Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Het algemene doel van dit experiment is om twee methoden te vergelijken die worden gebruikt om hoogwaardig organellair DNA te isoleren, zowel plastid- als mitochondria-DNA uit plantenbladweefsel dat geschikt is voor next-generation sequencing. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de plantenbiologie, zoals de mate van organellaire diversiteit tussen taxa en hoe veranderingen in de sequentie of structuur van het organellaire genoom de ontwikkeling en stressrespons beïnvloeden. We zullen twee technieken vergelijken, de differentiële centrifugatiemethode die verrijkt voor één specifiek organellair type en de meta-fractioneringstechniek die totaal organellair DNA herstelt uit kleinere bevroren weefselmonsters.

De standaardprocedure voor het kweken van tarwezaailingen is om zaden in vermiculiet te planten, in vierkante potten met vier tot zes zaden per hoek. Breng de potten over naar een kas met een lichtcyclus van 16 uur. Geef de planten elke dag water.

Bemest de planten met een kwart theelepel korrelige 20-20-20 MPK-meststof bij ontkieming, en opnieuw zeven dagen na ontkieming. Voor de behandeling van tarwezaailingen, plant zaden en zorg voor planten zoals in de standaardprocedure. Maar plaats de potten in een donkere groeikamer.

Een alternatief voor het kweken van deze zaailingen in een donkere groeikamer is om de planten in de kas te bedekken, maar met goede ventilatie. De eerste stap in deze procedure is om de organellen te isoleren. Haal vijf gram vers weefsel en spoel het in koud, steriel water in een gekoelde beker op ijs.

Gebruikende schaar, snijd het bladweefsel in stukken van ongeveer één centimeter direct in een voorgekoelde 50 millimeter buis met twee keramische malende cilinders. Houd de monsters op ijs gedurende het hele proces. Om kruisbesmetting te voorkomen, is het belangrijk om de schaar tussen monsters te verwisselen.

Breng de monsters naar de afzuigkap en voeg 20 milliliter STE-buffer toe aan elke 50 milliliter buis. Plaats de monsters in voorgekoelde cryogene malende blokken in een weefselmalerig apparaat en maal de monsters gedurende 30 seconden bij 1.750 rotaties per minuut. Plaats de monsters ongeveer een minuut op ijs.

Roteer de monsterposities en maal nogmaals gedurende 30 seconden bij 1.750 rotaties per minuut. Breng de monsters terug naar de ijskoud. Voor elk monster, plaats een trechter in een schone 50 milliliter buis in ijs en plaats een laag filterdoek in de trechter.

Voorbereidt het filterdoek met vijf milliliter STE-buffer en bewaar de doorstroming. Giet het gehomogeniseerde weefsel in de trechter. Spoel de malende buis met 15 milliliter STE-buffer, sluit af en draai de buis om te spoelen wanden en deksel en giet de inhoud in de trechter.

Verwijder voorzichtig de keramische stenen en pers en wring het filterdoek uit in de trechter. Om kruisbesmetting te voorkomen, verwissel handschoenen tussen monsters. Wikkel de buisdoppen af met paraffinefolie om morsen te voorkomen.

Centrifugeer bij 2.000 x G, bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gebruik vervolgens een serologische pipette om voorzichtig het supernatant te aspireren zonder de pellet te verstoren en plaats het in een 50 milliliter hoge snelheid centrifugebuis met een strakke afdichtingsring. Plaats een kleine beker ijs op een weegschaal, scheur de schaal en weeg elk supernatant.

Gebruik STE-buffer om de buizen binnen 0,1 gram te balanceren en centrifugeer vervolgens bij 18.000 x G bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Wanneer de centrifugatie voltooid is, breng monsters terug naar de afzuigkap en gooi het supernatant weg. Voeg een milliliter ST-buffer toe aan de pellet en resuspendeer voorzichtig met een zachte verfkwast.

Voeg 24 milliliter ST-buffer toe om een ​​eindvolume van 25 milliliter te krijgen. Draai voorzichtig de verfkwast rond in een suspensie om te mengen, en druk vervolgens de verfkwast aan de zijkant van een buis om alle vloeistof te verwijderen voordat de verfkwast wordt verwijderd. Na het balanceren van de buizen, centrifugeer bij 18.000 x G bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Tijdens deze centrifugatie, bereid DNA's 1 oplossing zoals beschreven in het tekstprotocol en verdeel 200 microliters naar een 1,5 milliliter buis per monster. Wanneer de centrifugatie voltooid is, gooi het supernatant weg en dep de buis. Voeg aan elke hoge snelheid centrifugebuis 300 microliters STE-buffer toe en resuspendeer het pellet met een zachte verfkwast.

Plaats de verfkwast in de eerder bereide 1,5 milliliter buis met 200 microliters van DNA's 1 oplossing en draai de verfkwast om eventueel resterend pellet dat in de borstel vastzit te verwijderen. Pipetteer de DNA's 1 oplossing in de hoge snelheid centrifugebuis en draai voorzichtig om te mengen. Wikkel paraffinefolie rond de bovenkant van elke buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een waterbad.

Tijdens de incubatie, meng voorzichtig door te draaien. Gebruik een pipettentip met een brede opening en pipetteer voorzichtig het pelletmengsel uit de buis en plaats het in een 1,5 milliliter lage binding buis. Voeg 500 microliters van 400 millimolair EDTA, pH 8,0 toe aan de hoge snelheid centrifugebuis.

Pipetteer voorzichtig om het resterende pellet volledig te verwijderen en breng het EDTA over in de lage binding buis met het pelletmengsel. Meng voorzichtig door omkeren. Centrifugeer bij 18.000 x G, bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Gooi vervolgens het supernatant weg, dep elke buis en gebruik het pellet onmiddellijk voor DNA-isolatie. In deze methode is organellair DNA verrijkt uit totaal genomisch DNA dat werd geëxtraheerd met behulp van commerciële DNA-extractiekolommen. Bereid het vereiste aantal MBD2 FC-eiwit gebonden magnetische kralen voor, volgens de instructies van de fabrikant en schaal de reacties om tussen één en twee microgram van totaal input DNA te gebruiken.

In deze demonstratie is 160 microliters kralen