerd. De affiniteit zuiveringsstap kan worden verkort indien nodig. Alternatieve technieken die natief fractionering mogelijk, zoals grootte-uitsluitingschromatografie, zijn op grote schaal gebruikt voor meer dan 50 jaar eiwitcomplexen karakteriseren. Wij en anderen hebben aangetoond dat de resolutie van de blauwe inheemse PAGE is superieur aan die bereikt met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie 20, 31, 32, 33. Een ander voordeel van de blauwe inheemse PAGE is dat het niet-chromatografie-systemen, die duur zijn vereist, maar maakt gebruik van eiwit elektroforese apparatuur die is wijdverbreid in laboratoria. In termen van hands-on tijd, deze methode niet meer werk dan de traditionele geLC-MS / MS een betrekkenAANPAK of offline chromatografische fractionering. Echter, zoals de meeste fractionering technieken te doen, het heeft een limiet aan de oplossing ervan. Complexen die zeer homogene of dicht in de massa en vorm kan zijn dan de resolutie die door de blauwe inheemse PAGE, en dus het protocol zoals hier gemeld misschien niet universeel succesvol in het oplossen van verschillende complexen met gedeelde subeenheden zijn. Bemoedigend, hebben we succesvol geweest in het scheiden van twee zeer vergelijkbare tetramere complexen delen drie subeenheden (M. Pardo, manuscript in voorbereiding). Aangezien massaspectrometrie steeds gevoeliger is geworden, kunnen zelfs zeer kleine hoeveelheden niet-specifieke interactors en verontreinigingen worden gedetecteerd in AP-MS monsters. De hier gepresenteerde benadering kan helpen bij het onderscheiden van echte interactoren van achtergrond vervuiling in de affiniteitszuivering door richten van de aandacht op eiwitten met migratie pieken die overeenkomen met aas migratie pieken bij hogere molecuulgewicht dan die vande monomere eiwitten. Verschillende groepen hebben fractionatietechnieken gevolgd door proteïne correlatie profilering eiwitcomplexen op celniveau bakenen zonder de noodzaak van voorafgaande isolatie 10, 11, 12, 34 toegepast. Echter, dit kan resulteren in het niet sub-stoichiometrische interacties te detecteren. Het opnemen van een verrijking voor stap door affiniteit zuivering kan helpen om dit te overwinnen. De hier beschreven benadering zou in het algemeen bruikbaar voor het verkennen van de topologie van eiwitcomplexen en het ontrafelen van de meervoudige complexen een bepaald proteïne deelneemt aan binnen dezelfde cellulaire context. De strategie is eenvoudig en vatbaar voor laboratoria die niet kunnen hebben dure chromatografische fractionering apparatuur om eiwitcomplexen te lossen.

In cellen, meeste eiwitten hun functies door middel van tijdelijke eiwit-eiwitinteracties of door vorming van stabiele verzamelingen van eiwitten. Het karakteriseren van eiwit interacties is van cruciaal belang voor een volledig begrip cellulaire processen. Affiniteitszuivering in combinatie met massaspectrometrie (AP-MS) is een van de meest toegepaste strategieën voor natief eiwit interacties te identificeren. Significante verbeteringen in het instrument mogelijkheden bereikt in de afgelopen tien jaar hebben deze aanpak zeer krachtig gemaakt. Het is belangrijk op te merken dat de interacties die door AP-MS experimenten omvatten een mengsel van directe en indirecte verbindingen tussen aas en prooi. Bovendien vaak eiwitten nemen deel aan verschillende complexen binnen dezelfde cellulaire context, waarin verschillende biologische rollen kunnen hebben, en dus de interactoren die worden geïdentificeerd door AP-MS kan een combinatie van afzonderlijke verzamelingen van eiwitten of functionele entiteiten vertegenwoordigen. Het is niet mogelijk te leidendergelijke topologische informatie voorbaat van het mono-dimensionale lijsten van eiwitten die door eenvoudige AP-MS experimenten. Echter de techniek verder worden benut om de architectuur van eiwitcomplexen definiëren door het te combineren met één of meer methoden om deze samenstellingen te lossen. Om de topologie van eiwitinteracties geïdentificeerd door middel van AP-MS lossen zijn verschillende strategieën toegepast. Een benadering is om iteratief AP-MS experimenten met de prooien die in een voorgaande ronde van experimenten 1 lokaas voeren. Hoewel zeer informatief, dit is een heel arbeidsintensieve taak experimenteel en analytisch. Eiwit verknoping in combinatie met massaspectrometrie wordt steeds vaker gebruikt om topologische gegevens over eiwitcomplexen 2, 3, 4, 5 af te leiden. Echter, computational analyse van verknoopte peptiden nog steeds een uitdaging en is de bottleneck in de workflow vandaar. De komst van MS-afsplitsbare verknopende reagentia moeten in kaart brengen