Onderzoek naar eiwitsequentie-structuur-dynamiek Relaties met Bio3D-web
16 juli 2017
Een protocol voor het online onderzoek van eiwitsequentie-structuur-dynamiek relaties met behulp van Bio3D-web wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van Bio3D-web is om interactieve analyse mogelijk te maken van de sequentie, structuur en conformationele diversiteit van eiwitfamilies. Bio3D-web is een nieuwe webapp die ons kan helpen de relaties tussen sequentie, structuur en dynamiek binnen grote eiwitfamilies te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van Bio3D-web is dat het interactieve en reproduceerbare online analyses van sequenties, structuren en dynamiek biedt, waarbij geen voorafgaande programmeerkennis van de gebruiker vereist is.
Om een structuur voor analyse in te voeren, verkrijgt u de PDB-ID van adenylaatkinase door in de proteïnedatabase te zoeken. Voer de vier tekens lange PDB-ID voor adenylaatkinase in of plak een eiwitsequentie in het tekstvak van het paneel voor de invoer van de structuur of sequentie. Klik op de blauwe knop 'next hit selection' in het eerste paneel, of scrol simpelweg naar beneden naar paneel B 'hit selection' voor verdere analyse.
Zorg ervoor dat de schuifregelaar voor het maximale aantal inbegrepen structuren op de maximale waarde staat om alle structuren boven de afkapwaarde op te nemen. Verlaag de BitScore-afkapwaarde voor inclusie om meer nauw verwante hits op te nemen of verhoog deze om ze uit te sluiten. Controleer of de geselecteerde hits relevante structuren vertegenwoordigen door details in de tabel te inspecteren, zoals de PDB-naam, soort en gebonden liganden.
Klik op het tabblad align om sequentie-alignment uit te voeren van de geselecteerde structuren uit het tabblad search. Er is een mogelijkheid dat er alignment-fouten optreden, vooral bij het analyseren van meer afgelegen verwante eiwitten, zoals wanneer de sequentie-overeenkomst onder de 30% ligt. Controleer en corrigeer altijd de sequentie-alignment in het tabblad align. Bekijk de samenvatting van de alignment in paneel A alignment summary.
Zorg ervoor dat de regio's van interesse zijn uitgelijnd en niet worden gemaskeerd door gaten in één of meer structuren. Klik op de blauwe knop 'next analysis' om een op sequenties gebaseerde clusteringanalyse van de verzamelde structuren uit te voeren. Klik vervolgens op de blauwe knop 'next conservation' om de residue-conservatie per kolom te berekenen.
Selecteer de sets uitgelijnde structuren om een plot te genereren van de residuconservatie op elke uitlijningspositie. Voer structurele superpositie uit door naar het tabblad 'fit' te gaan. Controleer via visuele inspectie of de proteïnestructuren zijn gesuperponeerd op de corresponderende en relevante regio's.
Klik en sleep met de muis over de structuur om deze te draaien, en scrol om in te zoomen. Pas de kleuring van de structuren aan door op de kleuropties te klikken. Klik vervolgens op de blauwe knop voor de volgende analyse om structuurgebaseerde clustering van de verzamelde PDB-structuren uit te voeren.
Schakel de RMSD-heat map in het vervolgkeuzemenu van de plotopties in. Klik op de blauwe nest RMSF-knop om de structurele variabiliteit van elk residu te bekijken, waarbij de belangrijkste secundaire structurele elementen in de marginale regio's van de X-as worden weergegeven. Voer een hoofcomponentenanalyse uit door naar het PCA-tabblad te gaan.
Om de hoofdcomponenten te visualiseren, vinkt u het vakje 'toon PC-traject' aan om bewegingen die door de hoofdcomponenten worden beschreven te visualiseren met de visualisatietool in de browser. Zorg ervoor dat hoofdcomponent één is geselecteerd in het eerste vervolgkeuzemenu. Om de bewegingen die door andere hoofdcomponenten worden beschreven te visualiseren, kiest u de gewenste PC in het vervolgkeuzemenu 'kies hoofdcomponent'.
