Name: Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer metabolietextractie uit Staphylococcus aureus voor metaboloomanalyse met vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie. Deze methode onthult bacteriële metabole aanpassingen tijdens voedingsstoffentekort.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels gefinancierd door een NIH Pathway to Independence Award (verlenen GM 099.893) en de faculteit opstarten fondsen om SRB, evenals een Research Project Grant (toekennen GM 042.219). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en de interpretatie, of het besluit om het werk in te zenden voor publicatie.

1. Voorbereiding van de Buffer Solutions <ol><li> Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door verdunning van een voorraadoplossing van 10x PBS tot een eindconcentratie van 1 x met ultrazuiver (gedestilleerd en gedeïoniseerd) water. </li><li> Bereid quenching oplossing combineert 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrazuiver H2O en 19 pl (0,1 mM eindconcentratie) mierenzuur. </li><li> Bereid LC-MS oplosmiddel A door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) met ultrazuiver water. </li><li> Bereid LC-MS oplosmiddel B door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) acetonitril. LET OP: Alle oplossingen moeten worden bereid met behulp van de hoogste zuiverheidsgraad reagentia beschikbaar (in het algemeen high-performance vloeistofchromatografie graad). Oplossingen moeten vers voor elk experiment worden voorbereid en opgeslagen op ijs voorafgaand aan het gebruik. </li></ol> 2. Vaststelling van Steady-state S. aureus Growth <ol><li> Streak S. aureus stammen van belang zijn voor isolatie op tryptische soja-agar (TSA) uit een bevroren glycerol voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16-24 uur. </li><li> Beënten van 4 ml tryptische soja bouillon (TSB) of een ander geschikt medium in steriele glazen incubatiebuizen met enkele kolonies van elke stam. Incubeer schuin (70 ° hoek ~) met rotatie bij 60 omwentelingen per minuut (rpm) bij 37 ° C gedurende 16-20 uur. OPMERKING: Overnacht kweken zijn gevoelig voor zuurstof verlopen bij gebruik van standaard werkwijzen, waaronder de in stap 2.2 beschreven, waarbij de cellulaire fysiologie beïnvloeden. Derhalve maken we een meerdere back-verdunning strategie biologische steady state verzekeren (zie stap 2,4-3,2, hieronder). </li><li> Met een spectrofotometer om de optische dichtheid van de kweken te meten van stap 2,2 bij 600 nm (OD 600). Gebruik steriel medium als een optische referentie (leeg). Deze cellen verdund tot een OD 600 van 0,05 in 50 ml steriele TSB-medium (voorverwarmd tot 37 ° C) in afzonderlijke 250 mL DeLong flessen. </li><li> Incuverminder de kweken bij 37 ° C in een waterbad onder schudden bij 280 rpm. </li><li> Elke 30 minuten, neem OD600 metingen; Als optische dichtheden toenemen, kan het nodig zijn de kweken verdunnen met TSB zodat ze binnen het lineaire bereik van de absorptie spectrofotometer blijven. </li><li> Bij culturen uit stap 2.5 komen tot een OD600 van 0,8-1,0 ~, subcultuur ze in 50 ml 37 ° C TSB tot een OD 600 van 0,01-0,05 en herhaal de stappen 2.4 en 2.5. </li></ol> 3. Sample Collection Setup <ol><li> Bereid een bed van gemalen droog ijs in een geschikt vat (bijvoorbeeld glazen schaal, ijsemmer of koeler). </li><li> Wanneer de optische dichtheid van de kweken naderen het gewenste punt oogst, voeg 1 ml blussen oplossing tot een 35 mm petrischaal onbehandeld en pre-koel op droogijs ≥5 min. OPMERKING: De &quot;gewenste oogst point&quot; zal variëren afhankelijk van experimentele doelen. Bijvoorbeeld, als men m onderzoekenetabolites tijdens aërobe groei kengetallen van deze toestand omvatten acetaat excretie en opnieuw assimilatie van het acetaat tijdens de post-exponentiële groeifase 32, 33. In het algemeen dient dit punt binnen een bepaald groeistadium (bijvoorbeeld exponentiële fase). De specifieke OD600 waarden die met deze fase kan variëren tussen verschillende bacteriestammen en groeimedia. </li><li> Plaats een roestvrij stalen filter frit (voorgekoeld tot -20 ° C) in een rubberstop en plaats deze bovenop een vacuum kolf bevestigd aan een vacuümbron of vacuümpomp. </li><li> Breng het vacuüm en plaats een gemengde cellulose-ester membraan (0,22 urn poriegrootte) geplaatst. Opmerking: Het is cruciaal om een ​​filter te gebruiken met een diameter gelijk aan die van de frit en goed Deze filter zodat het monster wordt getrokken door het filter in plaats van over de rand. Bevochtigen van het membraan met ijskoud, steriel H2O kan helpenmet het positioneren van het membraan. </li></ol> 4. De steekproef Harvest <ol><li> Bij een OD600 van 0,4-0,5 ~ Gebruik een serologische pipet 13 ml kweek uit de kolf te verwijderen en het monster op het filter. </li><li> Nadat het gehele monster werd gefilterd, spoel de filter met ≥5 ml ijskoude PBS tot middelgrote geassocieerde metabolieten wegspoelen. </li><li> Neem de vacuümslang en gebruik een paar steriele pincet om het filter uit de frit verwijderd. Keren de filter (cel naar beneden) in de voorgekoeld afschrikoplossing. Opmerking: Het is belangrijk om de bovengenoemde stappen snel uit te voeren (dat wil zeggen binnen enkele seconden) en zodra de vloeistof is verwijderd om de snelle afkoeling van de cellen te waarborgen het stoppen metabolische activiteit. </li><li> Incubeer de filter in uitwasoplossing op droog ijs gedurende ≥20 min. </li><li> Met steriele pincet Draai het filter (cel naar boven) in de petrischaal en gebruik een micropipet om de cellen af ​​te spoelen aan Thij membraan in de demping oplossing. </li><li> Geresuspendeerd de cellen in uitwasoplossing en breng de celsuspensie in een steriele 2 mL slagvaste buis met -100 pl 0,1 mm silicapareltjes. Bewaar deze op droog ijs of bij -80 ° C. </li></ol> 5. Extractie Afbraakproduct <ol><li> Dooi samples op nat ijs en verstoren de cellen in een homogenisator met vier 30 s uitbarstingen op 6000 rpm, 2 min koelperioden op droogijs tussen cycli. </li><li> Verduidelijking van de lysaten gedurende 15 minuten in een vooraf gekoelde, gekoelde microcentrifuge bij topsnelheid (dwz 18.213 xg bij ≤4 ° C). </li><li> Breng het supernatant in een schone microcentrifugebuis. </li><li> Met behulp van een micropipet, dragen een klein gedeelte van het monster naar een microcentrifugebuis voor de kwantificering van residuele peptidegehalte in stap 6; Bewaar de rest bij -80 ° C. Opmerking: Het volume van gereserveerde monster varieert, afhankelijk van de BCA assay gebruikt in stap 6.1. Dezemonster moet worden opgeslagen op nat ijs voor onmiddellijke analyse of ingevroren bij -80 ° C. </li></ol> 6. bicinchoninezuur (BCA) assay <ol><li> Voer een BCA assay zoals aanbevolen door de fabrikant kit hand monsters uit stap 5.4 om de resterende peptideconcentratie voor elk monster te bepalen. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> Meng 75 pl S. aureus extract met 75 pi van LC-MS solvent B, bereid in stap 1.4. </li><li> Vortex te mengen en centrifugeren bij 13.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats 100 pi supernatans in een vloeistof chromatografie (LC) flesje en sluit het. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten in het monster. </li><li> Laad de LC flesjes op de LC-MS autosampler en de running te bewerken in de software &quot;Offline Worklist Editor.&quot; <ol><li> Vul de &quot;Sample Name&quot; (bijvoorbeeld wildtype-1), &quot;Sample Position&quot; (bijvoorbeeld P1-A1), &quot;Method&quot; (bijvoorbeeld A Mierenzuurcid-Negative Method) en &quot;Data File&quot; (bijvoorbeeld wild-type-1) kolommen. Klik op de knop &quot;Save werkvoorraad&quot; knop. Open de &quot;Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation&quot; software en voer de eerder opgeslagen werklijst. Klik op de &quot;Start Worklist Run&quot; knop om de continue LC-MS meting te starten. </li></ol></li><li> Scheid de monsters op een kolom, de kolom te koppelen aan een time of flight (TOF) spectrometer, en koppelen van de TOF spectrometer met het LC-systeem. Met een mobiele fase gradiënt als volgt: 0-2 min, 85% oplosmiddel B; 3-5 min, 80% oplosmiddel B; 6-7 min, 75% oplosmiddel B; 8-9 min, 70% oplosmiddel B; 10-11,1 min, 50% oplosmiddel B; 11,1-14 min, 20% oplosmiddel B; en 14,1-24 min, 5% oplosmiddel B; eindigen met een 10 min re-equilibratie periode bij 85% oplosmiddel B en een stroomsnelheid van 0,4 ml min-1. </li><li> Onder toepassing van een isocratische pomp trekken een referentiemassa oplossing met de run om gelijktijdige mass as kalibratie. LET OP: Deze stapis gebaseerd op de standaard TOF spectrometer handleiding. <ol><li> Gebruik het mengsel van azijnzuur D4 en hexakis (1H, 1H, 3H--tetrafluorpropoxy) fosfazine de referentiemassa oplossing voor de real-time kalibreren. Met de isocratische pomp met debiet van 2,5 ml min-1 gedurende de infusie. </li></ol></li></ol> 8. Batch Correctie van Ion Counts <ol><li> Wijzen een monster dienen als referentiemonster voor batch corrigeren (bijvoorbeeld wildtype, repliceren 1). </li><li> Bereken de som van de ion telt voor alle metabolieten binnen de referentie-monster. Herhaal deze berekening voor alle monsters. </li><li> Verdeel het totaal aantal ionen van elk monster door de ionen van het referentiemonster om een ​​verhouding te genereren. </li><li> Verdeel het ion telling voor elke metaboliet in een monster door het monster / referentieaandeel een batch-gecorrigeerde ion telling voor elke metaboliet te verkrijgen. </li></ol> 9. Peptide Normalisatie <ol><li> Divide de batch-gecorrigeerde ion telwaarden voor elke verkregen in stap 8 door de peptideconcentratie bepaald met BCA assay stap 6 om een ​​genormaliseerde waarde verkregen voor elk monster metaboliet. OPMERKING: De genormaliseerde, batch-batch ion gecorrigeerde tellingen per metaboliet, verkregen in stap 9.1 kan direct worden vergeleken tussen stammen en onderworpen aan statistische analyse (bijvoorbeeld een Mann-Whitney U test). Als alternatief, een metaboliet waarvan bekend is onveranderd, hetzij door de behandeling of genetische achtergrond kan worden gebruikt als een normalizer om veranderingen als gevolg van ontleding metaboliet detecteren. De toevoeging van een bekende hoeveelheid L-norvaline of gluraric zuur in de extractiebuffer kan worden gebruikt voor het corrigeren voor het verlies tijdens monster verwerking 34. </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Alle kleine moleculen metabolieten zijn met elkaar verbonden via hun gemeenschappelijke oorsprong in centrale metabole routes. Tijdens exponentiële groei, bacteriële cellen in biologische en metabolische steady state, die een momentopname van de fysiologische toestand onder specifieke omstandigheden. CodY controleert voedingsstoffen voldoende door te reageren op ILV en GTP. Als ILV en GTP zwembaden druppel wordt CodY verricht waardoor geleidelijk verlaagd, het aanpassen van de expressie van de doelwitgenen te passen aan...

