Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert In Vitro
17 mei 2017
Wij presenteren een methode om DNA-methylering te kwantificeren op basis van de 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We bepalen de 5-mC niveaus tijdens chondrocyten dedifferentiatie. Deze eenvoudige techniek kan gebruikt worden om snel het chondrocytfenotype in ACI-behandeling te bepalen.
Het algemene doel van dit experiment is om de 5-Methylcytosine niveaus te bepalen tijdens de dedifferentiatie van chondrocyten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in cel-gebaseerde behandeling van kraakbeendefecten, zoals autologe chondrocyten implantatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode is om het algemene DNA methylatieniveau te detecteren en zo het chondrocyten fenotype te evalueren.
De implicatie van deze technologie is standaard voor ons aandeel in autologe chondrocyten implantatie omdat DNA methylatie tijdens chondrocyten dedifferentiatie een groot obstakel vormt voor de behandeling van kraakbeendefecten met autologe chondrocyten implantatie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in DNA methylatieniveaus bij chondrocyten dedifferentiatie, kan het ook worden toegepast op andere studies van ziekten, zoals osteoartritis. We kregen het idee voor deze methode toen we de protocollen in de referenties van een dot blot methode las.
Het is belangrijk om een demonstratie van deze methode te geven, omdat dot blot toestanden moeilijk te benoemen zijn. Genomisch DNA moet worden gedenatureerd en vervolgens stapvoets verdund. Vervolgens moet het worden ondersteund op een positief geladen nylonmembraan.
De procedures zullen worden gedemonstreerd door Zhaofeng Jia, een afgestudeerde student van ons lab. De gewrichtskraakbeenweefsels die in dit onderzoek werden gebruikt, werden geïsoleerd uit de kniegewricht van donorpatiënten na een trauma. Snijd het kraakbeen met een steriele scalpel in stukjes van één tot twee kubieke millimeter.
Voeg vervolgens één milligram per milliliter collagenase II en DMEM toe aan het gehakte kraakbeen. En incubeer 12 tot 16 uur op 37 graden Celsius om de chondrocyten te verteren. Op de volgende dag filtert u de resulterende celsuspensie door een cellezaaier van 40 micrometer.
Centrifugeer de cellen. Gooi het supernatant weg, voeg PBS toe en centrifugeer opnieuw. Tel de cellen met een hemocytometer.
En zaai op een dichtheid van 20.000 tot 30.000 cellen per centimeter vierkant en DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline streptomycine. Kweek in een incubator op 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Oogst subconfluente cellen met behulp van 0,25%trypsin EDTA.
En plaats opnieuw op een dichtheid van 6.600 cellen per centimeter vierkant. Kweek de chondrocyten in monolagen gedurende maximaal zes passages en beoordeel bij passage één, twee, drie, vier en vijf. Om deze procedure te starten, verzamel cellen door trypsinisatie en centrifugatie.
Spoel vervolgens de cellen op in 500 microliters lysbuffer per 10 miljoen cellen door pipetteren en snel omkeren. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg proteinase K toe met een concentratie van 160 microgram per milliliter celextract en draai het mengsel krachtig om.
Incubeer gedurende zes uur bij 55 graden Celsius. Voeg aan elk monster een volume Tris pH 7,9 verzadigd fenol toe aan chloroform tot isoamy alcohol. Schud het monster grondig gedurende ongeveer 20 seconden met de hand.
Centrifugeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 13.000 keer G. Verwijder de bovenste waterige fase en breng over naar een nieuwe buis. Om het fenol te verwijderen, voeg een gelijk volume chloroform toe aan elke buis.
Schud met de hand en centrifugeer. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg 0,1 monstervolume van drie molar natriumacetaat pH acht en twee volumes van 100%ethanol toe.
Bewaar de buizen een nacht bij min 20 graden Celsius om het genomisch DNA te laten bezinken. Centrifugeer de monsters op de volgende dag gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en 16.000 keer G om het genomisch DNA te pelleten. Was de monsters met 70%ethanol.
En centrifugeer gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en 13.000 keer G. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat het DNA-pellet drogen. Spuit het DNA op in 10 millimolar tris pH acht 0,1 millimolar EDTA. Begin deze procedure door het geïsoleerde DNA te denatureren in 0,1 molair natriumhydroxide gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius.