Projecteer de individuele structuren op twee geselecteerde PC's door op de blauwe knop voor de volgende plot te klikken. Zorg ervoor dat de PC op de X-as is ingesteld op één en de PC op de Y-as op twee. Om de structuren op andere hoofdcomponenten te projecteren, past u de PC-nummering dienovereenkomstig aan.
Klik op individuele punten in de grafiek om de structuren te labelen. Markeer alternatieve één of meer structuren in de onderstaande tabel PCA conformer plot annotation onder de grafiek. Bereken de residu-bijdragen aan de individuele hoofdcomponenten door op de blauwe knop next residue contributions te klikken.
Plot de bijdragen voor aanvullende hoofdcomponenten door het PC-nummer in het tekstvak voor het kiezen van de hoofdcomponent in te vullen. Klik op het eNMA-tabblad om de berekening van de normaalmodus te starten. Pas het aantal structuren aan door de drempelwaarde voor de inclusie of exclusie van structuren te verlagen of te verhogen.
Klik op de groene knop run ensemble NMA om de berekening van de normaalmodusanalyse te starten. Scroll naar het tweede paneel van het eNMA-tabblad, genaamd normal modes visualization, voor de visualisatie van de normaalmodi. Klik op de blauwe knop next fluctuations om de residu-specifieke fluctuaties van de structuren te berekenen die zijn geselecteerd voor de ensemble-normaalmodusanalyse.
Schakel 'cluster by RMSD' in om de fluctuatieprofielen te kleuren op basis van RMSD-clustering. Vink het vakje 'spread lines' aan om de gegroepeerde fluctuatieprofielen gescheiden van elkaar te plotten. Klik vervolgens op de blauwe knop 'next PCA versus NMA' om de overeenkomst tussen de individuele normale modi en principale componenten te berekenen.
Klik op de blauwe knop 'volgende' onderaan om een rapport te genereren van de analyseresultaten, de door de gebruiker gedefinieerde invoer en de parameterkeuzes. Het rapport kan worden gedownload in deelbare PDF-, Word- en HTML-formaten. Het rapport bevat ook een link om de analysesessie op een later tijdstip opnieuw te bezoeken, die ook kan worden gedeeld met samenwerkingspartners.
Hier worden de beschikbare PDB-structuren van adenylaatkinase getoond, geprojecteerd op de geïdentificeerde invariante kern. De structuren zijn gekleurd volgens de RMSD-gebaseerde clustering die in het tabblad 'fit' wordt weergegeven. De visualisatie van de hoofdcomponenten is beschikbaar via het tabblad 'PCA' om de belangrijkste conformationele variaties in de dataset te karakteriseren.
Hier wordt de trajectorie die overeenkomt met de eerste hoofdcomponent weergegeven in een buisrepresentatie, waarbij de grootschalige sluitingsbeweging van het eiwit zichtbaar is. Structuren zijn geprojecteerd op hun eerste twee hoofdcomponenten in een conformerenplot, die een laagdimensionale weergave van de conformationele variabiliteit toont. Elk punt of elke structuur is gekleurd volgens door de gebruiker gespecificeerde criteria, in dit geval de resultaten van PCA-gebaseerde clustering.
Normaalmodusanalyse in het eNMA-tabblad suggereert versterkte lokale en globale dynamiek voor structuren in de open toestand in vergelijking met de gesloten toestand. Bio3D-web kan worden gebruikt om sequentie- en structuursets te verkennen en helpt bij het begrijpen van algemene trends binnen de proteïnefamilie van belang binnen enkele minuten. Bio3D-web heeft mij geholpen bij het informeren van de structurele analyse van de kinesine-superfamilie.
Bio3D-web biedt een complete workflow voor volledig aangepast onderzoek naar sequentie-structuur-dynamiekrelaties. Deze workflow biedt functionaliteit voor het in kaart brengen van interconformational relaties met PCA en kwantitatieve vergelijking van lokale en globale dynamiek over grote sets heterogene structuren met behulp van ensemble NMA. Er wordt voorzien dat de meeste onderzoekers Bio3D-web zullen gebruiken om algemene trends in hun eiwitfamilie van belang te begrijpen, wat vervolgens als basis kan dienen voor verdere gespecialiseerde analyses.
