Name: In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer in ovo-elektroporatie voor ruimtelijke en temporele controle van genexpressie in het kippenauditieve hersenstam. Deze methode helpt onderzoekers auditieve neuronontwikkeling en pathofysiologische fenomenen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria en Mevr. Ximena Optiz-Araya voor de eerste hulp bij het opzetten van protocollen en voor het leveren van plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).

Alle procedures werden goedgekeurd door de Institusionele Dierenzorg- en Gebruikscommissies van de Noordwestelijke Universiteit, en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. 1. Eierhantering <ol><li> Koop bevruchte eieren van een lokale leverancier. Bewaar eieren bij 13 ° C in de koelkast voor maximaal 5 dagen voor incubatie. De levensvatbaarheid van embryo neemt significant af na 1 week. </li><li> Schep elk ei met 70% ethanol voordat u in de incubator zit. </li><li> Zet 1-2 tientallen eieren aan hun zijden in een incubator met de temperatuur ingesteld op 38 ° C bij ~ 50% vochtigheid. Dit zorgt voor een goede embryo-positionering voor elektroporatie en respectievelijk optimale levensvatbaarheid. OPMERKING: Na 48 tot 52 uur incubatie zullen de eieren bij Hamburger-Hamilton (HH) stadium ~ 12-13 staan ​​en klaar zijn voor elektroporatie. </li></ol> 2. Voorbereiding <ol><li> Plasmide MiXing <ol><li> Voeg 1 μL 0,1% snelgroen (0,1% in 18 MΩ gedeïoniseerde en gedestilleerde H20 [ddH2O]) toe voor elke 7 μl DNA-mengsel. </li><li> Voor co-elektroporatie van meerdere plasmiden, meng plasmiden in een 1: 1 verhouding. De uiteindelijke DNA-concentratie moet 5-8 μg / μL zijn. </li></ol></li><li> Fill Injection Pipette <ol><li> Trek pipetten op een micropipette-trekker. Vul de pipet met 1-2 μL plasmiden met een 28G spuitnaald. </li><li> Breek de pipet tip tot 10 - 20 μm met behulp van tang. Gebruik een microscoop om te helpen bij het bepalen van de grootte van de gebroken pipettip. Bevestig de pipet aan de pipethouder van de picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Winding OPMERKING: De windowing procedure is vóór 13 gepubliceerd. Zie verwijzing 13 voor aanvullende visuele informatie. <ol><li> Veeg alle instrumenten en het werkgebied met 70%ethanol. </li><li> Neem het gewenste aantal vaste eieren uit de broeikas (tussen 6-10), laat het bij kamertemperatuur, en individueel doei eieren met 70% ethanol opnieuw. Eieren blijven minimaal 2 uur levensvatbaar na verwijdering van incubator. </li><li> Plaats het ei op een lichtverlichting om de embryopositie te identificeren. Omcirkel het middelpunt van het donkere gebied ( dwz embryo) met een potlood. </li><li> Gebruik een 19G-naald en steek een gat in het stompe uiteinde van het ei. </li><li> Poke een ander gat in de buurt van de getekende cirkel aan de punt van de ei. Verwijder een klein stukje van de buitenste eierschaal (ongeveer 16 mm 2 ) met de 19G-naald en verwijder vervolgens een klein stuk van de binnenste eierschaal (ongeveer 8 mm 2 ) met tang. </li><li> Met een 3 ml spuit uitgerust met een 19G-naald, haal 1,5-2,5 ml albumine uit het ei door het stompe gat. Zorg ervoor dat u de naald om 45 ° kiest. </li><li> Bedek het stompe gat met een klein stukje tape (1 cm x 1 cm). Bedek de getekende cirkel aD het tweede gat met tape (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Met gebogen schaar (snijrand = 2,5 cm) snijd een raam in de cirkel. De schaar moet parallel zijn aan de eierschaal en de diameter van het raam moet minder dan 2 cm zijn. </li></ol> 4. Plasmide injectie <ol><li> Zet de picospritzer aan. Stel de druk in op 18 psi en de duur tot 5 μs. Zet de luchttank en de lamp voor de dissectiemicroscoop aan. </li><li> Maak 30 ml voorraadoplossing van een 1:10 verdunning van in de winkel gekocht Indische inkt gemengd in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren bij 4 ° C. Injectie van Indische inkt is een belangrijke stap om de kippenembryo beter te visualiseren. <ol><li> Vul een 1 ml spuit met