Name: Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer bioluminescentiebeeldvorming om neuro-inflammatie te kwantificeren in een muismodel voor Parkinson na perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen. Deze niet-invasieve methode maakt vroegtijdige diagnose van neurologische ziekten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Olga Sharma, Theresa Hundt, en het personeel van de DZNE microscopie en dierlijke faciliteiten voor technische ondersteuning.

Alle procedures met inbegrip van dieren werden uitgevoerd met toestemming van de dierenbescherming commissie van Noord-Rijnland-Westfalen State Environment Agency (LANUV). Dieren werden gehuisvest en verzorgd volgens standaardomstandigheden met een 12 uur licht / donkercyclus en vrije toegang tot voedsel en water. 1. Dierlijke Model <ol><li> Kruisen hemizygoot Tg (GFAP -Luc +/-) muizen met hemizygoot Tg (M83 +/-) muizen hemizygoot bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) genereren muizen 15, 16. </li><li> Genotype nakomelingen met real-time PCR op de aanwezigheid van het transgen dat codeert voor humaan alfa-synucleine en met standaard PCR voor vuurvlieg luciferase 12, 17. </li><li> Beënt de dieren op een leeftijd van zes tot acht weken. </li></ol> 2. Inoculumbereiding <ol><li> Bereid monomeric recombinant humaan alfa-synucleine de A53T mutatie in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer die 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) zoals eerder beschreven 14. </li><li> Bereid fibrillaire alpha-synuclein voor inentingen door roeren 3 ug / ul monomeer recombinant humaan alfa-synucleine in een orbitale schudder bij 800 rpm en 37 ° C gedurende 5 dagen. </li><li> Fibril verdunde samenstellingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1 ug / ul bereiken voor intraperitoneale of 2 ug / ul voor intraglossal inentingen. </li><li> Fragment van de alfa-synucleine fibrillen met een staaf sonicator gedurende 1 min (40 pulsen met 0,5 seconden vertraging met één seconde pauze tussen de pulsen een amplitude ingesteld op 50%) op ijs. Om besmetting door cross-zaaien voorkomen. Gebruik schone sonicatie sondes naar verschillende inoculum te bereiden. </li></ol> 3. Intraglossal Injecties <ol><li> Verdoven dieren met intraperitoneal injectie van 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine. Knijp teen van het dier en bevestigen dat het niet aan zijn achterpoot niet intrekt om een ​​goede verdoving te waarborgen. Gebruik dierenarts zalf op de ogen van het dier te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. </li><li> Fix genarcotiseerd dieren voorzichtig met plakband op een verwarmingsplaat in een dorsale liggende positie met hun hoofden gericht naar de onderzoeker. </li><li> Vul een 27 G wegwerpbare injectiespuit met 5 pl gesoniceerde alfa-synucleine fibrillen of PBS. </li><li> Met een stompe neus pincet met gekartelde uiteinden mond van het dier open te houden, en een kleinere pincet voorzichtig trek de tong aan de onderzijde van de tand toegankelijk voor injectie. </li><li> Injecteer de naald van de injectiespuit in de rechter of linker onderzijde van de tand nabij de hypoglossale zenuw. Injecteer langzaam het inoculum na 5 s. Langzaam trekken de naald na 5 seconden zodat het inoculumheeft het weefsel doordrongen en niet verloren tijdens het terugtrekken van de naald. </li><li> Laat het dier de fixaties en laat het op de verwarmingsplaat onder constante bewaking tot volledig herstel. </li></ol> 4. intraperitoneale injecties <ol><li> Voor intraperitoneale injecties, narcosemiddel dieren kort per anesthesie kamer door inhalatie van isofluraan / zuurstof onder toepassing van een stroomsnelheid van 2 l / min en ingesteld op 2% verdamper. Knijp teen van het dier en bevestigen dat het niet aan zijn achterpoot niet intrekt om een ​​goede verdoving te waarborgen. </li><li> Vul een 27 G wegwerpbare injectiespuit met 50 ul van gesoniceerde alfa-synucleine fibrillen of PBS. </li><li> Direct injecteren in het buikvlies van de muis en voorkomen penetreren van de dunne darm of blinde darm achter de buikwand door het houden van het dier in een dorsale positie met de kop afgekeerd van de onderzoeker en naar beneden ongeveer 45 °. Monitor dieren, totdat zij volledig zijn herstelduit de narcose. </li></ol> 5. Bioluminescentie Imaging <ol><li> Afbeelding Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen elke 2-4 weken met behulp van een bioluminescentie imaging-systeem. </li><li> Vóór kort beeldvorming verdoven muizen per isofluraan / zuurstof kamer met een debiet van 2 l / min en ingesteld op 2% verdamper. Knijp teen van het dier en bevestigen dat het niet aan zijn achterpoot niet intrekt om een ​​goede verdoving te waarborgen. </li><li> Scheren en ontharen de hoofden van de muizen met een ontharingscrème. Kleur de oren in het zwart met een niet-irriterend marker om niet-specifieke bioluminescentie te blokkeren. </li><li> Verdunde D-luciferine kaliumzout, het substraat van luciferase in PBS tot 30 mg / ml voorraadoplossing. Sla deze in 1 ml porties bij -20 ° C. Bescherm de opgeloste D-luciferine tegen blootstelling aan licht. </li><li> Weeg de dieren voorafgaand aan injectie. Bereken het exacte volume van D-luciferine voor injectie van 150 mg / kg lichaamsgewicht. Intraperitoneaal injecteren D-luciferin en geeft het dier aan de anesthesie kamer. </li><li> Start de imaging software. Na de imaging-systeem heeft zijn bedrijfstemperatuur bereikt initialiseren van het systeem door te klikken op de &#39;Initialize&#39; knop in het controlepaneel. </li><li> Selecteer de knoppen &#39;lichtend&#39; en &#39;Foto&#39;. Stel de belichtingstijd tot 60 s, de binning op &#39;Medium&#39;, de F / Stop op &#39;1&#39;, en de EM winst op &#39;Uit&#39;. </li><li> Controleer of de opwekkingsfilter op &#39;Block en de emissie filter &#39;Open&#39; en stel de onderhavige hoogte tot 1,50 cm. </li><li> Tien minuten na injectie van