Bio3D-web is daarom ontworpen als een instrument voor het genereren van hypothesen met deelbare samenvattingsrapporten waarin alle door de gebruiker gedefinieerde parameters zijn opgenomen. De resultaten van Bio3D-web kunnen ook worden gedownload en zijn volledig compatibel met het Bio3D-R-pakket voor verdere diepgaande analyse. Er zijn tegenwoordig veel structuren beschikbaar voor een gegeven eiwitfamilie, die vaak onder verschillende condities zijn bepaald.
De vergelijking van dit grote aantal structuren kan ons inzicht geven in structurele mechanismen die cruciaal zijn voor hun functie, zoals ligandbinding, katalyse en allosterische regulatie. Bio3D-web is breed toegankelijk en eenvoudig te gebruiken zonder dat er specifieke software-installaties nodig zijn of dat men een nieuwe programmeertaal moet leren. Bio3D-web wordt ondersteund door alle grote browsers.
De volledige broncode en installatie-instructies voor lokale installatie zijn gratis beschikbaar.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het gebruik van Bio3D-web, een webapplicatie die is ontworpen voor de interactieve analyse van eiwitsequenties, structuren en dynamica. Hiermee kunnen onderzoekers relaties binnen grote eiwitfamilies onderzoeken zonder dat hiervoor programmeerkennis vereist is.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Proteïnedynamica
- Bio-informatica
- Structurele biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de relaties tussen eiwitsequentie, structuur en dynamiek is cruciaal voor biologisch onderzoek.
- Bio3D-web faciliteert de analyse van eiwitfamilies via een interactief platform.
- De applicatie maakt reproduceerbare analyses mogelijk zonder dat voorafgaande programmeerervaring vereist is.
- Het ondersteunt diverse analyses, waaronder sequentie-alignment, clustering en principale componentanalyse.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijk instrument te bieden voor het analyseren van eiwitsequenties en -structuren.
- Om het begrip van de conformationele diversiteit binnen eiwitfamilies te vergroten.
- Om onderzoekers in staat te stellen complexe eiwitgegevens effectief te visualiseren en te interpreteren.
Gebruikte methoden
- Invoeren van eiwitstructuren met behulp van PDB-ID's of sequenties.
- Uitvoeren van sequentie-alignement en clusteringanalyse.
- Uitvoeren van principale componentenanalyse (PCA) voor bewegingsvisualisatie.
- Genereren van rapporten in diverse formaten voor delen en verdere analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Bio3D-web maakt gedetailleerde analyse van proteïnedynamiek en -structuur mogelijk.
- Interactieve functies verbeteren de betrokkenheid en het begrip van de gebruiker.
- Normaalanalyse onthult verschillen in dynamiek tussen proteïnetoestanden.
- Visualisatietools helpen bij het karakteriseren van belangrijke conformationele variaties.
Conclusies
- Bio3D-web is een waardevolle bron voor onderzoekers die eiwitfamilies bestuderen.
- Het platform vereenvoudigt complexe analyses, waardoor deze toegankelijk worden voor een breder publiek.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid om meer diverse eiwitanalyses te omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Bio3D-web stelt biofarmaceutische onderzoekers in staat om snel relaties tussen sequentie, structuur en dynamiek binnen eiwitfamilies te verkennen, wat targetvalidatie en mechanische risicobeperking in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door interactieve, reproduceerbare analyses aan te bieden zonder programmeerbarrières, versnelt het de generering van hypothesen en biedt het inzicht voor de verdere ontwikkeling van assays en inspanningen voor lead-identificatie. De tool verhoogt het voorspellend vertrouwen door functionele dynamiek en conservatiepatronen te onthullen die essentieel zijn voor het prioriteren van therapeutisch relevante targets.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert geconserveerde structurele en dynamische kenmerken over homologen heen om functionele sites en allosterische mechanismen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt snelle analyse van eiwitfamilies mogelijk met enkel PDB-ID's of sequenties, waardoor de afhankelijkheid van bio-informatica-expertise wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Brengt relaties tussen conformeren in kaart via PCA om functionele toestanden te onderscheiden die relevant zijn voor ligandbinding of katalyse.