de verdunde Indische inktoplossing. Bevestig een 27G-naald en verwijder eventuele bellen die aanwezig zijn in de spuit. </li><li> Plaats de naald net onder het geelmembraan ~ 2 - 3 mm van het embryo en injecteer 0,2 ml Indische inkt voorzichtig onder het embryo. DoInjecteer niet meer dan 0,5 ml van de Indische inkt, aangezien het embryo-overleving kan verminderen. </li></ol></li><li> Plaats het raamdeeg op een eihouder onder de dissectiemicroscoop. Gebruik de hoogste vergroting voor de beste visualisatie van de plasmide injectieplaats. </li><li> Verwijder het membraan over het injectiegebied met behulp van tang. Auditieve hersenstamgebieden van belang ( dwz NM en NL) komen voort uit Rhombomeres 5 en 6 (R5 / R6). R5 / R6 bevinden zich naast de otocyten (een embryonale structuur in vertebraten die zich in het binnenoor ontwikkelen), die dienen als landmarks voor R5 / R6 plasmide injecties. </li><li> Verlaag het DNA-gevulde pipet in de neurale buis die over het R5 / R6 gebied en tussen otocyten leidt met behulp van de micromanipulator. Een schema van ideale plaatsing wordt getoond in figuur 1A . </li><li> Breng de luchtdruk (18 psi, 5 μs duur) van de picospritzer aan om DNA uit de neurale buis te verwijderen. </li></ol> 5. Elektroporatie <ol><li> Zet t aanHij stroom / spanning stimulator. </li><li> Vul een 3 ml spuit met PBS en bevestig het spuitfilter. Voeg 1-2 druppels PBS op het embryo toe. </li><li> Verlaag de bipolaire elektrode naar het embryo met behulp van de micromanipulator met de negatieve elektrode boven de injectieplaats (mediaal) en de positieve elektrode lateraal naar de R5 / R6 ( Figuur 1A ). Vermijd direct contact met het embryo. Gebruik bipolaire elektroden waar het elektrode materiaal platina iridium is. Pas de afstand tussen de tips aan op 0,5 mm met tang. </li><li> Gebruik een stroom / spanningsstimulator, 20 keer bij 50 V voor 1 ms met intervallen van 1 s. </li><li> Na elektroporatie voegt u een druppel PBS over het blootgestelde gebied. Verwijder de elektrode voorzichtig en maak het schoon met een laboratoriumweefsel en 70% ethanol. Sluit het raam dat het embryo met tape afdicht. </li><li> Label eierschaal met het geïnjecteerde plasmide type en de luikdatum. </li><li> Leg eieren terug in incubator met raamzijde omhoog. Incubeer bij 38 ° C met 50% Vochtigheid tot het gewenste ontwikkelingsfase is bereikt. </li><li> Als een tet-on vector electroporated is voor tijdelijke controle van de genuitdrukking, doe Doxycycline (Dox) elke 24 uur aan om genuitdrukking te veroorzaken (zie rubriek 6). </li></ol> 6. Tet-on systeem voor temporale controle van genuitdrukking <ol><li> Gebruik de volgende plasmiden: PCAGGS-T2TP: een transposase expressieplasmide. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: een plasmide dat stabiel het Dox-bindende eiwit uitmaakt. PT2K-BI-TRE-EGFP: een plasmide dat een bidirectionele tet-on promotor (TRE) -drivende expressie van de EGFP-reporter bevat en een tweede gen van belang. OPMERKING: De bovenstaande drie plasmiden moeten gecofroporiseerd worden in een verhouding van 1: 1: 1. </li><li> Voorraadoplossing: <ol><li> Doxis oplosbaar in steriele PBS om een ​​voorraadoplossing van 1 mg / ml te produceren. Bewaren bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Dox-applicatie: <ol><li> De expressio inducerenN van het gen van belang tijdens bepaalde ontwikkelingsfasen, doe Dox elke 24 uur. </li><li> Wanneer u Dox toepast, haal het ei uit, open het raam, pipet 50 μL Dox op het chorioallointoïsche membraan, sluit het raam en zet het ei terug in de incubator. </li></ol></li></ol> 7. Voorbereiding van Dissecting Area voor Brainstem Slices OPMERKING: De volgende paragrafen (7 - 9) en procedures zijn vóór 14 gepubliceerd. Zie deze verwijzingen voor aanvullende visuele informatie. <ol><li> Bereid een agaroplossing (40 mg / ml agarose, dwz 4% in ddH20). Giet de agaroplossing in een Petri-schotel en laat het op kamertemperatuur stollen. Bewaar overdekte agarplaat in de koelkast voor toekomstig gebruik tijdens het breinappen van het weefsel. </li><li> Bellen kunstmatig cerebrale spinale vloeistof (ACSF) met 95% O2 en 5% CO2 (pH 7,2-7,4 en osmolariteit: 295-310 mOsm / L).