D-luciferine, plaatst de dieren op de verwarmingsplaat in de beeldvorming kamer en opdat de neuzen correct in de anesthesie uitlaat geplaatst. Sluit de isofluraan / zuurstof stroom uit de inhalatiekamer openen en de stroming van de beeldvorming kamer met een stroomsnelheid van 0,25 l / min en een verdamping van 2%. Sluit de deur van de afbeeldingskamer properly. </li><li> Klik op de &#39;Acquire&#39; om de bioluminescentie, waarvan 60 s duurt te meten. Stop de isofluraan stroom en toezicht op de dieren, totdat ze volledig zijn hersteld na zijn terugkeer ze terug naar hun kooien. </li><li> Gebruik de imaging software om de bioluminescentie kwantificeren. Binnen de &#39;Tool Palette&#39; te selecteren &#39;ROI Tools&#39;. Onder &#39;Type&#39; binnen de &#39;ROI Tools&#39; selecteer &#39;Measurement ROI&#39;. </li><li> Binnen het &#39;ROI Tools&#39; klikt u op de &quot;cirkel&quot; tool en selecteer het aantal ROI te trekken uit de pull-down menu - idealiter &#39;3&#39; voor drie muizen. </li><li> In de afbeelding rechts op elke ROI onder &#39;Properties&#39; stel de breedte en hoogte tot 1,25 cm. Plaats elk ROI over de hersenen gebied dat wordt gekwantificeerd. </li><li> In de linkerbovenhoek van het beeld, stel de paneeleenheden op &quot;straling (fotonen). </li><li> Binnen de &#39;Tool Palette&#39; de optie &#39;Beeld aanpassen&#39; en stel de minimum- enhet maximum van de &#39;kleurenschaal&#39;, bijvoorbeeld van 0.20e6 tot 1.00e6. </li><li> Onder &#39;Bestand&#39; opslaan van de gegevens met &#39;Save&#39;. </li></ol> 6. Biochemical Analysis <ol><li> Isoleer de hersenen en ruggenmerg volgens vastgestelde protocollen 18, 19. </li><li> Homogeniseren volledige hersenen en ruggenmerg hele monsters afzonderlijk in PBS in aanwezigheid van protease en fosfatase remmers (verdund tot 1x in PBS) in twee 30 s cycli met 6000 rpm in een weefselhomogenisator. Zorgen dat de hersenen en het ruggenmerg monsters worden gehomogeniseerd tot een uiteindelijke concentratie van 20% (gew / vol). </li><li> Ultrasone trillingen de monsters tweemaal terwijl hun plaatsing op ijs met een constante puls van 10 s en een amplitude ingesteld op 50%. </li><li> Pas de homogenaten tot 10% in PBS en 750 mM NaCl door verdunning ze 1: 1 met 1,5 M NaCl in PBS. </li><li> De celresten te scheiden, centrifuge de homogenaten bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij4 ° C. Houd de supernatanten voor de volgende stappen en gooi de pellets. </li><li> Meet de eiwitconcentratie in de homogenaten met de bicinchoninezuur (BCA) bepaling volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer 1,0 mg totaal eiwit van homogenaat of 0,8 mg van het ruggenmerg homogenaten in N-laurylsarcosyl bij een uiteindelijke concentratie van 10% (gew / vol) gedurende 15 minuten op ijs. </li><li> Overlay de homogenaten op een 3 ml sucrose kussen van 10% (gew / vol) in gedestilleerd water en ultracentrifuge ze bij 465.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellets in een buffer die 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 192 mM glycine, 25 mM Tris en 5% (gew / vol) sucrose. </li><li> Kook de monsters bij 100 ° C gedurende 5 minuten en plaats ze op SDS-polyacrylamide gels elektroforese in een morfoline zuur (MES) buffersysteem. </li><li> Overdracht van de gescheiden eiwitten op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen in een semiDry blotting systeem. </li><li> Incubeer de membranen in 0,4% (vol / vol) oplossing van formaline in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotor met 35 rpm voor het verknopen van de eiwitten met het membraan. </li><li> Blokkeren van de membranen in TBS buffer die 0,05% (vol / vol) Tween 20 en 5% (w / v) melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubeer de blots met het primaire antilichaam in blokkeringsbuffer gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> Was de membranen drie keer in TBS buffer en incubeer ze met peroxidase of fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen in TBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Visualiseren het gebonden secundaire antilichamen door chemiluminescentie of fluorescentie volgens vastgestelde protocollen 20. </li></ol> 7. Immunofluorescentie analyse <ol><li> Dehydrateer de ontleed hersenen en ruggenmerg in een weefsel bewerkingsstation en insluiten in paraffine middels paraffine station. </li><li> Snijd de paraffine ingebedde tisklaagt met een microtoom in 8 urn dikke coronale secties en monteren van de onderdelen op objectglaasjes. </li><li> Deparaffinize de weefselcoupes door ze te incuberen in twee afzonderlijke baden xyleen gedurende 5-10 minuten en ze te rehydrateren door een reeks van gegradeerde ethanol baden (100%, 90%, 70%, 50%) en tenslotte met H2O </li><li> Incubeer de secties in 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verder kook ze gedurende 10 minuten in een magnetron. </li><li> Laat de secties afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze een 3% waterstofperoxide-oplossing gedurende 30 min endogene peroxidasen remmen. </li><li> Blokkeer de weefselcoupes door incubatie met 20% (vol / vol) normaal geitenserum, 1% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubeer de secties met het primaire antilichaam verdund in 1% (vol / vol) normaal geitenserum, 1% (v / v) BSA en 0,25% Triton X-100 in PBS overnacht bij 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Was de secties tweemaal met 0,25% (v / v) Triton X-100 in PBS en eenmaal met PBS. </li><li> Vlekken op de profielen met de overeenkomstige fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen en het nucleaire kleurstof DAPI verdund in 1% (vol / vol) normaal geitenserum, 1% (vol / vol) BSA en PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Na tweemaal wassen met 0,25% (v / v) Triton X-100 in PBS en eenmaal met PBS, dekglaasje de dia&#39;s met inbedmassa en breng de kleuring met een confocale laser scanning microscoop. </li></ol>

