Recombineering en Gen Targeting
Klonen door homologe recombinatie, of recombineren, heeft de mogelijkheden van onderzoekers om hoogwaardige genetische ingenieurswetenschappen uit te voeren enorm verbeterd. Klassieke moleculaire klonen vereist het verteren van vectoren en invoegsels met dezelfde restrictie-enzymen om compatibele uiteinden voor "recombinatie" te genereren, maar vooral wanneer je een gebied uit een langere sequentie wilt isoleren, zoals een stuk genomisch DNA, zijn er niet altijd restrictie-enzymen die uniek rond het gebied van belang snijden, en niet binnen het gebied of elders in de sequentie. Door de behoefte aan deze restrictieplaatsen te vermijden, biedt recombineren een veel efficiëntere en kosteneffectievere manier om genetische ingenieursconstructen te maken.
In deze video zullen we de principes van genetische recombinatie introduceren, een algemeen protocol voor het recombineren van een gen-targeting vector verstrekken en verschillende toepassingen van deze technologieën bespreken.
Laten we eerst bespreken wat recombinatie is en hoe het kan worden toegepast.
Genetische recombinatie omvat de uitwisseling van informatie tussen DNA-moleculen. Bij "homologe recombinatie" worden relatief grote stukken vergelijkbare of identieke DNA-sequenties uitgewisseld. Cellen gebruiken dit proces om dubbele strengbreuken te repareren, en seksueel reproducerende eukaryoten voeren dit ook uit tussen homologe chromosomen tijdens meiose om genetische diversiteit te verhogen.
Homologe recombinatie is geharnasd voor een aantal experimentele doeleinden, inclusief de modificatie van specifieke endogene loci in cellen - genoemd "gen targeting". Het wordt ook toegepast op de ingenieurswetenschap van genetische constructen, een proces genaamd "recombineren", wat vooral nuttig is voor het aanbrengen van wijzigingen in grote stukken DNA voor targeting naar het genoom van een organisme. Hiervoor kunnen onderzoekers gebruik maken van "genomische bibliotheken", of sets van vectoren die elk lange genomische DNA-fragmenten bevatten. Verschillende soorten bibliotheken met verschillende capaciteiten, meestal vermeerderd in bacteriële klonen, zijn gemaakt en kunnen worden besteld bij commerciële of non-profit repositories. Een van de meest gebruikte soorten genomische bibliotheek wordt een bacteriële artificiële chromosoom of BAC genoemd, die een insertgrootte van 150-350 kilobasen kan dragen.
Om een construct te recombineren, hebben wetenschappers een organisme nodig waarin homologe recombinatie optreedt. De gist Saccharomyces cerevisiae is van nature "recombinatie-bekwaam" en kan gemakkelijk homologe recombinatie uitvoeren tussen een vector en invoegsel. Een ander veel gebruikt systeem maakt gebruik van de "Red"-eiwitten van bacteriofaag lambda, die wordt gereconstitueerd in de bacterie E. coli. Vectoren kunnen worden gecombineerd in eerder gevestigde Red-uitdrukkende bacteriestammen, of een plasmide dat Red-systeemcomponenten codeert kan worden co-getransformeerd met de recombineersubstraten in de bacterie.
Nu gaan we een protocol doorlopen om een gen-targeting vector te maken door recombineren.
Het doel van dit protocol is om een genetisch gemodificeerde muis te creëren met gerichte veranderingen in een specifiek gen. In het kort, gewenste modificaties aan het gen van belang worden gemaakt in een BAC; de gemodificeerde sequentie wordt "opgehaald" in een targeting vector, en deze vector wordt getransfecteerd in embryonale stamcellen voor gen-targeting. De stamcellen kunnen vervolgens worden gebruikt om het genetisch gemodificeerde dier te genereren. Raadpleeg voor instructies over deze laatste procedure de JoVE Science Education video "Genetische ingenieurswetenschappen van modelorganismen".