- Operationele waarde: Ondersteunt ensemble normal mode-analyse om dynamiek tussen eiwittoestanden te vergelijken, wat bijdraagt aan mechanistische hypothesen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kaarten van geconserveerde residuen die de selectie van epitopen of het targeten van actieve sites bij het ontwerp van assays kunnen sturen.
- Operationele waarde: Produceert deelbare rapporten met gestandaardiseerde parameters, wat de afstemming tussen teams over structurele inputs voor screeningcampagnes vergemakkelijkt.
- Wetenschappelijke waarde: Onthult dynamische hotspots via analyse van residu-fluctuaties, wat helpt bij het beoordelen van de druggability van het target en de flexibiliteit van de bindingssite.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van structurele superpositie en uitlijning, wat cruciaal is voor consistente assay-resultaten tussen verschillende laboratoria.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt sequentievariaties aan structurele en dynamische veranderingen, wat bijdraagt aan de beoordeling van de relevantie van biomarkers bij ziekte-geassocieerde varianten.
- Operationele waarde: Biedt een continue workflow van analyse op familieniveau tot gespecialiseerde follow-up, waardoor translationele continuïteit wordt mogelijk gemaakt.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt conformationele verschillen tussen functionele toestanden, wat helpt bij de validatie van het werkingsmechanisme.
- Operationele waarde: De resultaten zijn compatibel met Bio3D-R, wat een naadloze overgang naar diepere computationele validatie in preklinische modellen mogelijk maakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Bio3D-web past binnen het continuüm van vroege ontdekking en ondersteunt targetvalidatie via structurele inzichten die bijdragen aan leadidentificatie en preklinische prioritering door mechanistische onzekerheid te verminderen.
- Discovery Biology: Test hypothesen over sequentieconservatie en structurele dynamiek om de targetfunctie te verduidelijken en mechanistische aannames te ontrisken.
- Screening: Bereidt gestandaardiseerde structurele inputs en conservatieprofielen voor die het assay-ontwerp en de gereedheid voor compound-screening verbeteren.
- Analytics: Levert kwantitatieve output, waaronder residue-conservatiescores, projecties van hoofdcomponenten en normale modusfluctuaties voor objectieve vergelijking.
- Translational Research: Verbindt structurele dynamiek aan functionele toestanden, wat de uitlijning van biomarkers en mechanismevalidatie ondersteunt wanneer ziekterelateerde varianten worden geanalyseerd.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar, deelbaar platform voor voortdurende analyse van eiwitfamilies over projecten en teams heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door evolutionair geconserveerde en dynamisch relevante regio's te onthullen.
- Operationele waarde: Elimineert barrières op het gebied van software-installatie en programmering, waardoor brede adoptie door multidisciplinaire teams mogelijk wordt.
- Strategische waarde: Verkort de tijd tot inzicht voor het genereren van structurele hypothesen, wat de kapitaalefficiëntie in projecten in een vroeg stadium verbetert.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets door structurele en dynamische bewijslast te leveren voor go/no-go-beslissingen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist bekendheid met concepten uit de structurele biologie, zoals RMSD, conservering en normale modi, om de resultaten correct te kunnen interpreteren.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid en kwaliteit van PDB-structuren voor de doeleiwitfamilie, wat de toepasbaarheid bij slecht gekarakteriseerde targets kan beperken.
- Vereist overeenstemming tussen teams over structurele afkapwaarden, aligneringsparameters en clusteringmethoden om reproduceerbare vergelijkingen te waarborgen.
- De prestaties kunnen variëren bij grote structurele sets; gebruikers dienen de inclusiedrempels aan te passen op basis van computationele limieten en analytische doelen.
- Het beste geschikt voor het genereren van hypothesen in plaats van definitieve structurele validatie, waarbij follow-up met experimentele of computationele methoden met een hoge resolutie vereist is.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Structure Search and Selection (SEARCH)
6:52
Results: Bio3D-web Analysis of Adenylate Kinase
1:46
Multiple Sequence Alignment Analysis (ALIGN)
2:51
Structure Fitting and Analysis (FIT)
3:52
Principle Component Analysis (PCA)
5:24
Ensemble Normal Mode Analysis (eNMA)
8:01
Conclusion