</li><li> Reinig het werkgebied en vibratomeer met 70% EtOH en spoel het mes met gedestilleerd water. </li><li> Plaats een schoon vloeibaar absorptieblok op het werkgebied met geschikte dissectie-gereedschappen. </li><li> Neem de agarplaat uit de koelkast, snijd een kleine agar kubus (10 mm x 10 mm x 8 mm). Plak het agarblok aan op het stadium van een vibratoom-snijkamer met gebruik van commercieel verkrijgbare superlijm. </li></ol> 8. Isolatie van Kip Auditory Brainstem <ol><li> Open het ei op de tapijtplaats. Doe de membraksak met een scalpel en verwijder het hoofd van het kippenembryo. </li><li> Ontdek de kip met een scherpe schaar. </li><li> Zet de scheermespunt een beetje achter de ogen. Inkijk door de schedel op de rostral-naar-caudale middenlijn. Pas kleine druk toe afhankelijk van de leeftijd van het embryo. Oudere embryo&#39;s hebben meer druk nodig. </li><li> Druk de huid en de veren voorzichtig op om schedel bloot te stellen en controleer de middelste snede. </li><li> S toepassenTrong druk, snijd het rostral gedeelte van de schedel met een scheermesje. Plaats het blad direct achter de ogen en snijd door de hele schedel en het breinweefsel. </li><li> Maak middenlijn-naar-laterale insnijdingen met een schaar in de caudale regio van de schedel, iets voor de nekspieren aan beide kanten van het hoofd. Ontdek hersenen en cerebellum door de schedel en het overtollige weefsel weg te trekken. </li><li> Knip weefsel vast aan de hersenstam met een schaar en verwijder de hersenstam, die vrij van de schedel loskomt. </li></ol> 9. Bereiding van hersenstamelschijven voor in-vivo elektrofysiologie of beeldvorming <ol><li> Knip de hersenstam door de optische tecta. </li><li> Verwijder het cerebellum door middel van scharen met een schaar, waarbij de vloer van de vierde ventrikel wordt blootgesteld. </li><li> Verwijder eventuele membranale weefsels en bloedvaten uit het hersenstamoppervlak met behulp van een pincet. </li><li> Om de hersenstam te blokkeren, maakt u een horizontale snede in het meest rostrale einde van de vloer van de vierTh ventrikel, gewoon caudaal aan de cortex. Maak laterale snede loodrecht door de optische tecta om de hersenstam te isoleren. </li><li> Plaats een kleine hoeveelheid superlijm op het vibratomeer vlak voor het agarblok. </li><li> Breng de hersenstam aan het ruggenmerg met behulp van tweezers en plaats het op de superlijm met rostralzijde naar beneden en de dorsale kant naar het vibratomeerblad. Verwijder overtollige lijm met een laboratoriumweefsel of filterpapier. </li><li> Giet zuurstofgezuurde ACSF in de vibratomeer. Zet het vibratomeerblad op een hoek van 20-22 °. Start vibratome bij maximale amplitude oscillatie. Verplaats het podium naar het mes zodat de bovenkant van het weefsel parallel is met het mes. </li><li> Draai het mes snel naar breinstamweefsel. Verlaag het mes aanzienlijk voor het contact van het mes met het weefsel. </li><li> Snij weefsel met de langste mogelijke voorwaartse snelheid. Zodra het mes door het gehele koronale weefselprofiel is, verwijder het plakje voorzichtig met een transferpipette. &lt;/ Li&gt; <li> Verlaag het stadium 200-300 μm en plak opnieuw. Herhaal tot anatomische oriëntatiepunten van auditieve kernen zichtbaar worden, bijvoorbeeld de afzonderlijke dorsale / ventrale neuropil regio van NL en de mediale locatie van NM ten opzichte van NL. </li><li> Houd schijfjes zorgvuldig in ACFS. Dit kan bij kamertemperatuur (22 ° C) of dichtbij fysiologische omstandigheden (~ 41 ° C) worden gedaan met een warm waterbad. Let op de volgorde van het snijden. De eerste plak komt overeen met het meest caudale gebied van weefsel en de laatste plak komt overeen met het meest rostralale gebied. Dit vertegenwoordigt ruwweg de tonotopische organisatie van de auditieve hersenstam, respectievelijk van laag- tot hoogfrequente coderende gebieden. </li></ol>