van de aminozuurresten die in de nabijheid van interagerende eiwitten 6, 7 te vergemakkelijken. Een ander alternatief is om affiniteitszuivering te combineren indien orthogonale scheidingstechnieken 8, 9. Chromatografische fractionering door gelfiltratie of ionuitwisseling of sucrosegradiënt fractionering zijn recent ook gebruikt in combinatie met kwantitatieve massaspectrometrie multiproteïnecomplexen beschrijven op systeemniveau-niveau, het omzeilen van het complex isolatiestap 10, 11, 12, 13. Blauw natieve polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) is op grote schaal toegepastonderzoeken natief eiwit interacties, kenmerkend die waarbij mitochondriale membraan eiwitcomplexen 14. Deze scheidingstechniek is onlangs ook gebruikt in combinatie met labelvrije eiwit kwantificering en correlatie profilering, niet alleen op de mitochondriale complexen 15, 16, 17, maar ook voor het ontrafelen andere proteïnecomplexen uit gehele cellen 18, 19. Onze hypothese was dat de combinatie van affiniteitszuivering met aansluitende fractionering natieve benaderingen en kwantitatieve MS een bruikbare strategie voor het oplossen van meerdere verzamelingen van eiwitten die een bepaald eiwit moet bieden. Hier beschrijven we een werkwijze die algemeen epitoop gebaseerde affiniteitszuivering met blauwe natieve polyacrylamide gel elektroforese van de geïsoleerde complexen gecombineerd, gevolgd door kwantitatieve massa spectrometry en eiwit correlatie profilering, de meerdere vergaderingen een eiwit zou kunnen worden betrokken bij het op te lossen. We maken gebruik van embryonale stamcellen van muizen waarbij een eiwit van belang gefuseerd aan een epitooplabel wordt uitgedrukt van de endogene locus in de buurt van fysiologische overvloed te bereiken en te zorgen voor een efficiënte inheemse complex isolement. Deze benadering ontrafelt de meervoudige interacties een eiwit grijpt in, het oplossen van hen in verschillende samenstellingen op basis van hun correlatie profielen, terwijl die niet werken dan conventionele geLC MS-20.

<table><tbody><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG antibody M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, protein grade, 10% solution</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl pimelimidate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Cathode Additive</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x NativePAGE sample loading buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250 sample additive&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS 96-well filtration system</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-well cap natural</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (software)</td><td>N.V.t.</td><td>N.V.t.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (software)</td><td>N.V.t.</td><td>N.V.t.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

het oplossen van affiniteit gezuiverde eiwit complexen door blue inheemse page en protein correlatie profiling

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

De meeste eiwitten werken in associatie met andere; daarom is het van cruciaal belang om deze functionele eenheden te karakteriseren om biologische processen volledig te begrijpen. Afiniteitszuivering gekoppeld aan massaspectrometrie (AP-MS) is de methode bij uitstek geworden voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties. Echter, conventionele AP-MS-studies leveren informatie over eiwitinteracties, maar de organisatorische informatie gaat verloren. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelden we een strategie om de verschillende functionele verzamelingen waarin een eiwit betrokken kan zijn te ontrafelen, door affiniteitsgezuiverde eiwitcomplexen te scheiden voorafgaand aan hun karakterisering door massaspectrometrie. Eiwitcomplexen geïsoleerd door affiniteitszuivering van een lokkeiwit met behulp van een epitooptag en competitieve elutie worden gescheiden door blauwe native elektroforese. Vergelijking van eiwitmigratieprofielen door correlatieprofilering met behulp van kwantitatieve massaspectrometrie maakt toewijzing van interacterende eiwitten aan verschillende moleculaire entiteiten mogelijk. Deze methode is in staat om eiwitcomplexen met nauwelijks verschillende molecuulgewichten op te lossen die mogelijk niet worden opgelost door traditionele chromatografische technieken zoals gelfiltratie. Met iets meer werk dan conventionele AP-geLC-MS/MS, tonen we aan dat deze strategie in veel gevallen adequaat kan zijn voor het verkrijgen van topologische informatie over eiwitcomplexen gelijktijdig met het identificeren van eiwitinteracties.