Om te beginnen, wordt een BAC-kloning geïdentificeerd en besteld die de genomische sequentie van belang bevat. Vervolgens worden de homologiearmen, of oligonucleotiden die de 30-50 basepair homologe gebieden bevatten, ontworpen. Deze oligonucleotiden worden gebruikt als primers in PCR-reacties om de DNA "cassettes" te genereren die worden gebruikt om het gen van belang te wijzigen. Deze cassettes bevatten doorgaans, bijvoorbeeld, antibioticaresistentiegenen die kunnen fungeren als selectiemarkeringen, die gemakkelijk kunnen worden versterkt vanuit veel publiek beschikbare plasmiden. De BAC-bacterieklon wordt vervolgens getransformeerd, bijvoorbeeld door elektroporatie, met een plasmide dat de Red-systeemcomponenten codeert, gevolgd door de cassettes met homologiearmen. De bacteriën worden vervolgens geïncubeerd bij de juiste temperatuur om recombinatie te induceren.
Om de gemodificeerde sequentie uit de BAC te herstellen, wordt een "opvangkader" vector gelinealiseerd en versterkt met behulp van primers die homologiearmen bevatten die verschillende kilobasen rond de plaats van modificatie bedekken. Dit vectorkader wordt getransformeerd in de BAC-bacterieklon, en recombineren wordt opnieuw geïnduceerd. De vector zal "gap-repareerd" worden door "het opvragen" van de juiste sequentie uit de BAC. Dit resulteert in een gen-targeting vector die de gemodificeerde sequentie van belang bevat, evenals gebieden die homoloog zijn aan genomisch DNA rond de gemodificeerde sequentie. Deze vector kan vervolgens worden gezuiverd, gelinealiseerd en geïntroduceerd in embryonale stamcellen waarbij de endogene homologe recombinatiemachinerie de gemodificeerde sequentie zal targeten naar het corresponderende locus, waardoor het gastheergеноom wordt gewijzigd.
Laten we nu een aantal toepassingen van recombinatie-gebaseerde ingenieurstechnieken bekijken.
Eerst kunnen onderzoekers recombineren gebruiken om snel en gemakkelijk het bacteriële genoom te ingenieuren, bijvoorbeeld om eiwitcomplexen te bestuderen. Hier werd een cassette ontworpen die een sequentieel peptide-affiniteitsmerker codeert, evenals een kanamycine-resistentieselectiemarker, die in de 3¢ eind van het gen van belang zou worden gecombineerd. Deze vector werd vervolgens geïntroduceerd in Red "recombinatie-bekwame" E. coli, en succesvolle recombinanten werden geïsoleerd met behulp van selectieve media. De getagde eiwitcomplexen werden biochemisch gezuiverd met behulp van eiwitten die sterk aan de tags binden, en geanalyseerd door massaspectrometrie om de interactiepartners van het eiwit van belang te identificeren.
Recombineren en gen targeting kunnen ook worden gebruikt om het gen
Een van de meest gebruikte hulpmiddelen in de moderne biologie is moleculaire klonen met restrictie-enzymen, die compatibele uiteinden creëren tussen…
Klonen door homologe recombinatie, of recombineren, heeft de mogelijkheden van onderzoekers om hoogwaardige genetische ingenieurswetenschappen uit te voeren enorm verbeterd. Klassieke moleculaire klonen vereist het verteren van vectoren en invoegsels met dezelfde restrictie-enzymen om compatibele uiteinden voor "recombinatie" te genereren, maar vooral wanneer je een gebied uit een langere sequentie wilt isoleren, zoals een stuk genomisch DNA, zijn er niet altijd restrictie-enzymen die uniek rond het gebied van belang snijden, en niet binnen het gebied of elders in de sequentie. Door de behoefte aan deze restrictieplaatsen te vermijden, biedt recombineren een veel efficiëntere en kosteneffectievere manier om genetische ingenieursconstructen te maken.
In deze video zullen we de principes van genetische recombinatie introduceren, een algemeen protocol voor het recombineren van een gen-targeting vector verstrekken en verschillende toepassingen van deze technologieën bespreken.
Laten we eerst bespreken wat recombinatie is en hoe het kan worden toegepast.
Genetische recombinatie omvat de uitwisseling van informatie tussen DNA-moleculen. Bij "homologe recombinatie" worden relatief grote stukken vergelijkbare of identieke DNA-sequenties uitgewisseld. Cellen gebruiken dit proces om dubbele strengbreuken te repareren, en seksueel reproducerende eukaryoten voeren dit ook uit tussen homologe chromosomen tijdens meiose om genetische diversiteit te verhogen.
