Chromatine-immunoprecipitatie

Chromatine-immunoprecipitatie, of “ChIP,” is een techniek die door onderzoekers wordt gebruikt om eiwit-DNA-interacties te beoordelen. Eiwitfactoren spelen een belangrijke rol bij de genexpressie; ze ordenen niet alleen DNA in chromosomen, maar binden ook aan specifieke DNA-sequenties—regulatieplaatsen genoemd—om expressie te activeren of onderdrukken. Tijdens ChIP wordt chromatine—dat bestaat uit DNA en de bijbehorende eiwitten—“geïmmunoprecipiteerd,” wat betekent dat het wordt geïsoleerd met behulp van antilichamen. Met deze methode kunnen onderzoekers beoordelen welke eiwitten zich associëren met welke DNA-sequenties.

In deze video bespreken we chromatine-modificaties en hun rol bij epigenetische regulatie, en hoe ChIP deze modificaties kan meten. We zullen dan een algemene procedure voor deze techniek beschrijven en tenslotte bespreken hoe wetenschappers ChIP vandaag de dag in onderzoek gebruiken.

Laten we beginnen met het beoordelen van wat chromatine-modificaties zijn en hoe ze met ChIP kunnen worden bestudeerd.

In eukaryoten wordt DNA in kernen opgeslagen door “gewikkeld” te worden rond eiwitcomplexen. Deze eiwitten zijn histonen, en elk DNA-gewikkeld histoncomplex wordt een “nucleosoom” genoemd. Genexpressie wordt gereguleerd door “nucleosoombezetting,” of of een stuk DNA in nucleosomen is verpakt. Getranskribeerd DNA bevindt zich meestal in “nucleosoomvrije” gebieden, die eiwitten toestaan zich te associëren met de regulatoire sites van een gen en RNA-polymerase in staat stellen om transcriptie uit te voeren.

Huidig bewijs suggereert dat veranderingen in chromatinestructuur die genexpressie reguleren, worden gemedieerd door chemische modificaties van histonen, meestal in hun vrij bewegende “staarten.” De meest voorkomende hiervan zijn acetyl-, methyl- en fosfaatgroepen die worden toegevoegd aan, of verwijderd uit, specifieke aminozuren, en deze verschillende histonmodificaties worden geassocieerd met verschillende niveaus of modi van genexpressie.

Bijvoorbeeld, de toevoeging van drie methylgroepen aan de 27e lysine-residu in histonsubeenheid H3—een modificatie genaamd H3K27me3—is gekoppeld aan gen-silencing. Alternatief, de H3K9ac-modificatie, waarbij een acetylgroep wordt toegevoegd aan het 9e lysine-residu op histon H3, is geassocieerd met genactivering.

Histone-modificaties worden verondersteld een rol te spelen in de epigenetische regulatie van genexpressie door gebieden van chromatine te markeren als “actief” of “stil.” Een mechanisme waarmee histonmodificaties worden aangenomen hun effecten uit te oefenen, is om transcriptiefactoren of chromatine “hermodellerings” enzymen aan te trekken, waarvan de laatste de posities van nucleosomen fysiek verplaatsen.

Met ChIP kunnen specifieke histonmodificaties worden gericht door antilichamen, die kunnen worden “omlaag getrokken” samen met het omringende DNA. Onderzoekers kunnen vervolgens PCR, microarrays of sequencing gebruiken om DNA-regio's te identificeren die zijn geassocieerd met histonmodificaties van belang. Door de gebruikte antilichamen tijdens ChIP te variëren, kan deze techniek ook helpen DNA-regio's te lokaliseren die door transcriptiefactoren en andere regulatoire eiwitten worden gebonden.

Nu je de principes achter ChIP kent, laten we een algemene procedure voor deze techniek doornemen.

Om te beginnen worden cellen van belang verzameld en behandeld met chemicaliën zoals formaldehyde, die werken als “cross-linking” reagentia en helpen eiwitten te hechten aan de DNA-sequenties waarmee ze geassocieerd zijn door de vorming van covalente bindingen tussen hen te vergemakkelijken. Er moet voorzichtig worden omgegaan met het “overbehandelen” van cellen met formaldehyde, omdat dit de mogelijkheid van antilichamen om hun doel-histonmodificaties in latere ChIP-stadia te herkennen, kan beïnvloeden. Om het cross-linken te stoppen, wordt glycine toegevoegd aan de formaldehydeoplossing waarmee cellen worden behandeld. De cellen worden vervolgens verzameld en gelyseerd om het chromatine vrij te maken.

Om chromatine te solubiliseren en de DNA-regio's die zich associëren met gemodificeerde histonen nauwkeurig te definiëren, wordt chromatine mechanisch “versneden” in kleinere stukken met behulp van geluidsgolven—een proces dat sonicatie wordt genoemd. Meestal proberen wetenschappers chromatinefragmenten van 200 tot 1000 basenparen in lengte te maken. Zodra chromatinefragmenten van de gewenste grootte zijn gegenereerd, wordt een antilichaam aan de oplossing toegevoegd en wordt de mengsel geïncubeerd om het antilichaam de tijd te geven om zijn doel-histonmodificatie te herkennen.

Magnetische kralen waaraan de antilichamen kunnen binden, worden vervolgens in het mengsel geïntroduceerd, waardoor de complexen van antilichamen en chromatine worden geïmmobiliseerd. De kralen worden verzameld met behulp van magnetische racks en meerdere keren gewassen om ongebonden chromatine of antilichamen weg te spoelen.

Om het chromatine eruit te laten komen, worden de kralen in een oplossing met het detergent SDS geplaatst en na het verzamelen van de kralen met een magneet, wordt het supernatant bewaard. Het enzym proteinase K wordt vervolgens aan deze oplossing toegevoegd om alle eiwitten, inclusief histonen, te degraderen, zodat het DNA-component van het chromatine kan worden geïsoleerd. Het resulterende DNA wordt vervolgens gezuiverd en geanalyseerd.

Laten we nu eens kijken naar hoe wetenschappers momenteel ChIP in hun laboratoria gebruiken.

Veel onderzoekers gebruiken ChIP om veranderingen in histonmodificaties te evalueren die worden vero