Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van whole-cell voltage clamp-registraties van een enkele fotoreceptorcel om lichtgeïnduceerde stromen te meten die voortkomen uit de absorptie van een enkel foton en uit de herhaalde responsen op intens licht. Deze methode kan helpen bij het adresseren van kernthema's binnen het veld van de sensorische transductie, zoals visuele transductie voor zowel de fysieke als ionische mechanismen die ten grondslag liggen aan fototransductie, en de eigenschappen van TRP-kanalen. De voordelen van het gebruik van deze techniek omvatten volledige controle over de membraanspanning, een extreem hoge signaal-ruisverhouding en de mogelijkheid om specifieke indicatoren voor optische metingen te introduceren.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de geringe omvang van het preparaat en de noodzaak om de dissectie snel uit te voeren vanwege een tijdgebonden metabole kwetsbaarheid. Kweek voor deze procedure de vliegen bij een dichtheid van ongeveer 20 per vial. Zorg op het moment van het experiment dat er enkele vials aanwezig zijn met pupae die bijna gesloten zijn en minstens 24 uur in constant donker hebben gestaan.

Verwijder twee uur vóór het verzamelen van volwassen vliegen alle reeds uitgekomen volwassenen. Behandel de vliegen die aan het donker zijn aangepast altijd in weefsels onder rode lichtverlichting. Terwijl u wacht op de vers uitgekomen vliegen, bereidt u de registratiekamer voor.

Bevestig het dekglas op de bodem van de kamer met gesmolten paraffine of vacuümvet van hoge kwaliteit om het bad te voltooien. Monteer het bad vervolgens op de tafel van de omgekeerde microscoop. Plaats de perfusiesysteembuis, de zuigsysteembuis en de aarddraad voor de elektrofysiologische opstelling in het bad.

Bereid vóór aanvang van de dissectie enkele oplossingen voor op de achterzijde van een Petri-schaal van 60 millimeter. Breng vier afzonderlijke druppels calciumvrije ES en één druppel TS aan. Pak nu met grove pincetten een vlieg die onlangs is uitgekomen vast bij de vleugels of het lichaam. Detacheer vervolgens met fijne pincetten de kop en breng deze snel over naar de eerste druppel calciumvrije ES. Disseceer de kop onder een stereoscoop in tweeën langs het sagittale vlak met behulp van een tweede paar fijne pincetten.

Zorg ervoor dat beide ogen intact blijven. Breng nu 1/2 van de kop over naar de tweede calciumvrije ES-druppel en de andere helft van de kop naar de derde calciumvrije ES-druppel. Ga vervolgens verder met het dissekeren van een van de twee ogen.

Verwijder met een fijne pincet zoveel mogelijk van het weefsel rondom het oog om er zeker van te zijn dat het netvlies niet beschadigd raakt. Pak vervolgens de rand van het hoornvlies stevig vast met een fijne pincet en schep het netvlies eruit. Het resultaat moet een leeg, intact hoornvlies zijn dat is gescheiden van een intact netvlies.

De pipetten worden bewaard in ethanol; spoel daarom een nieuwe trituratiepipet altijd eerst met water voordat u deze gebruikt. Vul de gespoelde pipet nu vanaf de vierde druppel met een klein volume calciumvrij ES. Zuig vervolgens het geïsoleerde retina met een zachte mondaspiratie in de pipet.

Voorkom met uiterste voorzichtigheid dat er luchtbellen ingesloten raken. Plaats vervolgens het netvlies in de druppel TS. Herhaal daarna de isolatie van het netvlies bij het tweede oog, zodat beide nu in de TS-druppel liggen. Veeg vervolgens voorzichtig alleen het calciumvrije ES van de Petrischaal af en voeg nog zes druppels TS toe aan het oppervlak van de schaal.

Breng beide retinae over naar nieuwe druppels TS. Vervang vervolgens de trituratiepipet door een pipet met een opening met een kleine diameter. Vul de pipet na het uitspoelen met een druppel TS. Gebruik deze pipet om beide retinae snel en herhaaldelijk op te zuigen en weer uit te stoten om enkele ommatidia van de pigmentcellen te scheiden. De TS zal tijdens dit proces troebel worden.

Breng vervolgens de resten van beide retinae over naar een andere druppel TS. Vul daarna de pipet met de troebele TS-druppel die de geïsoleerde ommatidia bevat. Blaas de oplossing in de badkamer. Herhaal deze procedure met trituratiepipetten van een steeds kleinere diameter totdat de retina volledig is opgelost.

Wacht nu een minuut. Tijdens deze pauze zullen de geïsoleerde ommatidia zich hechten aan de bodem van de kamer. Laat na een minuut ES met 1,5 millimol calcium stromen via het perfusiesysteem.

