Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Het algemene doel van deze experimentele strategie is om de verschillende functionele assemblages waarin een eiwit betrokken kan zijn, op te lossen door middel van blue native polyacrylamide-gelelektroforese fractie van affiniteitsgezuiverde eiwitcomplexen en massaspectrometrie correlatieprofilering. Deze methode kan helpen om organisatorische informatie toe te voegen aan de eiwitlijsten die gegenereerd worden door affiniteitszuivering met massieve spectrometrie experimenten. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn dat het eenvoudig uit te voeren is, goede resolutie heeft en het iets meer werk kost dan conventionele gel CMSMS.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van eiwitcomplexen uit 200 tot 500 miljoen cellen die endogene niveaus van een FLAG-gelabeld eiwit tot expressie brengen. Na het ontdooien van de cellys, zoals beschreven in het tekstprotocol, voegt u vijf milliliter ijskoud lysebuffer met DTT en proteaseremmers toe aan de celsuspensie en draait u om te mengen. Incubeer de suspensie gedurende 10 minuten op ijs.

Breng de celsuspensie over naar een koude homogenisator. Lyse de cellen met 20 tot 30 slagen, met behulp van de strakke stamper totdat er geen merkbare viscositeit meer is, en breng vervolgens het homogenaat over naar koude microcentrifugebuizen. Na het centrifugeren van de buizen, brengt u het verdunde lysaat over naar een schone koude buis, waarbij ongeveer 50 microliter lysaat achterblijft.

Bewaar een 35 microliter aliquot van lysaat om de eiwitconcentratie te meten en de zuivering te controleren. Verwijder vervolgens het buffer van de eerder bereide kralen. Resuspendeer de kralen met één milliliter van het lysaat en meng vervolgens met de rest van het lysaat.

Incubeer het mengsel op een roterende wiel bij vier graden Celsius gedurende één tot twee uur. Verzamel de kralen aan de zijkant van de buis met een magneet. Verzamel een 30 microliter aliquot van supernatant en gooi de rest weg.

Resuspendeer de kralen in 0,5 milliliter IPP150-buffer door vier tot zes keer te pipetteren. Breng vervolgens de suspensie over naar een 1,5 milliliter koude buis. Was vervolgens de kralen drie keer met 0,5 milliliter FLAG elutie native buffer.

Bij de laatste wassing, brengt u de kralen over naar een nieuwe koude buis. Verwijder de buffer grondig. Resuspendeer de kralen in 100 microliters van 200 microgram per milliliter 3X5 peptide in native elutiebuffer.

Vervolgens incubeert u bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten met zachte rotatie. Verzamel de kralen met de magneet en breng het supernatant over naar een nieuwe koude buis. Herhaal deze stap twee keer voordat u alle eluaten verzamelt.

Concentreer het eluaat tot 25 microliter in een centrifugaalfiltereenheid door centrifugatie bij 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Bereid het monster voor door 4X native monsterlaadbuffer en 0,5% G-250 monsteradditief toe te voegen aan het 25 microliter geconcentreerde eluaat. Laad het monster en native moleculaire gewicht markers, waarbij u een lege put tussen hen laat.

Laad vervolgens 10 tot 20 microliter 1X native monsterlaadbuffer in alle lege putten. Vul de kathodekamer voorzichtig met 200 milliliter 1X native PAGE donkerblauwe kathodebuffer, zonder de monsters te verstoren. Vul de anodekamer met 550 milliliter 1X native PAGE anodebuffer.

Laat de gel 30 minuten op 150 volt draaien. Nadat u de run hebt gestopt, verwijdert u de donkerblauwe kathodebuffer met een serologische pipet en vervangt u deze door 1X lichtblauwe kathodebuffer. Nadat u de run gedurende 60 minuten hebt voortgezet, opent u de gelcassette en gooit u een van de cassetteplaten weg.

De gel blijft aan de andere cassetteplaat bevestigd. Plaats de gel in een lade met voldoende fixeeroplossing om het te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten met zacht schudden. Verwijder vervolgens de fixeeroplossing en vervang deze door water voordat u de gel scant.

Om voorbereiding voor massaspectrometrie te doen, plaatst u eerst een 96-wellplaat met conische bodem op een andere 96-wellplaat om het afval te verzamelen. Prik de bodem van de putjes van de 96-wellplaat met conische bodem met een 21 gauge naald. Voeg vervolgens 200 microliter 50% acetonitril, 0,25% formique zuur toe aan de putjes van de geprikte plaat.

Incubeer de plaatstapel gedurende 10 minuten in een shaker. Centrifugeer vervolgens de plaat gedurende één minuut bij 500 keer G, zodat de vloeistof door de gaten in de afvalverzamelplaat stroomt. Nadat u de wasstappen twee keer hebt herhaald, vult u de putjes van de geprikte 96-wellplaat met 150 microliter 50 millimolair ammoniumbicarbonaat.

Plaats vervolgens de gel op een schone ondergrond. Snijd de baan met het monster in 48 identieke plakjes. Snijd elk plakje in twee of drie kleinere stukken, behalve de laatste vijf plakjes aan de bovenkant van de gel.

Plaats elk plakje achtereenvolgens in één putje van de geperforeerde 96-wellplaat. Voeg 50 microliter acetonitril toe aan elk putje en incubeer de plaat met schudden gedurende 30 tot 60 minuten. Na het verwijderen van de vloeistof door centrifugatie, voegt u 200 microliter twee millimeter TSEB en 50 millimolair ammoniumbicarbonaat toe aan elk putje.

Incubeer de plaat met schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat u de vloeistof door centrifugatie verwijdert zoals eerder. Dehydrateer de gel stukken door 200 microliter zuiver acetonitril toe te voegen en incubatie met schudden bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten tot de gel stukken wit en ondoorzichtig zijn. Nadat u het acetonitril hebt verwijderd, voegt u 150 microliter trypsine in koud ammoniumbicarbonaat toe aan elk putje.

Incubeer de plaat met schudden gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Plaats vervolgens een schone conische bodempla