Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van

Het algemene doel van deze bemonsteringsmethode is het oogsten van metabolietmonsters van Staphylococcus aureus voor daaropvolgende kwantificering via tandem vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Ons laboratorium is geïnteresseerd in het bestuderen van de interactie tussen metabolisme en pathogenese in bacteriën die relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Op dit moment gebruiken we de humane opportunistische pathogeen Staphylococcus aureus als modelorganisme.

Een belangrijke vraag die we willen beantwoorden is hoe bacteriën hun fysiologie en pathogeniteit aanpassen wanneer zij worden geconfronteerd met nutriëntendepletie tijdens een infectie van de gastheer. Deze techniek is voordelig omdat deze een momentopname biedt van de distributie van specifieke metabolieten over de vele metabole routes in actief groeiende cellen, met minimale verstoring van hun fysiologische toestand. Begin met het uitplaten van de betreffende S.aureus-stammen voor isolatie op tryptic soy agar vanuit de bevroren glycerolstock.

Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 16-24 uur. Inoculeer de volgende dag 4 mL tryptic soy broth, of TSB, in steriele glazen incubatiebuisjes met enkele kolonies van elke stam. Incubeer de culturen, schuin geplaatst met rotatie, bij 37 °C gedurende 16-20 uur.

Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid van de culturen te meten bij 600 nanometer, afgekort als OD600. Verdun de cellen op basis van deze meting tot een OD600 van 0,05 in 50 mL steriel TSB-medium, in 250 mL Delong-kolven. Incubeer de culturen bij 37 °C in een warmtebad met schudden op 280 rpm.

Neem elke 30 minuten OD600-metingen. Naarmate de optische dichtheden toenemen, kan het noodzakelijk worden om de culturen te verdunnen met TSB, zodat ze binnen het lineaire absorptiebereik van de spectrophotometer blijven. Terwijl de cellen groeien, bereidt u de extractiebufferoplossingen vers met reagentia van de hoogst beschikbare zuiverheid, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Wanneer de culturen een OD600 bereiken tussen 0,8 en 1,0, subcultiveer deze dan in 50 mL vers voorverwarmd TSB tot een OD600 van 0,01 tot 0,05, en herhaal de incubatie- en meetstappen. Bereid een bed van verbrijzeld droogijs voor in een geschikt vat, zoals een glazen schaal, ijsemmer of koelbox. Wanneer de optische dichtheden van de culturen het gewenste oogstpunt naderen, voeg dan 1 mL quenching-oplossing toe aan een onbehandelde petrischaal van 35 mm en koel deze minimaal 5 minuten voor op droogijs.

Voor onze doeleinden is het gewenste oogstpunt een optische dichtheid van ongeveer 0,4 tot 0,5. Dit kan echter worden aangepast, afhankelijk van de experimentele doelen. Plaats vervolgens een filterfrit van roestvrij staal in een rubberen stop en plaats deze bovenop een vacuümkolf die is aangesloten op een huisvacuüm of vacuumpomp.

Schakel het vacuüm in en plaats een gemengd cellulose-estermembraan bovenop. Gebruik een filter met dezelfde diameter als de frit om ervoor te zorgen dat alle cellen worden opgevangen. Het is van cruciaal belang om de cellen zo snel mogelijk op te vangen en de metabole activiteit te stoppen, zodat er een momentopname wordt verkregen van de metabole abundanties onder een bepaalde conditie.

Zelfs kleine vertragingen kunnen de steady-state fysiologie van de cellen beïnvloeden. Gebruik bij een OD600 tussen 0,4 en 0,5 een serologische pipet om 13 mL cultuur uit de kolf te verwijderen. Breng het monster onmiddellijk aan op het filter.

Nadat het volledige monster is gefiltreerd, spoelt u het filter onmiddellijk met maximaal 5 mL ijskoud PBS om medium-geassocieerde metabolieten weg te wassen. Koppel vervolgens het vacuüm los en gebruik een steriele pincet om het filter uit de frit te verwijderen. Plaats het filter omgekeerd in de vooraf gekoelde quench-oplossing.

Incubeer het filter in de quench-oplossing op droogijs gedurende ten minste 20 minuten. Keer het filter met de steriele pincet om in de petrischaal en gebruik een micropipet om de cellen van het membraan in de quench-oplossing te spoelen. Resuspendeer de cellen in de quench-oplossing en breng de celsuspensie vervolgens over naar een steriele, schokbestendige buis van 2 mL die ongeveer 100 microliters 0,1 mm silicakralen bevat.

Bewaar dit op droogijs of bij 80 °C. Om te beginnen met de extractie van metabolieten, ontdooi eerst de monsters op nat ijs. Disrupt vervolgens de cellen in een homogenisator met vier bursts van 30 seconden bij 6000 rpm, met koelperiodes van twee minuten op droogijs tussen de cycli.

Centrifugeer de lysaten gedurende 15 minuten op maximale snelheid in een vooraf gekoelde microcentrifugebuis. Draag na centrifugatie het supernatant over naar een schone microcentrifugebuis. Gebruik een micropipet om een klein deel van het monster over te brengen naar een microcentrifugebuis voor de kwantificering van het residuele peptidegehalte, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bewaar het restant van het monster bij 80 graden Celsius. Raadpleeg het tekstprotocol voor de analyse van de metabolieten via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. De CodY-nullmutant werd gebruikt om de uitputting van vertakt-keten aminozuren te onderzoeken, aangezien het CodY-eiwit de expressie van tientallen genen aanpast als reactie op de daling in de concentratie van deze voedingsstoffen.

De codY-mutatie heeft weinig effect op de groeisnelheid van S.aureus-cellen. De daling in optische dichtheid bij het 3-uursmerk duidt op de terugverdunningsstap, die het aantal celdelingen vóór de oogst verhoogt en diverse moleculen verwatert die zich tijdens de nachtelijke groei ophopen. Een RNA-sequentieanalyse van de transcriptomen van de twee stammen laat significante veranderingen zien in de expressie van genen die betrokken zijn bij de synthese van aminozuren uit de aspartaatfamilie.

Hier geven de getallen onder de gennamen de factor van verandering in expressie aan in een codY-nullmutant, vergeleken met de wildtype-stam. Na LC-MS-kwantificering van de geëxtraheerde metabolieten werden de abundanties tussen de twee stammen vergeleken. Bij het focussen op enkele verbindingen die gerelateerd zijn aan de aspartaatfamilie van aminozuren, is te zien dat de abundanties van precursoren, zoals aspartaat en O-acetylhomoserine, afgenomen zijn in de codY-mutant.

Omgekeerd zijn eindproducten zoals threonine en isoleucine toegenomen. Hier geeft de stippellijn de drempelwaarde aan voor veranderingen in overvloed voor dit experiment. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u metabolieten uit Staphylococcus aureus kunt oogsten voor kwantificering via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie.

Dit protocol is met aanpassingen ook geschikt voor het oogsten van metabolieten uit andere bacteriële soorten. Omdat bacteriën reageren op dynamische omgevingen, is het belangrijk om de filtratie- en wasstappen snel uit te voeren om potentiële fysiologische veranderingen die door bemonstering worden opgewekt te minimaliseren. Veranderingen kunnen ook worden geminimaliseerd door de frit en PBS koud te houden tijdens de bemonstering.