De werkstroom van de affiniteitszuivering Blue profilering natieve eiwit Correlatie van Mass Spectrometry (ABC-MS) strategie is afgebeeld in figuur 7. Natief eiwitcomplexen om een ​​eiwit van interesse worden geïsoleerd door affiniteitszuivering met gebruikmaking van antilichamen tegen een epitoop-tag (hier FLAG) en competitieve elutie. De complexen worden gescheiden door BN-PAGE, en de gehele gel baan is gesneden in secties 48 en voorbereid voor jachtgeweer LC-MS / MS. MS kwantitatieve informatie wordt gebruikt om een ​​profiel migratie voor elk geïdentificeerd eiwit in de natieve blauwe scheiding genereren. Eiwitten die interageren met een afzonderlijke complexe weergave vergelijkbaar migratieprofielen met elkaar tot pieken. Wanneer een eiwit van belang deelneemt aan meer dan één samenstel worden meerdere pieken waargenomen bij de migratieprofiel Gezien de sub-complexen zijn in het oplossend vermogen van de blauwe natieve gel. Een systematische vergelijking van de migrantsoen profielen kunnen worden verkregen door proteïne correlatie profilering middels hiërarchische clustering. Het dendrogram en piekintensiteiten van alle fracties worden gevisualiseerd in een warmte-kaart, het vergemakkelijken van de identificatie van interagerende eiwitten die tot afzonderlijke eiwitcomplexen (figuur 8). We gebruikten deze strategie om de interactie partners van MTA2, een kern subunit van het NuRD chromatine remodeling complex 20 te analyseren. Zoals getoond in figuur 9, de migratieprofiel van MTA2 weergegeven twee pieken afzonderlijke intensiteiten tussen 700 kDa en 1,2 MDa, waarbij de onderste massapiek tonen hogere overvloed. Andere NuRD kern subeenheden, waaronder MTA1 / 3, HDAC1 / 2 en Mbd3, vertoonde dezelfde scheidingspatroon, ondanks de pieken voor enkele van de subeenheden, namelijk Chd4, Gatad2a / b en Rbbp4 / 7, had de inverse abundantie verdeling (figuur 9A, B). Daarentegen het profiel van Cdk2ap1, een regulerende factor die de NuRD complex Wnt genpromoters 23 recruteert alleen getoonde grotere massa piek (figuur 9C), en dus Sall4, een transcriptionele repressor die ook is aangetoond dat NuRD 20, 24, 25 binden. Aldus fractionering van affiniteitsgezuiverde MTA2-geassocieerde eiwitten door blauwe natieve PAGE kon twee vormen van het complex NuRD lossen. ABC-MS maakt ook de identificatie van nieuwe interactoren terwijl ze toe te wijzen aan specifieke eiwit entiteiten. Door onderzoek van de eiwitten clusters en fractie intensiteiten vertegenwoordigd in een warmte-kaart gedetecteerd we een sterke correlatie tussen NuRD subeenheden en Wdr5, een regulerende subunit van het MLL methyltransferase complex 26, met Wdr5 weergeven van twee migratie pieken samenvallen met de twee NuRD peaks (figuur 8), suggereert een interactie van de Wdr5 en NuRD. We bevestigden deze interactie met co-immunoprecipitatie en co-migratie in grootte-uitsluitingschromatografie 20. De keuze van afstandmetriek berekening in de hiërarchische clustering zal de vorm van de clusters en dus de correlaties beïnvloeden. We raden u aan te experimenteren met de verschillende statistieken om de beste pasvorm met de bestaande interactie kennis van het eiwit of complex van belang te bereiken. Over het algemeen behaalden we de beste resultaten met de Manhattan (L1) afstand metrische 20. Pearson correlatie of Euclidische afstand metrieken zijn ook beschreven voor het identificeren van complexen op basis van alternatieve fractioneringstechnieken 10, 11, 12. de QuanMS titatieve gegevens uit de blauwe natieve fracties kunnen ook worden gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen bepalen. De iBAQ (intensiteit gebaseerd absolute kwantificatie) -waarde