Homologe recombinatie is geharnasd voor een aantal experimentele doeleinden, inclusief de modificatie van specifieke endogene loci in cellen - genoemd "gen targeting". Het wordt ook toegepast op de ingenieurswetenschap van genetische constructen, een proces genaamd "recombineren", wat vooral nuttig is voor het aanbrengen van wijzigingen in grote stukken DNA voor targeting naar het genoom van een organisme. Hiervoor kunnen onderzoekers gebruik maken van "genomische bibliotheken", of sets van vectoren die elk lange genomische DNA-fragmenten bevatten. Verschillende soorten bibliotheken met verschillende capaciteiten, meestal vermeerderd in bacteriële klonen, zijn gemaakt en kunnen worden besteld bij commerciële of non-profit repositories. Een van de meest gebruikte soorten genomische bibliotheek wordt een bacteriële artificiële chromosoom of BAC genoemd, die een insertgrootte van 150-350 kilobasen kan dragen.
Om een construct te recombineren, hebben wetenschappers een organisme nodig waarin homologe recombinatie optreedt. De gist Saccharomyces cerevisiae is van nature "recombinatie-bekwaam" en kan gemakkelijk homologe recombinatie uitvoeren tussen een vector en invoegsel. Een ander veel gebruikt systeem maakt gebruik van de "Red"-eiwitten van bacteriofaag lambda, die wordt gereconstitueerd in de bacterie E. coli. Vectoren kunnen worden gecombineerd in eerder gevestigde Red-uitdrukkende bacteriestammen, of een plasmide dat Red-systeemcomponenten codeert kan worden co-getransformeerd met de recombineersubstraten in de bacterie.
Nu gaan we een protocol doorlopen om een gen-targeting vector te maken door recombineren.
Het doel van dit protocol is om een genetisch gemodificeerde muis te creëren met gerichte veranderingen in een specifiek gen. In het kort, gewenste modificaties aan het gen van belang worden gemaakt in een BAC; de gemodificeerde sequentie wordt "opgehaald" in een targeting vector, en deze vector wordt getransfecteerd in embryonale stamcellen voor gen-targeting. De stamcellen kunnen vervolgens worden gebruikt om het genetisch gemodificeerde dier te genereren. Raadpleeg voor instructies over deze laatste procedure de JoVE Science Education video "Genetische ingenieurswetenschappen van modelorganismen".
Om te beginnen, wordt een BAC-kloning geïdentificeerd en besteld die de genomische sequentie van belang bevat. Vervolgens worden de homologiearmen, of oligonucleotiden die de 30-50 basepair homologe gebieden bevatten, ontworpen. Deze oligonucleotiden worden gebruikt als primers in PCR-reacties om de DNA "cassettes" te genereren die worden gebruikt om het gen van belang te wijzigen. Deze cassettes bevatten doorgaans, bijvoorbeeld, antibioticaresistentiegenen die kunnen fungeren als selectiemarkeringen, die gemakkelijk kunnen worden versterkt vanuit veel publiek beschikbare plasmiden. De BAC-bacterieklon wordt vervolgens getransformeerd, bijvoorbeeld door elektroporatie, met een plasmide dat de Red-systeemcomponenten codeert, gevolgd door de cassettes met homologiearmen. De bacteriën worden vervolgens geïncubeerd bij de juiste temperatuur om recombinatie te induceren.
Om de gemodificeerde sequentie uit de BAC te herstellen, wordt een "opvangkader" vector gelinealiseerd en versterkt met behulp van primers die homologiearmen bevatten die verschillende kilobasen rond de plaats van modificatie bedekken. Dit vectorkader wordt getransformeerd in de BAC-bacterieklon, en recombineren wordt opnieuw geïnduceerd. De vector zal "gap-repareerd" worden door "het opvragen" van de juiste sequentie uit de BAC. Dit resulteert in een gen-targeting vector die de gemodificeerde sequentie van belang bevat, evenals gebieden die homoloog zijn aan genomisch DNA rond de gemodificeerde sequentie. Deze vector kan vervolgens worden gezuiverd, gelinealiseerd en geïntroduceerd in embryonale stamcellen waarbij de endogene homologe recombinatiemachinerie de gemodificeerde sequentie zal targeten naar het corresponderende locus, waardoor het gastheergеноom wordt gewijzigd.