Neutraliseer het DNA met een molair ammoniumacetaat op ijs. En verdun vervolgens twee keer met gedistilleerd water. De meest kritische stap in de dot blot testen is het plaatsen van de monsters, en vergeet niet het langzaam en voorzichtig te doen.
Probeer elke gespotte array tot drie tot vier millimeter in diameter te minimaliseren. Gebruik een smalle mond pijptip en plaats voorzichtig twee microliters van de stapvoets verdunde genomische DNA op een positief geladen nylonmembraan in het midden van het raster. Droog het membraan gedurende 30 minuten bij 80 graden Celsius.
Blok vervolgens de niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen door het membraan gedurende een uur in 5%BSA in TBST in een 10 centimeter petrischaal te laten weken bij kamertemperatuur met zacht schudden. Was het membraan na een uur drie keer in TBST gedurende vijf minuten per keer. Incubeer het membraan met een muis anti-5-methylcytosine monoklonaal antilichaam in TBST bij vier graden Celsius gedurende de nacht.
Was op de volgende dag het membraan drie keer in TBST gedurende vijf minuten per keer. Incubeer vervolgens met een secundair antilichaam, paardenradensperoxidase geconjugeerd schapen anti-muis immunoglobuline G in TBST gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na het wassen van het membraan in TBST zoals eerder, voeg het enzym substraat toe aan het membraan en incubeer gedurende vijf tot tien minuten.
Beeld tenslotte het secundaire antilichaamsignaal af met behulp van een chemiluminescentie kit volgens de instructies van de fabrikant. Chondrocyten die in een monolaag zijn gekweekt tot passage zes vertoonden progressieve fenotypische veranderingen die bij opeenvolgende passages hoog gepinched en afgeplat werden. Deze morfologische verandering is typisch voor het dedifferentiatieproces van chondrocyten.
Genomisch DNA werd geïsoleerd uit chondrocyten na een variabel aantal passages en DNA methylatieniveaus werden beoordeeld
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode om DNA-methylering te kwantificeren via de 5-methylcytosine (5-mC) dot blot-techniek. De focus ligt op het bepalen van de 5-mC-niveaus tijdens de dedifferentiatie van chondrocyten, wat cruciaal is voor de behandeling via autologe chondrocytenimplantatie.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Dedifferentiatie van chondrocyten vormt een uitdaging bij kraakbeenherstel.
- DNA-methylering is een sleutelfactor die het fenotype van chondrocyten beïnvloedt.
- Inzicht in methylering kan de behandelresultaten voor kraakbeendefecten verbeteren.
- Deze methode kan ook worden toegepast op andere aandoeningen, zoals artrose.
Doel van de studie
- Om de 5-mC-niveaus tijdens dedifferentiatie van chondrocyten te kwantificeren.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor de evaluatie van het chondrocytenfenotype.
- Om hindernissen bij autologe chondrocytenimplantatie aan te pakken.
Gebruikte methoden
- 5-methylcytosine (5-mC) dot blot-techniek.
- Beoordeling van DNA-methylatieniveaus.
- Evaluatie van het chondrocytenfenotype tijdens dedifferentiatie.
- Toepassing van resultaten op behandelingen van kraakbeendefecten.
Belangrijkste resultaten
- De methode detecteert betrouwbaar de algemene DNA-methyleringsniveaus.
- 5-mC-niveaus correleren met het chondrocytenfenotype.
- De verkregen inzichten kunnen strategieën voor autologe chondrocytenimplantatie verbeteren.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot andere gerelateerde ziekten.
Conclusies
- Deze techniek biedt een eenvoudige en snelle benadering om DNA-methylering te beoordelen.
- Inzicht in methyleringsdynamiek is essentieel voor het verbeteren van therapieën voor kraakbeenherstel.
- De methode zou verder onderzoek in de regeneratieve geneeskunde kunnen faciliteren.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Dedifferentiatie van chondrocyten tijdens in vitro expansie vormt een aanzienlijke uitdaging voor autologe chondrocytenimplantatie, een cruciale behandeling voor kraakbeendefecten. Globale DNA-methyleringsniveaus dienen als biomarker voor fenotypisch verlies, maar bestaande kwantificeringsmethoden worden belemmerd door hoge monstervereisten, kosten of complexiteit. De 5-mC dot blot-assay biedt een betrouwbaar, eenvoudig en snel alternatief om methyleringsdynamiek te beoordelen, wat vroege validatie van targets en mechanische risicoreductie in regeneratieve geneeskundige pijplijnen ondersteunt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar epigenetische mechanismen die het verlies van het chondrocytenfenotype tijdens dedifferentiatie aansturen.