<ol><li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664077">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li>
<li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li>
<li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li>
<li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+time+coding+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li>
<li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li>
<li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li>
<li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li>
<li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306(2007).</li>
<li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris%3A+a+light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li>
<li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730(2012).</li>
<li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis%3A+differences+between+low+and+high+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li>
<li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li>
<li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li>
<li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li>
<li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li>
<li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li>
<li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cochlear+potentials+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In ovo elektroporatie is een methode om genen van belang uit te drukken of te kloppen om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. In het kippenembryo is het een innovatieve methode voor het uitdrukken van plasmide-gecodeerde genen in verschillende auditieve hersenstamregio&#39;s 8 . Om optimale expressie te waarborgen, zijn er meerdere kritische stappen nodig. Eerst, injecteer alleen embryo&#39;s waarvan de otocyten duide...

Snelle neurale codering van geluid is essentieel voor normale auditieve functies. Deze omvatten geluids lokalisatiemogelijkheden 1 , spraak in geluidsdiscriminatie 2 en het begrip van andere gedragsrelevante communicatiesignalen 3 . Analoge neuronen in de auditieve hersenstam van zowel avia&#39;s als zoogdieren zijn zeer gespecialiseerd voor snelle neurale codering 4 . Deze omvatten de kipkern Magnocellularis (NM), de nucleaire laminaris (NL) en hun zoogdieranaloge, de anteroventrale cochleaire kern (AVCN) en de mediale superieure Olijf (MSO), respectievelijk 5 . Ontwikkelingsmechanismen die snelle neurale codering regelen, worden echter slecht begrepen in de auditieve hersenstam. Daarom is het voordelig om specifieke genen die verantwoordelijk zijn voor snelle neurale codering te bestuderen om hun expressie, regelgeving en functie beter te kunnen begrijpenDijmontwikkeling. Het ontwikkelende kippenembryo is een effectief en goed gevestigd onderzoeksinstrument om fundamentele biologische vragen van auditieve systeemontwikkeling 6 , 7 te bestuderen. Recente moleculaire voorschotten hebben deze biologische vragen in het ontwikkelende kippenembryo aangepakt door genen van belang uit te drukken of neer te zetten om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. Het onderzoek naar de regulerende rol van specifieke genen is een belangrijke vooruitgang bij het begrijpen van pathologieën die verband houden met auditieve tekorten. Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide-gecodeerde genen in de kip auditieve hersenstam, waar snel neurale codering van geluid optreedt 10 . Door te targeten op auditieve neurale voorloperregio&#39;s geassocieerd met rombomeren 5 en 6 11 , 12 (R5 /R6), tonen wij ruimtelijke controle van plasmide transfectie in NM en NL. Daarnaast tonen we tijdelijke regulering van expressie door een tet-on vector systeem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) 8 uitmaakt.

```html
<table><tbody><tr><td>Bevruchte witte leghorn kippen eieren</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, enkele of dubbele kanaal</td></tr><tr><td>Stroom/spannings stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil spuitnaalden</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Lang, (Verpakking van 5)</td></tr><tr><td>Elektrode houder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Serie: Niet-elektrische druk toepassingen</td></tr><tr><td>Stimuleer micro-elektrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Luchttank/regelaar</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Doorzichtige plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ei koelkast</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &deg;C (56-61&deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &deg; C (100 &deg; F), ~50% vochtigheid</td></tr><tr><td>Dissectie scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscoop, 50.4X</td></tr><tr><td>Koude lichtbron</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Kapillairbuisjes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Dikvloerse borosilicaat (afmetingen)</td></tr><tr><td>Spuiten</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Naalden</td><td>BD Precision Glide</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Ei houder</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Klei basis werkt ook</td></tr><tr><td>Micropipet puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &mu;m</td></tr></tbody></table>
```