Laten we nu een aantal toepassingen van recombinatie-gebaseerde ingenieurstechnieken bekijken.
Eerst kunnen onderzoekers recombineren gebruiken om snel en gemakkelijk het bacteriële genoom te ingenieuren, bijvoorbeeld om eiwitcomplexen te bestuderen. Hier werd een cassette ontworpen die een sequentieel peptide-affiniteitsmerker codeert, evenals een kanamycine-resistentieselectiemarker, die in de 3¢ eind van het gen van belang zou worden gecombineerd. Deze vector werd vervolgens geïntroduceerd in Red "recombinatie-bekwame" E. coli, en succesvolle recombinanten werden geïsoleerd met behulp van selectieve media. De getagde eiwitcomplexen werden biochemisch gezuiverd met behulp van eiwitten die sterk aan de tags binden, en geanalyseerd door massaspectrometrie om de interactiepartners van het eiwit van belang te identificeren.
Recombineren en gen targeting kunnen ook worden gebruikt om het gen
Klonen door homologe recombinatie, of recombineren, heeft de mogelijkheden van onderzoekers om hoogwaardige genetische ingenieurswetenschappen uit te voeren enorm verbeterd. Klassieke moleculaire klonen vereist het verteren van vectoren en invoegsels met dezelfde restrictie-enzymen om compatibele uiteinden voor "recombinatie" te genereren, maar vooral wanneer je een gebied uit een langere sequentie wilt isoleren, zoals een stuk genomisch DNA, zijn er niet altijd restrictie-enzymen die uniek rond het gebied van belang snijden, en niet binnen het gebied of elders in de sequentie. Door de behoefte aan deze restrictieplaatsen te vermijden, biedt recombineren een veel efficiëntere en kosteneffectievere manier om genetische ingenieursconstructen te maken.
In deze video zullen we de principes van genetische recombinatie introduceren, een algemeen protocol voor het recombineren van een gen-targeting vector verstrekken en verschillende toepassingen van deze technologieën bespreken.
Laten we eerst bespreken wat recombinatie is en hoe het kan worden toegepast.
Genetische recombinatie omvat de uitwisseling van informatie tussen DNA-moleculen. Bij "homologe recombinatie" worden relatief grote stukken vergelijkbare of identieke DNA-sequenties uitgewisseld. Cellen gebruiken dit proces om dubbele strengbreuken te repareren, en seksueel reproducerende eukaryoten voeren dit ook uit tussen homologe chromosomen tijdens meiose om genetische diversiteit te verhogen.
Homologe recombinatie is geharnasd voor een aantal experimentele doeleinden, inclusief de modificatie van specifieke endogene loci in cellen - genoemd "gen targeting". Het wordt ook toegepast op de ingenieurswetenschap van genetische constructen, een proces genaamd "recombineren", wat vooral nuttig is voor het aanbrengen van wijzigingen in grote stukken DNA voor targeting naar het genoom van een organisme. Hiervoor kunnen onderzoekers gebruik maken van "genomische bibliotheken", of sets van vectoren die elk lange genomische DNA-fragmenten bevatten. Verschillende soorten bibliotheken met verschillende capaciteiten, meestal vermeerderd in bacteriële klonen, zijn gemaakt en kunnen worden besteld bij commerciële of non-profit repositories. Een van de meest gebruikte soorten genomische bibliotheek wordt een bacteriële artificiële chromosoom of BAC genoemd, die een insertgrootte van 150-350 kilobasen kan dragen.