- Operationele waarde: Biedt een snelle readout voor het beoordelen van globale DNA-methylering als functionele biomarker in workflows voor targetvalidatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door methyleringstrends te koppelen aan de voortgang van dedifferentiatie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in de ontwikkeling van celtherapie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve methyleringsgegevens van serieel verdunde gDNA-monsters, waardoor dose-responsbeoordeling over verschillende passagnummers mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een commercieel verkrijgbaar 5-mC-antilichaam en nylonmembraan, wat de detectie standaardiseert en de variabiliteit in epigenetische screeningsassays vermindert.
- Schaalbaarheidswaarde: Elimineert de noodzaak voor gelelektroforese of DNA-digestie, wat de opzet van de assay versnelt en een medium-throughput evaluatie van chondrocyteculturen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Verbindt in vitro-dedifferentiatiemodellen met fenotypische uitkomsten die relevant zijn voor de effectiviteit van autologe chondrocytenimplantatie.
- Preklinische waarde: Maakt longitudinale monitoring van epigenetische veranderingen over verschillende passages mogelijk, wat risico-gecorrigeerde beslissingen ondersteunt bij de verdere ontwikkeling in preklinische celtherapiestudies.
- Mechanistische waarde: Faciliteert de afstemming van biomarkers door 5-mC-niveaus te correleren met dedifferentiatiefenotypen, waardoor het voorspellend vertrouwen in translationele modellen wordt vergroot.
Pipeline- en workflowintegratie
De 5-mC dot blot-assay past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door een epigenetische读-out te bieden die informatie verschaft voor doelwitvalidatie, assay-gereedheid en translationele continuïteit bij therapieën op basis van chondrocyten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van epigenetische drijfveren bij dedifferentiatie, wat pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie mogelijk maakt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve methylatieresultaten van serieel gespotte gDNA, ter ondersteuning van assay-standaardisatie en vergelijking van verbindingen of condities.
- Analytics: Genereert signaalintensiteitsgegevens die analyseerbaar zijn via beeldkwantificatie, wat meetbare readouts biedt voor het evalueren van methylatietrends over verschillende experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro dedifferentiatie-modellen en fenotypische uitkomsten die relevant zijn voor kraakbeenherstel, ter ondersteuning van biomarker-gealigneerde preklinische validatie.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vertegenwoordigt een herbruikbaar epigenetisch screeninginstrument dat verder dan chondrocyten toepasbaar is op andere ziektemodellen waarbij fenotypische stabiliteit betrokken is, zoals artrose.
Operationele & Ondernemingsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit rond epigenetische bijdragen aan dedifferentiatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via een eenvoudig dot blot-formaat dat minimale apparatuur vereist en geen DNA-digestie behoeft.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle epigenetische beoordeling vroeg in het ontdekkingsproces mogelijk te maken, waardoor uitval in een laat stadium door onvoorziene fenotypische instabiliteit wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van cellijnen of kweekcondities op basis van methyleringsstabiliteit, wat beslissingen over verdere ontwikkeling in pijplijnen voor regeneratieve geneeskunde informeert.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in isolatie van genomisch DNA, denaturatie en blotting-technieken om de integriteit van de monsters en de nauwkeurigheid van het signaal te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot hybridisatieovens, chemiluminescentie-beeldvormingssystemen en standaard moleculairbiologische reagentia (bijv. BSA, TBST, antilichamen).
- Maakt standaardisatie van de spotting-techniek en de behandeling van membranen noodzakelijk om variabiliteit in dot-grootte en signaalintensiteit tussen gebruikers en laboratoria te minimaliseren.
- Vereist optimalisatie van de incubatie- en wascondities van antilichamen om achtergrondruis te verminderen en specifieke detectie van 5-mC in diverse gDNA-monsters te waarborgen.
- Beperkt tot semi-kwantitatieve of relatieve beoordeling van methylering; absolute kwantificering kan complementaire methoden voor validatie vereisen.