<ol><li>Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Beyond+the+prion+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Beyond the prion principle.</a> Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).</li>
<li>Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+pathology+in+long-term+embryonic+nigral+transplants+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease.</a> Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+bodies+in+grafted+neurons+in+subjects+with+Parkinson%27s+disease+suggest+host-to-graft+disease+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation.</a> Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).</li>
<li>Hansen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+propagates+from+mouse+brain+to+grafted+dopaminergic+neurons+and+seeds+aggregation+in+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells.</a> J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).</li>
<li>Holmqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+Parkinson+pathology+spread+from+the+gastrointestinal+tract+to+the+brain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+injection+of+alpha-synuclein+induces+CNS+alpha-synuclein+pathology+and+a+rapid-onset+motor+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).</li>
<li>Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prion+neuroinvasion+following+tongue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rapid prion neuroinvasion following tongue infection.</a> J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).</li>
<li>Tamgüney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+prions+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measuring prions by bioluminescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+multiple+system+atrophy+prions+to+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).</li>
<li>Breid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasion+of+alpha-Synuclein+Prionoids+after+Intraperitoneal+and+Intraglossal+Inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation.</a> J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).</li>
<li>Bernis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+human+brain-derived+alpha-synuclein+in+transgenic+mice+expressing+human+wild-type+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).</li>
<li>Gunther, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+testing+and+spinal+cord+removal+in+a+mouse+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+MPTP+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease.</a> Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+bacterial+endotoxin+generates+a+distinct+strain+of+alpha-synuclein+fibril%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril.</a> Sci Rep. 6, 30891(2016).</li>
<li>Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+pathogenesis%3A+disease+onset+is+characterized+by+marked+induction+of+GFAP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells.</a> Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).</li>
<li>Stöhr, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synthetic+Abeta+prion+strains+producing+different+amyloid+deposits+in+bigenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+Parkinson+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).</li>
<li>Peelaerts, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+strains+cause+distinct+synucleinopathies+after+local+and+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration.</a> Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen is een gemakkelijke werkwijze voor neurologische ziekte gepaard gaat met inflammatoire processen induceert belangrijke kenmerken van synucleïne interageren recapituleren. Evenzo tong injectie vertegenwoordigt een andere weg voor neuroinvasion door alfa-synucleine prionoids in transgene muizen, maar minder efficiënt. We kozen ervoor om onze experimenten te beëindigen op 420 dagen na de i...