in ovo electroporation in de kip auditory brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Elektroporatie is een methode die genen van belang stelt in biologisch relevante organismen zoals het kippenembryo. Het is lang gevestigd dat het kippenembryo een effectief onderzoeksmodel is voor het bestuderen van basis biologische functies van auditieve systeemontwikkeling. Meer recent is het kippenembryo bijzonder waardevol geworden bij het bestuderen van genuitdrukking, -regulatie en -functie in verband met gehoor. In ovo kan elektroporatie worden gebruikt om auditieve hersenstamregio&#39;s te beheren die verantwoordelijk zijn voor zeer gespecialiseerde auditieve functies. Deze gebieden omvatten de kippenkernmagnocellularis (NM) en nucleus laminaris (NL). NM en NL neuronen ontstaan ​​uit verschillende precursoren van rhombomeren 5 en 6 (R5 / R6). Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide gecodeerde genen om genetische eigenschappen in deze regio&#39;s te bestuderen. We tonen een methode voor ruimtelijke en temporale controle van genuitdrukking die zowel winst of verlies van functioneel fenotype bevorderenes. Door middel van auditieve neurale voorloperregio&#39;s geassocieerd met R5 / R6 tonen we plasmide-transfectie in NM en NL. Temporele regulatie van genuitdrukking kan worden bereikt door een tet-on vectorsysteem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) uitmaakt. De in ovo elektroporationstechniek - samen met biochemische, farmacologische en / of in vivo functionele analyses - biedt een innovatieve aanpak voor de studie van auditieve neuronontwikkeling en bijbehorende pathofysiologische verschijnselen.

We laten hier zien dat in ovo elektroporation genexpressie in een normaal ontwikkelend biologisch systeem toelaat. Plasmide-gecodeerde genen worden focaal geïnjecteerd in de neurale buis boven R5 / R6. Een schematisch voorbeeld van de elektrode- en pipetplaatsingen ten opzichte van belangrijke anatomische markers is getoond in figuur 1A . De juiste plaats van plasmide-injectie wordt 24 uur na elektroporatie bevestigd en getoond in figuur IB . De...