Bacteriële pathogenen te kampen met vele uitdagingen in de nieuwe omgeving. Naast directe aantasting door immuuncellen, de gastheer sekwestreert ook voedingsstoffen die essentieel zijn voor bacteriële overleving en replicatie, genereren nutritionele immuniteit 1, 2. Om deze vijandige omgeving te overleven, bacteriële ziekteverwekkers implementeren virulentiefactoren. Sommige van deze factoren kan de bacterie om de immuunrespons te ontwijken; Andere factoren zijn uitgescheiden spijsverteringsenzymen, zoals hyaluronidase, thermonuclease en lipase, waarbij de bacteriën in staat kan stellen ontbrekende voedingsstoffen aan te vullen door de consumptie van weefsel afgeleide bestanddelen 3, 4, 5. Sterker nog, bacteriën regulerende systemen die de fysiologische toestand van de cel te binden aan de productie van virulentiefactoren 6, 7 geëvolueerd, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Een groeiende hoeveelheid bewijs wijst op CodY als kritische regulator koppelen metabolisme en virulentie. Hoewel in Bacillus subtilis eerst ontdekt als een repressor van het dipeptide permease (dpp) -gen 11, is CodY nu bekend dat door vrijwel alle lage G + C Gram-positieve bacteriën 12, 13 en regelt tientallen genen betrokken bij koolstof en stikstofmetabolisme 14, 15, 16, 17, 18, 19. In pathogene species, CodY bestuurt ook de expressie van een aantal van de belangrijkste virulentiegenen 20, 21,. ef &#39;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY wordt geactiveerd als een DNA-bindend eiwit door twee klassen van liganden: vertakte aminozuren (BCAA, isoleucine, leucine en valine [ILV]) en GTP . Wanneer deze voedingsmiddelen zijn overvloedig, CodY onderdrukt (of in sommige gevallen, stimuleert) transcriptie. Al deze voedingsstoffen beperkter is CodY activiteit geleidelijk verminderd, waardoor een gegradeerde transcriptionele respons die omleidt precursoren via verschillende metabolische wegen verbonden centraal metabolisme 28, 29, 30. Tandem vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) is een techniek die nauwkeurig kan identificeren en kwantificeren van kleine moleculen intracellulaire metabolieten 31. In combinatie met Transcriptome analyse (bijvoorbeeld RNA-Seq) Dit analytisch workflow inzicht in de fysiologische veranderingen die optreden in reactie op milieu- of nutritionele stress. Hier presenteren we een methode voor het metaboliet extractie uit Staphylococcus aureus cellen en daaropvolgende analyse door LC-MS. Deze benadering is gebruikt om de pleiotrope effecten van CodY op S. aureus fysiologie aan te tonen.