geeft een maat van de relatieve abundantie van de geïdentificeerde eiwitten 27, 28. De iBAQ waarden voor het eiwitcomplex leden van alle fracties binnen migratieprofiel piek genormaliseerd aan die van de aasproteïne om relatieve hoeveelheden te verkrijgen. De genormaliseerde iBAQs over een profiel piek voor een bepaald eiwitcomplex lid moeten horizontale trend te volgen, en de trend waarden weerspiegelen de stoichiometrie van de interacterende eiwitten ten opzichte van het aas eiwit. Voor een meer gedetailleerde weergave van stoichiometrie berekeningen, zie 20. <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figuur 7: Schematische samenvatting van de workflow ABC-MS strategie. Dit cijfer wordt gewijzigd van 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figuur 8 hiërarchische clustering van BN-PAGE migratieprofielen MTA2 interactoren. MTA2-geassocieerde eiwitten werden geclusterd op basis van de gelijkenis van hun migratieprofielen. Slechts een deel van de warmte-map van de NuRD complex weergegeven (tussen het blauwe vak). De gele vakje wijst op de sterke correlatie van Wdr5 met de NuRD complex. De geannoteerde molecuulgewichten werden bepaald door migratie afstand van eiwitstandaarden draaien in dezelfde gel. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics 20 van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Mo<html> lecular Biology. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figuur 9. BN-PAGE migratieprofiel van NuRD subeenheden en geassocieerde eiwitten. A) MTA2 en NuRD subeenheden aanwezig intensiteiten gelijk patroon. B) MTA2 en NuRD subeenheden met de inverse intensiteitspatroon. C) MTA2 en Cdk2ap1, die slechts aanwezig is in de hogere molecuulgewicht NuRD entiteit. De geannoteerde molecuulgewichten werden geschat op basis van de migratie-profiel van het eiwit normen. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics 20 van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie._blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="aanvullende File" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Aanvullende gegevens: Sample dataset. MaxQuant afgeleide proteingroups.txt bestand met eiwitidentificaties en kwantificering waarden uit een ABC-MS experiment. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Molecular and Cellular Proteomics 20 van de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Het algemene doel van deze experimentele strategie is om de verschillende functionele complexen waarin een eiwit betrokken kan zijn te onderscheiden via blue native polyacrylamidegelelektroforese-fractionering van affiniteitsgezuiverde eiwitcomplexen en massaspectrometrie-correlatieprofilering. Deze methode kan helpen om organisatorische informatie toe te voegen aan de eiwitlijsten die zijn gegenereerd door affiniteitszuivering-massaspectrometrie-experimenten. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn dat deze eenvoudig uit te voeren is, een goede resolutie heeft en weinig meer arbeid vereist dan conventionele gel CMSMS.Dit protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van eiwitcomplexen uit 200 tot 500 miljoen cellen die endogene hoeveelheden van een FLAG-tagged eiwit tot expressie brengen. Voeg na het ontdooien van de celpellet, zoals beschreven in het tekstprotocol, vijf milliliter ijskoud lysisbuffer met DTT en proteaseremmers toe aan de celsuspensie en draai voorzichtig om te mengen. Incubeer de suspensie 10 minuten op ijs.Breng de celсусpensie over naar een koude homogenisator. Lyseer de cellen met 20 tot 30 slagen met de nauwsluitende stamper totdat er geen merkbare viscositeit meer is, en breng het homogenizaat