Er is groeiend bewijs dat alfa-synucleine heeft kenmerken die lijken op die van het prion eiwit, met name in zijn vermogen om uitzaaien en propageren verkeerd vouwen tussen cellen en langs zenuwbanen. Deze eigenschap van alpha-synuclein wordt ook wel &#39;prion-achtige&#39; of &#39;prionoid&#39;, en wordt ondersteund door waarnemingen bij transplantatie-experimenten, waarbij de overdraagbaarheid van verkeerd gevouwen alfa-synucleine van aangetaste neuronen suggereren nieuw getransplanteerde gezonde neuronen 1, 2 , 3, 4. Ook directe injectie van verkeerd gevouwen alfa-synucleïne in de hersenen of de periferie, zoals het achterbeen spier of darmwand leidt tot een spreiding van alpha-synuclein pathologie distale delen van het CNS 5, 6, 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. We analyseerden overdracht van alfa-synucleine prionoids via perifere routes nader en de vraag of verkeerd gevouwen alpha-synuclein het CNS kan neuroinvade na één intraglossal of intraperitoneale injectie, een eigenschap die eerder was aangetoond voor prionen maar niet te verkeerd gevouwen alfa- geadresseerd synucleïne. Na injectie van prionen in de tong is neuroinvasion van het CZS bereikt door voortplanting langs de hypoglossale zenuw van de tong tot de kern van de hypoglossuszenuw, die is gelegen in de hersenstam 11. Als muismodel we kozen Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen die de A53T mutant van humaan alfa-synucleine van het prion promoter tot overexpressie brengen en vuurvlieg luciferase onder controle van een GFAP promotor astrocytaire activering door toezicht bioluminescentie, zoals eerder aangetoond in de hersenen vanprion-geïnfecteerde muizen 12. In onze handen bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) heeft muizen niet ontwikkelen van de ziekte tot 23 maanden oud, zoals is aangetoond door anderen 13. Een enkele injectie van humaan alfa-synucleine fibrillen via intraglossal of intraperitoneale route geïnduceerde neurologische ziekte pathologie in de hersenen en ruggenmerg van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen ondersteunt de hypothese dat alfa-synucleine prionoids deel belangrijke kenmerken met prionen 14.