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo&#39;s om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Het algemene doel van deze procedure is om de genexpressie in de auditieve hersenstam van de kip ruimtelijk en temporeel te beheersen. Het gebruik van in ovo elektroporatie biedt een innovatieve benadering om de ontwikkeling van auditieve neuronen en daarmee samenhangende pathofysiologische fenomenen te bestuderen. Deze procedure kan u helpen belangrijke vragen in het vakgebied van de auditieve neurale ontwikkeling te beantwoorden, zoals de vraag hoe de beheersing van de genexpressie bijdraagt aan het verkrijgen of verliezen van fenotypes die vereist zijn voor een normale ontwikkeling van de auditieve hersenstam.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Ting Lu, een postdoctoral fellow uit mijn laboratorium. Begin met het prepareren van de plasmidoplossingen door één µL Fast Green-oplossing toe te voegen aan elke zeven µL DNA-mengsel. Meng vervolgens de DNA-oplossingen in een verhouding van één-op-één voor de gelijktijdige electroporatie van meerdere plasmiden.Zodra de plasmide-oplossing is bereid, worden de pipetten vervaardigd met een micropipet-trekker. Gebruik vervolgens een injectienaald van 28 gauge om de pipet te vullen met één tot twee µL van de plasmide-oplossing. Breek met een pincet de pipetpunt tot 10 tot 20 µm en bepaal de grootte van de gebroken punt onder een microscoop; sluit de pipet vervolgens via een pipethouder aan op een picospritzer.Bewaar de bij een lokale leverancier gekochte eieren vóór de procedure niet langer dan vijf dagen in een koelkast bij 13 °C. Desinfecteer het ei eerst met 70% ethanol en incubeer het ei vervolgens op zijn zij bij 38 °C en ongeveer 50% luchtvochtigheid om een juiste positionering van het embryo en een optimale levensvatbaarheid te waarborgen. Na 48 tot 52 uur incubatie, wanneer het ei ongeveer Hamburger-Hamilton stadium 12 tot 13 bereikt, dient de werkruimte en alle instrumenten met 70% ethanol te worden gedesinfecteerd.Haal vervolgens het ei uit de incubator, laat het op kamertemperatuur komen en veeg het voor een tweede keer af met 70% ethanol. Identificeer met een lichtbron de positie van het embryo, dat zichtbaar is als een donker gebied, en markeer dit met een potlood door een cirkel rond het centrum te tekenen. Prik met een 19-gauge naald een gaatje in het stompe uiteinde van het ei en maak vervolgens een tweede gaatje bij de getekende cirkel aan het puntige uiteinde van het ei.Gebruik de 19-gauge naald om een klein stukje van de buitenste eierschaal te verwijderen en verwijder met een pincet een klein stukje van het binnenste eierschaalmembraan. Voer vervolgens een 19-gauge naald, bevestigd aan een spuit van 3 mL, in via het gat aan de stompe zijde van het ei en trek 1,5 tot 2,5 mL albumine op. Bedek het gat aan de stompe zijde van het ei met een stukje tape van 1 cm bij 1 cm, en bedek vervolgens de getekende cirkel en het tweede gat met een stukje tape van 2,5 cm bij 4 cm.Gebruik een gebogen schaar met een snijkant van 2,5 centimeter en houd deze parallel aan de eierschaal om een venster binnen de gemarkeerde cirkel uit te snijden. Om het plasmide te injecteren, schakelt u de picospritzer in en stelt u het instrument zo in dat er een druk van 18 PSI gedurende vijf microseconden wordt uitgeoefend; schakel vervolgens de luchttank en de lamp van de dissectiemicroscoop in. Bereid daarna 30 milliliter van een voorraadoplossing van de commercieel aangeschafte India Ink in steriel PBS.Zuig de India Ink-oplossing op in een spuit van één milliliter, bevestig vervolgens een naald van 27-gauge en verwijder eventuele luchtbellen die in de spuit verschijnen. Om het embryo zichtbaar te maken, brengt u de naald vlak onder het dooier Membraan in, ongeveer twee tot drie millimeter van het embryo vandaan, en injecteert u ongeveer 0,2 milliliters India Ink. Plaats het ei met het venster vervolgens in een eihouder onder de dissectiemicroscoop en schakel over naar de hoogste vergroting om het beste zicht op de plaats van de plasmidinjectie te verkrijgen.Verwijder het membraan dat het injectiegebied bedekt met een pincet. Zoek de otocysten en gebruik deze als oriëntatiepunten om rhombomeren vijf en zes te identificeren, die zich in de buurt bevinden en waaruit de nucleus magnocellularis en nucleus laminaris ontstaan. Positioneer de pipet met DNA met behulp van een micromanipulator in de neurale buis die boven de R5-R6 regio tussen de otocysten ligt.Inject het DNA in de neurale buis met de picospritzer. Om de elektroporatie te starten, schakelt u de spanningsstimulator in, bevestigt u vervolgens een spuitfilter van 0,22 micron aan een spuit van drie milliliter die vooraf is gevuld met PBS, en voegt u één tot twee druppels van de gefilterde PBS toe aan het embryo. Beweeg vervolgens met de micromanipulator een bipolaire elektrode naar het embryo en positioneer de negatieve elektrode boven de injectieplaats, terwijl u de positieve elektrode lateraal van de R5-R6 houdt.Pas met de voltagestimulator 20 pulsen van 50 volt toe gedurende één milliseconde met intervallen van één seconde. Er zullen belletjes zichtbaar worden nabij de punt van de elektrode. Voeg na de electroporatie één druppel PBS toe aan het blootgestelde gebied, verwijder de elektrode voorzichtig en reinig deze met een laboratoriumdoekje en 70% ethanol, en plak vervolgens het venster over het embryo af met tape.Noteer tot slot het type geïnjecteerd plasmide en de datum van incubatie op de eierschaal, en plaats het ei met de raamzijde naar boven in de incubator. Incubeer de eieren bij 38 °C met een luchtvochtigheid van 50%, totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Verwijder het ei 24 uur na de elektroporatie uit de incubator, open het raam en bevestig met behulp van een stereomicroscoop de juiste locatie van de gerichte plasmide-injectie.Indien tet-on vectoren zijn gebruikt, pipetteer dan 50 µL Doxycycline in het chorioallantoïse membraan, sluit het venster en plaats het ei terug in de incubator. Hier worden foto's gepresenteerd van een hersenstamcoupe van een embryo van een kip van dag 12, genomen onder differentieel interferentiecontrast-verlichting en fluorescentieverlichting. De nucleus magnocellularis en nucleus laminaris kunnen worden herkend binnen de hersenstamcoupe.Onder fluorescentieverlichting vertonen beide structuren de expressie van geel fluorescent eiwit, wat de efficiënte ruimtelijke expressie van de geëlektroporeerde genen bevestigt. De expressie van het geëlektroporeerde gen kan ook worden waargenomen in een doorsnede van de hersenstam met de nucleus magnocellularis, afkomstig van een embryo van een kip op dag 18. Bij een 80-voudige vergroting zijn de klassieke adendritische cellichamen zichtbaar onder differential interference contrast verlichting.Adendritische cellichamen vertonen expressie van geel fluorescent eiwit, wat verder aantoont dat in ovo elektroporatie genexpressie kan induceren in specifieke regio's van de auditieve hersenstam voor studies naar de ontwikkeling van auditieve neuronen. Zodra de techniek onder de knie is, en mits deze correct wordt uitgevoerd, kan deze procedure in twee tot drie uur voor ongeveer 12 levensvatbare eieren worden voltooid. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals biochemische, farmacologische en in vitro-in vivo functionele assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe genexpressie-fenotypen de normale ontwikkeling van de auditieve hersenstam reguleren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe genexpressie ruimtelijk en temporeel kan worden gecontroleerd in de auditieve hersenstam van de kip. In ovo electroporatie maakt genetische controle mogelijk van anatomische en fysiologische specialisaties, evenals van duidelijk gedefinieerde tijdsperioden in de ontwikkeling van de auditieve hersenstam.