Zorg ervoor dat de aardingsdraad en de zuigbuis ondergedompeld zijn terwijl de kamer wordt gevuld. Laat de oplossing 60 tot 90 seconden doorstromen voordat u verdergaat. Gebruik vervolgens het 40x objectief om de ommatidia in het bad zorgvuldig te inspecteren.

Merk op dat de verlengde cellichamen van de fotoreceptoren die het ommatidium vormen, zijn losgekoppeld van hun axonen, maar levensvatbaar blijven. Kies nu een geschikt ommatidium voor het experiment. Selecteer dit wanneer het aan de volgende criteria voldoet.

Het buitenmembraan moet glad en intact zijn. De lange as moet nagenoeg haaks staan op de benadering van de elektrode vanaf de distale zijde. Bovendien mag het ommatidium niet omringd zijn door overtollig weefsel.

Zodra deze is geselecteerd, wordt het ommatidium in het gezichtsveld gecentreerd. Vul nu een pipet met de geschikte intracellulaire oplossing voor het experiment. Draai de pipet vervolgens vast in de電rodehouder.

Blaas vervolgens in de buis van de pipet om een positieve druk te creëren en sluit de klep van de buis om deze druk vast te leggen. Plaats daarna de pipet in de badkamer en leid deze naar het distale gedeelte van het ommatidium tot er een kleine inkeping in het membraan zichtbaar is, veroorzaakt door de positieve druk van de gepatchte pipet. Open nu de module voor membraantesten in de registratiesoftware om continue vierkante spanningspulsen van 2 mV toe te passen met een frequentie van 100 Hz.

Gebruik vervolgens de bedieningselementen van de patchclamp-versterker om het junctiepotentiaal op nul in te stellen, zodat de basis van de vierkantpuls op nul stroom staat. Open daarna de klep om de druk in de pipet te ontlaten en aspireer voorzichtig om een negatieve druk te creëren. De pipet zou vervolgens aan het celmembraan moeten hechten.

Zodra dit gebeurt, sluit u het ventiel om de druk vast te leggen. Controleer nu de weerstand van de elektrode. Deze moet zijn gestegen naar een waarde tussen 100 en 150 megaohms.

Laat vervolgens de negatieve druk in de pipet weer ontsnappen door het ventiel opnieuw te openen. De weerstand zou nu moeten toenemen tot tussen één en twee gigaohms, wat aangeeft dat er een C is gevormd tussen de pipet en de cel. Gebruik vervolgens de patch-clampversterker om de capacitieve stroom van de pipet te compenseren.

Om de whole-cell configuratie te verkrijgen, wordt het celmembraan doorbroken middels mondaspiratie. Creëer korte, krachtige stoten van negatieve druk in de elektrode. Zodra de whole-cell configuratie is bereikt, vindt er een plotselinge toename van de capacitantie plaats.

Stel vervolgens met de patchclamp-versterker de holdingpotentiaal in op het vereiste voltage en compenseer de capacitieve stromen en de serieweerstand. Sluit nu het zwarte gordijn van de kooi van Faraday en begin met het experiment. Na het verkrijgen van de whole-cell configuratie met een patchpipet die de fluorescerende kleurstof Lucifer yellow bevat, is te zien dat slechts één van de fotoreceptoren die het ommatidium vormen, met de kleurstof is geladen.

Deze fotoreceptor zal ook elektrisch geïsoleerd worden van zijn buren in het ommatidium. Whole-cell voltage-clamped ommatidia van wild-type vliegen en vliegen met mutaties in de genen InaC of InaD vertoonden quantum bumps als reactie op continu zwak licht. Een trage beëindiging van de bumps werd waargenomen in beide mutanten ten opzichte van wild-type vliegen.

De genormaliseerde responsen op lichtpulsen van 500 milliseconden, afgeleverd met 150.000 fotonen per seconde, illustreren duidelijk de veranderde fysiologieën. Met behulp van de preparatie was het zelfs mogelijk om whole-cell voltage-clamped quantum bump-responsen op een korte flits van dim licht van één milliseconde te meten. Dergelijke enkel-fotonresponsen werden vergeleken in wild-type, arrestine-mutante en ninaC-mutante vliegen.

Beide mutanten reageerden met een reeks bulten. Genormaliseerde responsen op een lichtpuls van 500 milliseconden, afgeleverd bij 15.000 fotonen per seconde. De langzame beëindiging van de macroscopische respons wordt dus waargenomen bij de arrestine-2 en ninaC mutanten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u whole-cell opnames kunt maken van fotoreceptorcellen van Drosophila. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om TRP-kanalen en inositol-lipide signalering beter te begrijpen, evenals de rol van intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen in zoogdieren, die betrokken zijn bij lichtafhankelijke activiteiten die geen beelden vormen.