<table><tbody><tr><td>Materiaal/Uitrustinga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Cultuurkolf (250 mL)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>Sidearm Kolf, 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>3-gats Rubber Stop, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrij Staal Filter houder/frit</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>Petri Schaal, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Niet behandeld voor weefselcultuur</td></tr><tr><td>Gemengde cellulose ester membraan, 0.22 μm poriegrootte</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Stootvast buizen, 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>Silica Beads, 0.1 mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogenisator</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Cogent Diamond hydride type C kolom</td><td>Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td><td>Agilent</td><td>G6230B</td><td></td></tr><tr><td>Quat Pomp, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bin Pomp, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ventilaandrijving, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isocratische Pomp, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sampler, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G4226A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermostaat, 1290 Series</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chemisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, Gegranuleerd</td><td>Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>Vaste media bevat 1,5% [w/v] agar</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde saline (pH 7,4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Verdun vers tot 1x met ultra-puur water</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; giftig</td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>Voor massaspectrometrie, 98%</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td>Bacterie Stam</td><td>Soort</td><td>Stam</td><td>Genotype</td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>wild type</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&Delta;codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">aChemicaliën en materialen die worden vermeld, zijn specifiek voor de beschreven methode en omvatten geen standaard laboratoriumchemicaliën of -benodigdheden.</td></tr></tbody></table>

een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; staphylococcus aureus</em

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In een poging om bacteriële pathogenen te dwarsbomen, hosts beperken vaak de beschikbaarheid van voedingsstoffen op de plaats van infectie. Deze beperking kan de abundanties van de belangrijkste metabolieten waaraan regulerende factoren te reageren, het aanpassen van cellulaire metabolisme te veranderen. In de afgelopen jaren is een aantal eiwitten en RNA zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie virulentie. Bijvoorbeeld, de CodY eiwit reageert hoeveelheden vertakte aminozuren en GTP en wordt veel geconserveerd bij lage G + C Grampositieve bacteriën. Als globale regulator in Staphylococcus aureus, CodY de expressie van tientallen virulentie en metabole genen. Onze hypothese is dat S. aureus gebruikt CodY, voor een deel, aan de metabole toestand te veranderen in een poging aan te passen aan voedingsstoffen randvoorwaarden potentieel aangetroffen in de nieuwe omgeving. Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor de extractie en analyse van metabolieten van S. aureus met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrietrometry, een protocol dat is ontwikkeld om deze hypothese te testen. De werkwijze wijst ook beste praktijken die zorgt voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid, zoals het behoud van biologische stabiele en voortdurende beluchting zonder het gebruik van continue chemostaatcultures. Ten opzichte van de USA200 methicilline-gevoelige S. aureus isolaat UAMS-1 uitgangsstam, de isogene mutant Cody vertoonden significante verhogingen van aminozuren afgeleid van aspartaat (bijvoorbeeld threonine en isoleucine) en afnamen in hun precursors (bijvoorbeeld aspartaat en O -acetylhomoserine ). Deze resultaten correleren goed met transcriptionele gegevens verkregen met RNA-seq analyse: genen in deze trajecten werden opgereguleerd tussen 10- en 800-voudig in Cody null-mutant. Koppeling globale analyse van de transcriptoom en het metaboloom kan onthullen hoe bacteriën veranderen hun metabolisme wanneer zij worden geconfronteerd met het milieu of nutritionele stress, het verstrekken van potentiële inzicht in de physiological veranderingen in verband met een tekort aan nutriënten ervaren tijdens infectie. Dergelijke ontdekkingen de weg voor de ontwikkeling van nieuwe anti-infectieuze middelen en therapeutische middelen vrijmaken.