vervolgens over naar koude microcentrifugebuisjes. Breng na het centrifugeren van de buisjes het geklaarde lysaat over naar een schone koude buis, waarbij ongeveer 50 microliters lysaat wordt achtergelaten.Bewaar een aliquot van 35 µL lysaat om de proteïneconcentratie te bepalen en de zuivering te monitoren. Verwijder vervolgens de buffer uit de eerder voorbereide beads. Resuspendeer de beads in één milliliter van het lysaat en meng dit daarna met de rest van het lysaat.Incubeer het mengsel op een draaiend wiel bij 4 °C gedurende één tot twee uur. Verzamel de kraaltjes tegen de zijkant van de buis met een magneet. Neem een aliquot van 30 µL supernatant af en gooi de rest weg.Resuspendeer de kralen in 0,5 milliliter IPP150-buffer door vier tot zes keer te pipetteren. Draag de suspensie vervolgens over naar een koude buis van 1,5 milliliter. Was de kralen daarna drie keer met 0,5 milliliter FLAG-elutie-nativebuffer.Breng na de laatste wasbeurt de beads over naar een nieuwe gekoelde buis. Verwijder het buffer volledig. Resuspendeer de beads in 100 µL van 200 µg/mL 3X5-peptide in native elutiebuffer.Incubeer vervolgens 10 minuten bij vier graden Celsius onder zachte rotatie. Verzamel de beads met de magneet en breng het supernatant over naar een nieuwe koude buis. Herhaal deze stap tweemaal voordat alle eluate worden verzameld.Concentreer het eluaat tot 25 µL in een centrifugeerfiltereenheid door centrifugatie bij 10.000 ×g bij vier °C. Bereid het monster voor door 4X native sample loading buffer en 0,5% G-250 monsteradditief toe te voegen aan de 25 µL geconcentreerde eluaat. Laad het monster en de native molecuulgewichtmarkers, waarbij een lege put tussen beide wordt gelaten.Laad vervolgens 10 tot 20 µL 1X native monsterlaadbuffer in alle lege putjes. Vul de kathodekamer voorzichtig met 200 mL 1X native PAGE donkerblauwe kathodebuffer, zodat de monsters niet worden verstoord. Vul de anodekamer met 550 mL 1X native PAGE anodebuffer.Voer de gelrun uit bij 150 volt gedurende 30 minuten. Verwijder na het stopzetten van de run de donkerblauwe kathodebuffer met een serologische pipette en vervang deze door 1X lichtblauwe kathodebuffer. Nadat de run nog 60 minuten is voortgezet, wordt de gelcassette geopend en een van de cassetteplaten weggegooid.De gel blijft aan de andere cassetteplaat kleven. Plaats de gel in een tray met voldoende fixeersolution om deze te bedekken en incubeer 30 minuten onder voorzichtig schudden. Verwijder vervolgens de fixeersolution en vervang deze door water voordat de gel wordt gescand.Ter voorbereiding op massaspectrometrie plaatst u eerst een 96-wells plaat met kegelvormige bodem bovenop een andere 96-wells plaat om het afval op te vangen. Doorboor de bodem van de wells van de 96-wells plaat met kegelvormige bodem met een naald van 21 gauge. Voeg vervolgens 200 µL van 50% acetonitril, 0,25% mierenzuur toe aan de wells van de doorboorde plaat.Incubeer de stapel platen in een schudder gedurende 10 minuten. Centrifugeer de plaat vervolgens bij 500 ×g gedurende één minuut, zodat de vloeistof door de gaten in de opvangplaat voor afval stroomt. Nadat de wasstappen twee keer zijn herhaald, vult u de putjes van de geperforeerde 96-well plaat met 150 µL 50 mM ammoniumbicarbonaat.Plaats vervolgens de gel op een schoon oppervlak. Snijd de baan met de sample in 48 identieke plakjes. Snijd elk plakje in twee of drie kleinere stukjes, met uitzondering van de laatste vijf plakjes aan de bovenzijde van de gel.Plaats elke plak opeenvolgend in een putje van de geperforeerde, gewassen 96-wellplaat. Voeg 50 µL acetonitril toe aan elk putje en incubeer de plaat onder schudding gedurende 30 tot 60 