<table><tbody><tr><td>anti-actin antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFAP antibody</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>anti-IBA-1 antibody</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>anti-Sequestosome-1 (p62) antibody</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>anti-ubiquitin antibody [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&nbsp;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 G syringe</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline lab marker&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin potassium salt</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/mL stock solution</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 sonicator</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II imaging system</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83+/-) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Narrow pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110 rotor&nbsp;</td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>HRP conjugated antibody</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 conjugated antibody&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200 imaging system</td><td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey infrared imaging system&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>working solution 3%</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>working dilution 1:50,000</td></tr><tr><td>Fluoromount media&nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT protease and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10516495</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24-Dual homogenizer&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 conjugated antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp;BCA&nbsp;Protein&nbsp;Assay&nbsp;Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen na perifere enten van alfa-synucleine fibrillen

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

De prion-achtige gedrag van verkeerd gevouwen alfa-synucleine bestuderen, zijn muismodellen nodig die snelle en eenvoudige overdracht van alfa-synucleïne prionoids die neuropathologie veroorzaken in het centrale zenuwstelsel (CZS) laten. Hier beschrijven we intraglossal of intraperitoneale injectie van alfa-synucleine fibrillen in bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine tot overexpressie met A53T mutatie van het prioneiwit promoter en vuurvlieg luciferase van de promotor voor glia fibrillair zuur eiwit (GFAP), volstaat de neuropathologische ziekte induceren. In vergelijking met homozygote Tg (M83 + / +) muizen die ernstige neurologische symptomen beginnen op een leeftijd van 8 maanden, heterozygote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ontwikkelen dieren vrij blijven van spontane ziekte totdat ze een te bereiken leeftijd van 22 maanden. Interessant injectie van alfa-synucleine fibrillen via intraperitoneal route geïnduceerde neurologische ziekte met verlamming in vier van de vijf Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen met een gemiddelde incubatietijd van 229 ± 17 dagen. Zieke dieren vertoonden ernstige afzettingen van gefosforyleerde alfa-synucleine in hun hersenen en ruggenmerg. Ophopingen van alfa-synucleïne waren Sarkosyl onoplosbare en colocalized met ubiquitine en p62, onder begeleiding van een ontstekingsreactie resulteert in astrocytische gliose en microgliosis. Verrassenderwijs inoculatie van alfa-synucleine fibrillen in de tong minder effectief bij het veroorzaken van ziekte met slechts een van de vijf geïnjecteerde dieren met alpha-synuclein pathologie na 285 dagen. Onze bevindingen tonen aan dat enting via de intraglossal route en nog meer via de intraperitoneale route is geschikt voor neurologische ziekte met relevante kenmerken van synucleïnopathieën induceren in Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen. Dit zorgt voor een nieuw model voor het bestuderen van prion-achtige pathogenese inducerend door alfa-synucleine prionoids nader.

Perifere injectie van alfa-synucleïne prionoids via de tong of het buikvlies geïnduceerde neuropathologie in het CZS van bigene Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen (Tabel 1 en Figuur 1). Na een enkele intraperitoneale injectie met alfa-synucleine fibrillen, vier van de vijf muizen ontwikkelden neurologische ziekte met een mediane incubatietijd van 229 ± 17 dagen. Verrassend is dat slechts een van de vijf muizen ontwikkelden ...

Perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen in het peritoneum of de tong van Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) muizen, die humaan alfa-synucleine met familiaire A53T mutatie en vuurvlieg luciferase tot expressie brengen, kunnen neuropathologie induceren, waaronder neuroinflammatie in het centrale zenuwstelsel.