We hebben intracellulaire metaboliet zwembaden in S. aureus geanalyseerd tijdens de in vitro groei in een rijke, complexe medium. Als bewijs van het principe, vergeleken we metabolietprofielen tussen de methicilline-gevoelige S. aureus osteomyelitis isoleren UAMS-1 (wildtype [WT]) en een isogene stam zonder de globale transcriptionele regulator CodY (Δ Cody) 26. Steady-state, exponentiële kweken van de WT en Cody stamme...

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Het algemene doel van deze bemonsteringsmethode is het oogsten van metabolietmonsters van Staphylococcus aureus voor daaropvolgende kwantificering via tandem vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Ons laboratorium is geïnteresseerd in het bestuderen van de interactie tussen metabolisme en pathogenese in bacteriën die relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Op dit moment gebruiken we de humane opportunistische pathogeen Staphylococcus aureus als modelorganisme.Een belangrijke vraag die we willen beantwoorden is hoe bacteriën hun fysiologie en pathogeniteit aanpassen wanneer zij worden geconfronteerd met nutriëntendepletie tijdens een infectie van de gastheer. Deze techniek is voordelig omdat deze een momentopname biedt van de distributie van specifieke metabolieten over de vele metabole routes in actief groeiende cellen, met minimale verstoring van hun fysiologische toestand. Begin met het uitplaten van de betreffende S.aureus-stammen voor isolatie op tryptic soy agar vanuit de bevroren glycerolstock.Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 16-24 uur. Inoculeer de volgende dag 4 mL tryptic soy broth, of TSB, in steriele glazen incubatiebuisjes met enkele kolonies van elke stam. Incubeer de culturen, schuin geplaatst met rotatie, bij 37 °C gedurende 16-20 uur.Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid van de culturen te meten bij 600 nanometer, afgekort als OD600. Verdun de cellen op basis van deze meting tot een OD600 van 0,05 in 50 mL steriel TSB-medium, in 250 mL Delong-kolven. Incubeer de culturen bij 37 °C in een warmtebad met schudden op 280 rpm.Neem elke 30 minuten OD600-metingen. Naarmate de optische dichtheden toenemen, kan het noodzakelijk worden om de culturen te verdunnen met TSB, zodat ze binnen het lineaire absorptiebereik van de spectrophotometer blijven. Terwijl de cellen groeien, bereidt u de extractiebufferoplossingen vers met reagentia van de hoogst beschikbare zuiverheid, zoals beschreven in het tekstprotocol.Wanneer de culturen een OD600 bereiken tussen 0,8 en 1,0, subcultiveer deze dan in 50 mL vers voorverwarmd TSB tot een OD600 van 0,01 tot 0,05, en herhaal de incubatie- en meetstappen. Bereid een bed van verbrijzeld droogijs voor in een geschikt vat, zoals een glazen schaal, ijsemmer of koelbox. Wanneer de optische dichtheden van de culturen het gewenste oogstpunt naderen, voeg dan 1 mL quenching-oplossing toe aan een onbehandelde petrischaal van 35 mm en koel deze minimaal 5 minuten voor op droogijs.Voor onze doeleinden is het gewenste oogstpunt een optische dichtheid van ongeveer 0,4 tot 0,5. Dit kan echter worden aangepast, afhankelijk van de experimentele doelen. Plaats vervolgens een filterfrit van roestvrij staal in een rubberen stop en plaats deze bovenop een vacuümkolf die is aangesloten op een huisvacuüm of vacuumpomp.Schakel het vacuüm in en plaats een gemengd cellulose-estermembraan bovenop. Gebruik een filter met dezelfde diameter als de frit om ervoor te zorgen dat alle cellen worden opgevangen. Het is van cruciaal belang om de cellen zo snel mogelijk op te vangen en de metabole activiteit te stoppen, zodat er een momentopname wordt verkregen van de metabole abundanties onder een bepaalde conditie.Zelfs kleine vertragingen kunnen de steady-state fysiologie van de cellen beïnvloeden. Gebruik bij een OD600 tussen 0,4 en 0,5 een serologische pipet om 13 mL cultuur uit de kolf te verwijderen. Breng het monster onmiddellijk aan op het filter.Nadat het volledige monster is gefiltreerd, spoelt u het filter onmiddellijk met maximaal 5 mL ijskoud PBS om medium-geassocieerde metabolieten weg te wassen. Koppel vervolgens het vacuüm los en gebruik een steriele pincet om het filter uit de