minuten. Na het verwijderen van de vloeistof door centrifugatie, voegt u 200 µL 2 mM TSEB en 50 mM ammoniumbicarbonaat toe aan elk putje.Incubeer de plaat onder schudding gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat de vloeistof zoals eerder beschreven via centrifugatie wordt verwijderd. Dehydrateer de gelstukjes door 200 µL zuiver acetonitril toe te voegen en incubeer onder schudding bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat de gelstukjes wit en opaak zijn. Voeg na het verwijderen van het acetonitril 150 µL trypsine in koud ammoniumbicarbonaat toe aan elke put.Incubeer de plaat onder schudding bij 37 °C gedurende twee uur. Plaats vervolgens een schone plaat met een kegelvormige bodem onder de plaat met de gel, waarbij u erop let dat de platen correct georiënteerd zijn. Verzamel vervolgens de vloeistof die de peptiden bevat door centrifugatie bij 200 ×g gedurende één minuut.Plaats de plaat met de peptiden in een centrifugeverdampaar en laat de vloeistof verdampen terwijl u de volgende stap uitvoert. Voeg 150 µL van 50% acetonitril, 0,25% mierenzuur toe aan de gelstukjes. Incubeer onder schudcondities bij 37 °C gedurende 30 minuten.Verzamel de vloeistof in de gedeeltelijk gedroogde plaat door centrifugatie bij 200 ×g gedurende één minuut. Laat de plaat met de peptiden verder verdampen terwijl de volgende stap wordt uitgevoerd. Breng de peptide-oplossingen over naar de gewassen centrifugale filtratieplaat.Plaats een schone plaat met kegelvormige bodem eronder om de peptiden op te vangen en centrifugeer de stapel platen zoals voorheen. Verdampt de vloeistof in de plaat met kegelvormige bodem totdat de wells volledig droog zijn. Zodra ze droog zijn, kan de plaat worden afgesloten met een siliconen deksel en worden bewaard bij minus 20 °C tot aan het uitvoeren van de massaspectrometrie en data-analyse zoals beschreven in het tekstprotocol.Representatieve resultaten van de hiërarchische clustering van blue native PAGE-migratieprofielen van Mta2 en copurificerende eiwitten worden hier weergegeven als een dendrogram en een heatmap die de eiwitintensiteiten representeren. Het migratieprofiel van Mta2 vertoont twee pieken die duiden op twee verschillende complexen. Sommige NuRD-subunits vertonen een vergelijkbaar patroon met de hoogste abundantie in de assemblage met het laagste moleculaire gewicht.Daarentegen zijn andere NuRD-subunits in grotere hoeveelheden aanwezig in de NuRD-assemblage met een hoger molecuulgewicht. Aan de andere kant is de Mta2-interactor, Cdk2ap1, alleen aanwezig in de NuRD-assemblage met een hoger molecuulgewicht. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee en een halve dag worden uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle monsters en reagentia op ijs te houden om dissociatie van proteïnecomplexen te voorkomen. Deze procedure kan worden toegepast op elk proteïne van belang, mits dit vanuit het affiniteitsmedium kan worden geanalyseerd via competitieve elutie onder natieve condities. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals reverse of sequentiële co-immunoprecipitatie, worden uitgevoerd om de geïdentificeerde subcomplexen te valideren.

resolving-affinity-purified-protein-complexes-blue-native-page

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

This video demonstrates tandem affinity purification — a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer eiwitcomplexen oplossen door blue native PAGE en massaspectrometrie-correlatieprofilering. Deze methode verbetert de resolutie van eiwitinteracties en organiseert proteomics-gegevens effectief.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Meer video's verkennen