Multi-layer Cortical Ca

Het algemene doel van deze procedure is om de simultane visualisatie van neuronale activiteit over meerdere lagen van corticale neuronen mogelijk te maken met behulp van calciumindicatoren in een vrij bewegende muis, en om de werking van neurale circuits te begrijpen met een geminiaturiseerde, op het hoofd gemonteerde fluorescentiemicroscoop. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de systeemneurowetenschappen, zoals de wijze waarop informatie wordt verspreid over meerdere lagen van de cortex. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om grote populaties genetisch gecodeerde neuronen over meerdere corticale lagen in vrij bewegende dieren betrouwbaar over een langere periode te visualiseren.

Om genetisch gecodeerde neuronen uit meerdere corticale lagen in een vrij bewegend dier te visualiseren, moeten de volgende procedures worden uitgevoerd; dit protocol belicht de implantatie van de prismeprobe, de installatie van de basisplaat en in vivo beeldvorming in een vrij bewegende muis. Om deze procedure te starten, plaatst u het dier één tot twee weken na de virusinjectie in het stereotaxische apparaat en bereidt u de chirurgische ingreep voor de implantatie van de prismeprobe voor door deze te desinfecteren in 70% ethanol en te reinigen met lenspapier. Maak vervolgens een ronde craniotomie met een microboor met een frees van 0,5 millimeter.

Zorg ervoor dat de diameter van de craniotomie net iets groter is dan de diameter van het prisma. Positioneer de craniotomie vervolgens zodanig dat wanneer het prisma in de cortex wordt geplaatst, de platte zijde naar de injectieplaats van het virus is gericht en zich binnen een straal van 150 tot 200 micron bevindt. Verwijder daarna de dura met een fijne pincet.

Houd het weefsel altijd vochtig met steriele zoutoplossing zodra het hersenweefsel is blootgelegd. Dit helpt ook om de druk op het weefsel te handhaven. Om de druk in het hersenweefsel tijdens de inbrenging van de prismesonde te verminderen, kan een insertiekanaal worden gemaakt door een dissectiemes met een rechte snijkant te bevestigen aan de elektrodehouderarm van het stereotaxische apparaat.

Bevestig het onder een hoek, zodanig dat de messenplaat loodrecht staat op de kromming van de schedel en in een vlak parallel aan de injectiekolom voor het virus. Positioneer het mes zorgvuldig boven de craniotomie, langs de binnenste mediale rand en ongeveer 200 microns lateraal ten opzichte van de injectieplaats van het virus, met de snijkant naar achteren gericht. Zet de Z-as op nul wanneer de punt van het mes de pia raakt.

Breng het vervolgens geleidelijk naar de diepte waarin de prismeprobe zal worden ingebracht. Beweeg het mes daarna één millimeter posterieur om een opening te creëren voor de voorrand van het prisma. Trek het mes langzaam terug met de micromanipulator van de stereotaxische arm in stappen van 10 micron per seconde, en plaats een stukje gel-foam spons gedrenkt in steriele zoutoplossing over de incisie.

Bevestig vervolgens de lenshouder aan de arm van de stereotaxische manipulator onder dezelfde hoek als het mes in de vorige stap. Lijn het prisma zodanig uit dat de platte zijde van het prisma zich boven de incisie bevindt en parallel loopt aan de kolom voor de virusinjectie. Zodra het prisma in de juiste hoek staat, wordt het geleidelijk in stappen van 10 micron in de hersenen gezakt tot een definitief Z-niveau van 1,1 millimeter vanaf het hersenoppervlak, voor deze probe.

Bedek elk blootgesteld weefsel rond het prisma in de craniotomie met een zeer dunne beschermende laag elastomeerlijm, met behulp van een naald van 25 gauge. Om te voorkomen dat de lens binnen de craniotomie verschuift, wordt er na het uitharden van de elastomeerlijm een naald van 25 gauge gebruikt om wat cyanoacrylaatlijm aan te brengen, zodat het glas van de prismalens aan de aangrenzende schedel kan worden bevestigd over de laag elastomeerlijm. Zodra de cyanoacrylaatlijm is uitgehard, wordt de lenshouder lossgeschroefd en de microscoop voorzichtig verwijderd.

Trek vervolgens langzaam de arm van de stereotaxische manipulator terug, zodat de prisma-sonde stevig geïmplanteerd achterblijft. Breng een laag tandheelkundige acryl of cyanoacrylaatlijm aan rondom het implantaat, om het blootgestelde schedeloppervlak te bedekken zonder het omliggende teruggetrokken spierweefsel aan te raken. Het bedekken van een groot deel van de schedel met deze schedelkap zal later helpen bij de bevestiging van de basisplaat.

Meng vervolgens de katalysator en de basis uit een siliconenkitspuit en breng een druppel van het elastomeer aan in de manchet van de prismasonde, zodat de bovenkant van de sondelenze wordt bedekt om beschadigingen en stofneerslag te voorkomen. Eén week tot 10 dagen na het implanteren van de prismasonde wordt de virusexpressie in het weefsel gecontroleerd via de geïmplanteerde prismasonde. Verwijder hiervoor de siliconenkap over het oppervlak van de lens van de geïmplanteerde prismasonde.