frit te verwijderen. Plaats het filter omgekeerd in de vooraf gekoelde quench-oplossing.Incubeer het filter in de quench-oplossing op droogijs gedurende ten minste 20 minuten. Keer het filter met de steriele pincet om in de petrischaal en gebruik een micropipet om de cellen van het membraan in de quench-oplossing te spoelen. Resuspendeer de cellen in de quench-oplossing en breng de celsuspensie vervolgens over naar een steriele, schokbestendige buis van 2 mL die ongeveer 100 microliters 0,1 mm silicakralen bevat.Bewaar dit op droogijs of bij 80 °C. Om te beginnen met de extractie van metabolieten, ontdooi eerst de monsters op nat ijs. Disrupt vervolgens de cellen in een homogenisator met vier bursts van 30 seconden bij 6000 rpm, met koelperiodes van twee minuten op droogijs tussen de cycli.Centrifugeer de lysaten gedurende 15 minuten op maximale snelheid in een vooraf gekoelde microcentrifugebuis. Draag na centrifugatie het supernatant over naar een schone microcentrifugebuis. Gebruik een micropipet om een klein deel van het monster over te brengen naar een microcentrifugebuis voor de kwantificering van het residuele peptidegehalte, zoals beschreven in het tekstprotocol.Bewaar het restant van het monster bij 80 graden Celsius. Raadpleeg het tekstprotocol voor de analyse van de metabolieten via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. De CodY-nullmutant werd gebruikt om de uitputting van vertakt-keten aminozuren te onderzoeken, aangezien het CodY-eiwit de expressie van tientallen genen aanpast als reactie op de daling in de concentratie van deze voedingsstoffen.De codY-mutatie heeft weinig effect op de groeisnelheid van S.aureus-cellen. De daling in optische dichtheid bij het 3-uursmerk duidt op de terugverdunningsstap, die het aantal celdelingen vóór de oogst verhoogt en diverse moleculen verwatert die zich tijdens de nachtelijke groei ophopen. Een RNA-sequentieanalyse van de transcriptomen van de twee stammen laat significante veranderingen zien in de expressie van genen die betrokken zijn bij de synthese van aminozuren uit de aspartaatfamilie.Hier geven de getallen onder de gennamen de factor van verandering in expressie aan in een codY-nullmutant, vergeleken met de wildtype-stam. Na LC-MS-kwantificering van de geëxtraheerde metabolieten werden de abundanties tussen de twee stammen vergeleken. Bij het focussen op enkele verbindingen die gerelateerd zijn aan de aspartaatfamilie van aminozuren, is te zien dat de abundanties van precursoren, zoals aspartaat en O-acetylhomoserine, afgenomen zijn in de codY-mutant.Omgekeerd zijn eindproducten zoals threonine en isoleucine toegenomen. Hier geeft de stippellijn de drempelwaarde aan voor veranderingen in overvloed voor dit experiment. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u metabolieten uit Staphylococcus aureus kunt oogsten voor kwantificering via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie.Dit protocol is met aanpassingen ook geschikt voor het oogsten van metabolieten uit andere bacteriële soorten. Omdat bacteriën reageren op dynamische omgevingen, is het belangrijk om de filtratie- en wasstappen snel uit te voeren om potentiële fysiologische veranderingen die door bemonstering worden opgewekt te minimaliseren. Veranderingen kunnen ook worden geminimaliseerd door de frit en PBS koud te houden tijdens de bemonstering.

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Source: Samuels, D. J., et al. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the use of liquid chromatography–mass spectrometry to identify and quantify intracellular metabolites from S. aureus. It outlines the steps involved in metabolite extraction, peptide normalization, liquid chromatography, and mass spectrometric analysis.

A Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-Based Approach for Analyzing Metabolites from S. aureus

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Leer metabolietextractie uit Staphylococcus aureus voor metaboloomanalyse met vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie. Deze methode onthult bacteriële metabole aanpassingen tijdens voedingsstoffentekort.

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van

Meer video's verkennen