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Het algemene doel van deze bioluminescentie-beeldgevingsmethode is om neuroinflammatie in het centrale zenuwstelsel van een muismodel voor de ziekte van Parkinson te kwantificeren na perifere injectie van alfa-synucleïne-fibrillen. Deze methode kan helpen bepalen wanneer en in welke mate neuroinflammatie optreedt in muismodellen van neurodegeneratieve ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de neuroinflammatie niet-invasief en herhaaldelijk kan worden gemonitord totdat de muizen neurologische ziekteverschijnselen ontwikkelen.De implicatie van deze techniek is een diagnose van neurologische ziekten in het tiende uur, omdat een toename van bioluminescentie door zenuwentsteking neurologische ziekten niet alleen begeleidt, maar vaak ook voorafgaat. Begin met het correct anesthetiseren van het dier voor de operatie. Voer een teenknijptest uit en bevestig dat het dier het ledemaat niet terugtrekt, om aan te geven dat een chirurgisch vlak van anesthesie is bereikt.Breng oogsalf aan om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen. Gebruik hechttape om het dier zorgvuldig in rugligging op een warmteplaat te fixeren, met de kop richting de onderzoeker. Vul vervolgens ee

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

De ziekte van Parkinson is gerelateerd aan de blootstelling aan pesticiden. Hier laten we een methode om pesticiden met behulp van een maagsonde in de gewenste concentratie en een methode om het effect te analyseren in de alfa-synucleïne accumulatie in het enterisch zenuwstelsel te leveren.

Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan ​​om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan ​​om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte...

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

This video demonstrates the injection of alpha-synuclein fibrils into a mouse to induce neuroinflammation. The fibrils are injected intraperitoneally into a transgenic mouse expressing mutated alpha-synuclein proteins. Upon reaching the central nervous system, the fibrils enter neurons and induce aggregation of the mutated proteins. The aggregates spread to neighboring neurons, microglia, and astrocytes. Recognition of the aggregates triggers microglia to induce neuroinflammation, damaging the...

Induction of Neuroinflammation in Mice via Injection of Alpha-Synuclein Fibrils

Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the bioluminescence imaging of neuroinflammation in transgenic mice, showcasing luciferase-luciferin reactions in activated astrocytes. The protocol enables non-invasive quantification of astrocytic activation, aiding studies on CNS inflammation and therapeutic efficacy.

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Source: Schmitz, K., et al., Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the method for visualizing and monitoring Experimental Autoimmune Encephalomyelitis or EAE-induced inflammation in the optic nerve using bioluminescence imaging. It includes positioning the mouse, reagent injection, and capturing sequential images to monitor changes in bioluminescence over time.

Bioluminescence Imaging in an EAE Mouse Model

We beschrijven een niet-invasieve beeldvorming methode voor het onderscheiden van inflammatoire fasen. Systemische toediening van luminol onthult gebieden van acute ontsteking afhankelijk MPO-activiteit in neutrofielen. Daarentegen injectie lucigenine maakt visualisatie van chronische inflammatie afhankelijk Phox activiteit in macrofagen.

In vivo beeldvorming methode om acute en chronische ontsteking Onderscheid

De getoonde techniek voor in vivo bioluminescentie levende en nabije infrarood beeldvorming van optische neuritis en encefalitis bij de experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) model voor multiple sclerose in SJL / J muizen.

Bioluminescentie en nabij-infrarood beeldvorming van oogzenuwontsteking en hersenontsteking in de EAE Model van Multiple Sclerose in Muizen

Dit protocol beschrijft hoe hoge resolutie beeldvormende technieken zoals spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen van laser ophthalmoscopy kan worden gebruikt in kleine knaagdieren, met behulp van een oogheelkundige imaging platform systeem, om informatie te verkrijgen over netvlies dikte en microglial cel distributie, respectievelijk.

In Vivo Beeldvorming van Cx3cr1gfp/gfp Reporter muizen met spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen Laser Ophthalmoscopy

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Leer bioluminescentiebeeldvorming om neuro-inflammatie te kwantificeren in een muismodel voor Parkinson na perifere injectie van alfa-synucleine fibrillen. Deze niet-invasieve methode maakt vroegtijdige diagnose van neurologische ziekten mogelijk.

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

Meer video's verkennen