Om een construct te recombineren, hebben wetenschappers een organisme nodig waarin homologe recombinatie optreedt. De gist Saccharomyces cerevisiae is van nature "recombinatie-bekwaam" en kan gemakkelijk homologe recombinatie uitvoeren tussen een vector en invoegsel. Een ander veel gebruikt systeem maakt gebruik van de "Red"-eiwitten van bacteriofaag lambda, die wordt gereconstitueerd in de bacterie E. coli. Vectoren kunnen worden gecombineerd in eerder gevestigde Red-uitdrukkende bacteriestammen, of een plasmide dat Red-systeemcomponenten codeert kan worden co-getransformeerd met de recombineersubstraten in de bacterie.
Nu gaan we een protocol doorlopen om een gen-targeting vector te maken door recombineren.
Het doel van dit protocol is om een genetisch gemodificeerde muis te creëren met gerichte veranderingen in een specifiek gen. In het kort, gewenste modificaties aan het gen van belang worden gemaakt in een BAC; de gemodificeerde sequentie wordt "opgehaald" in een targeting vector, en deze vector wordt getransfecteerd in embryonale stamcellen voor gen-targeting. De stamcellen kunnen vervolgens worden gebruikt om het genetisch gemodificeerde dier te genereren. Raadpleeg voor instructies over deze laatste procedure de JoVE Science Education video "Genetische ingenieurswetenschappen van modelorganismen".
Om te beginnen, wordt een BAC-kloning geïdentificeerd en besteld die de genomische sequentie van belang bevat. Vervolgens worden de homologiearmen, of oligonucleotiden die de 30-50 basepair homologe gebieden bevatten, ontworpen. Deze oligonucleotiden worden gebruikt als primers in PCR-reacties om de DNA "cassettes" te genereren die worden gebruikt om het gen van belang te wijzigen. Deze cassettes bevatten doorgaans, bijvoorbeeld, antibioticaresistentiegenen die kunnen fungeren als selectiemarkeringen, die gemakkelijk kunnen worden versterkt vanuit veel publiek beschikbare plasmiden. De BAC-bacterieklon wordt vervolgens getransformeerd, bijvoorbeeld door elektroporatie, met een plasmide dat de Red-systeemcomponenten codeert, gevolgd door de cassettes met homologiearmen. De bacteriën worden vervolgens geïncubeerd bij de juiste temperatuur om recombinatie te induceren.
Om de gemodificeerde sequentie uit de BAC te herstellen, wordt een "opvangkader" vector gelinealiseerd en versterkt met behulp van primers die homologiearmen bevatten die verschillende kilobasen rond de plaats van modificatie bedekken. Dit vectorkader wordt getransformeerd in de BAC-bacterieklon, en recombineren wordt opnieuw geïnduceerd. De vector zal "gap-repareerd" worden door "het opvragen" van de juiste sequentie uit de BAC. Dit resulteert in een gen-targeting vector die de gemodificeerde sequentie van belang bevat, evenals gebieden die homoloog zijn aan genomisch DNA rond de gemodificeerde sequentie. Deze vector kan vervolgens worden gezuiverd, gelinealiseerd en geïntroduceerd in embryonale stamcellen waarbij de endogene homologe recombinatiemachinerie de gemodificeerde sequentie zal targeten naar het corresponderende locus, waardoor het gastheergеноom wordt gewijzigd.
Laten we nu een aantal toepassingen van recombinatie-gebaseerde ingenieurstechnieken bekijken.
Eerst kunnen onderzoekers recombineren gebruiken om snel en gemakkelijk het bacteriële genoom te ingenieuren, bijvoorbeeld om eiwitcomplexen te bestuderen. Hier werd een cassette ontworpen die een sequentieel peptide-affiniteitsmerker codeert, evenals een kanamycine-resistentieselectiemarker, die in de 3¢ eind van het gen van belang zou worden gecombineerd. Deze vector werd vervolgens geïntroduceerd in Red "recombinatie-bekwame" E. coli, en succesvolle recombinanten werden geïsoleerd met behulp van selectieve media. De getagde eiwitcomplexen werden biochemisch gezuiverd met behulp van eiwitten die sterk aan de tags binden, en geanalyseerd door massaspectrometrie om de interactiepartners van het eiwit van belang te identificeren.
Recombineren en gen targeting kunnen ook worden gebruikt om het gen
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
1:05
Principles of Homologous Recombination
3:20
Recombineering a Gene Targeting Vector
5:54
Applications
8:28
Summary