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Kuiken in ovo electroporatie is een techniek die genetische manipulatie van de aviaire embryo mogelijk maakt. Voorkomende toepassingen van deze techniek zijn functionele analyse van genen en vermeende enhancer elementen. Deze video toont neurale buis elektroporatie in HH 10 kippenembryo's. Injectietechniek en de juiste eierbehandeling worden besproken.

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo&#39;s

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken...

Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

De kip auditieve hersenstam bestaat uit de kernen die verantwoordelijk is voor de binaurale geluidsbewerking. Een enkele coronale slice voorbereiding onderhoudt het hele circuit, terwijl de gekweekte aanpak biedt een unieke voorbereiding op de ontwikkeling van neuronale structuur en auditieve functie bestuderen op moleculair, cellulair en netwerk niveau.

Voorbereiding en Cultuur van Chicken Auditieve Brainstem Slices

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Het gehoororgaan is betrokken bij het gehoor. Hier presenteren we een aangepaste in ovo micro-elektroporatiemethode, geoptimaliseerd voor het bestuderen van de proliferatie en differentiatie van auditieve stamcellen in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip.

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van niet-coronale auditieve hersenstamschijfjes van het kippenembryo voor het onderzoek naar tonotopische eigenschappen en ontwikkelingstrajecten binnen één hersenstamsegment. Deze segmenten omvatten sagittale, horizontale en horizontale / transversale secties die grotere tonotopische gebieden omvatten binnen een individueel segmentvlak dat de traditionele coronale secties omvat.

Snijden van de embryonale kip auditieve hersenstam om tonotopische gradiënten en microcircuits te evalueren

We hebben standaard auditieve hersenstamrespons (ABR) technieken gebruikt en toegepast op broedkippen, een vroegrijp vogelmodel voor auditieve functie. Het protocol schetst diervoorbereidings- en ABR-acquisitietechnieken in detail, met stappen die zich kunnen vertalen naar andere vogel- of knaagdiermodellen.

Evaluatie van auditieve hersenstamrespons bij kippenbroedjes

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Met  behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Leer in ovo-elektroporatie voor ruimtelijke en temporele controle van genexpressie in het kippenauditieve hersenstam. Deze methode helpt onderzoekers auditieve neuronontwikkeling en pathofysiologische fenomenen te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

Meer video's verkennen