Controleer het oppervlak van de lens van de probe en verwijder eventuele vuilresten voorzichtig met lenspapier en 70% ethanol, om te garanderen dat het beeldoppervlak schoon is. Bevestig vervolgens een basisplaat aan de microscoop en draai de stelschroef van de basisplaat vast om deze op zijn plaats te houden. Zet daarna de microscoop vast in de microscoopklem op de arm van de stereotaxische micromanipulator.

Bevestig de grijper aan een staaf die op de arm van de stereotaxische micromanipulator kan worden gemonteerd. Positioneer vervolgens de microscoop boven de lens van de prisma-sonde met behulp van de arm van de stereotaxische micromanipulator. Controleer de oriëntatie visueel door naar de prismalens te kijken vanaf de zijkant en de achterkant van de dierentafel.

De optische as van zowel het microscoopobjectief als de prismesonde moet worden uitgelijnd. Start daarna de acquisitiesoftware, selecteer het project en schakel de LED van de microscoop via de software in. Beoordeel de kwaliteit van de uitlijning van de microscoop in de acquisitiesoftware door scherp te stellen op de bovenste fase van de lens van de geïmplanteerde prismesonde, door de manipulatorarm van de stereotax te bewegen.

Wanneer de uitlijning correct is, moeten de randen van de lens van de prisma-sonde scherp verschijnen. Pas de fysieke afstand van de microscoop boven de geïmplanteerde prisma-sonde aan, met behulp van de stereotaxische manipulatorarm, om het gewenste brandvlak in het weefsel te verkrijgen. Gebruik vervolgens tandheelkundige acryl of cyanoacrylaat om de basisplaat permanent aan de acrylkap te bevestigen om de opening te overbruggen.

Het is van cruciaal belang om geen lijm aan te brengen op enig deel van het microscooplichaam of de stelschroef tijdens het vastlijmen van de basisplaat aan de kop van het dier. Laat de microscoop nu los uit de grijper en trek de grijper terug van de microscoop. Als cyanoacrylaat of een andere transparante lijm is gebruikt, dek deze dan af met zwarte nagellak of een laag zwarte tandheelkundige cement om lekken van omgevingslicht in de kopkap te voorkomen, aangezien dit toekomstige beelden die tijdens experimenten worden verkregen, kan contamineren.

Bescherm vervolgens de geïmplanteerde prisma-probe met de afdekplaat van de basisplaat. Sluit bij deze procedure de microscoop aan op de data-acquisitiebox die verbonden is met de computer en start de acquisitiesoftware. Verwijder daarna de afdekplaat van de basisplaat door de stelschroef van de basisplaat tegen de klok in te draaien en de afdekplaat omhoog te tillen.

Plaats de microscoop in de basisplaat op het dier. De microscoop moet met behulp van de magneten op de basisplaat in positie klikken. Draai vervolgens de stelschroef van de basisplaat aan tot er een lichte weerstand voelbaar is.

Select daarna de acquisitie-instellingen die worden gebruikt voor het verzamelen van de gegevens, inclusief de framerate voor de gegevensregistratie. Controleer bij het selecteren van de instellingen het beeldhistogram om een goede signaal-ruisverhouding te waarborgen. Start vervolgens met de acquisitie van de gegevens.

Wanneer de opname is voltooid, draai dan de stelschroef van de basisplaat los en maak de microscoop los van de basisplaat door de microscoop voorzichtig omhoog te trekken. Plaats vervolgens de afdekplaat van de basisplaat terug en draai de stelschroef van de basisplaat voorzichtig vast. Hier is een demonstratie van een dier waarop de microscoop is gemonteerd, dat vrij interacteert met de objecten in de gedragsarena.

Tijdens awake behaving imaging met het systeem werd de activiteit van somatosensorische corticale neuronen geregistreerd terwijl de muis werd blootgesteld aan drie verschillende omgevingen: een open veld op dag één, objectfamiliarisatie op dag twee tot en met vier, en een nieuw object op dag vijf. Na cel-extractie met behulp van de software voor calciumbeelddata-analyse werden ruimtelijke filters die overeenkomen met de cellocaties geprojecteerd op de gemiddelde fluorescentie-intensiteitsprojectie van de microscopische registratiedata.

Een witte stippellijn scheidt de cellen van laag twee, drie en vijf. De overeenkomstige calciumsporen van vijf cellen uit elk van de lagen tonen het vuurpatroon van de cellen in twee verschillende gedragscontexten: objectfamiliarisatie en blootstelling aan een nieuw object. Cellen uit laag twee en drie waren actiever vergeleken met cellen uit laag vijf op de dag dat de muis werd blootgesteld aan een nieuw object.

Hier zijn de resterende plots van de celactiviteiten van de oppervlakkige entiteitsspelers, wanneer het dier zich in het open veld bevond, tijdens de objectfamiliarisatie en de exploratie van een nieuw object. Eenmaal onder de knie, kan elke techniek binnen een uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling baant deze techniek de weg voor onderzoekers in de systeemneurowetenschap om specifieke celtypen in verschillende hersengebieden te onderzoeken, terwijl gebruik wordt gemaakt van verschillende gedragsparadigma's bij drones en andere neurofysiologische modellen van ziekten.

Aan de hand van dit protocol zou men een goed begrip moeten krijgen van hoe meerdere lagen van de somatosensorische cortex gelabeld kunnen worden, hoe een prismesonde geïmplanteerd kan worden en hoe een op het hoofd gemonteerde geminiaturiseerde microscoop kan worden bevestigd.