Name: Methoden om Cytoplasmatische Foci te classificeren als Mammalian Stress Granules (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer stressgranula identificeren in zoogdiercellen met immunofluorescentie en FISH. Deze methode onderscheidt echte stressgranula van andere cytoplasmatische foci in U-2 OS cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken leden van de Ivanov en Anderson labs voor hun nuttige discussie en feedback over dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [GM111700 en CA168872 naar PA, NS094918 naar PI], het Nationaal Wetenschapscentrum in Polen [verleen UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 naar WS]. WS erkent ook het Ministerie van Wetenschappen en Hoger Onderwijs in Polen (Mobility Plus Programma) en de Pools-Amerikaanse Fulbright Commissie voor hun financiële steun van zijn onderzoek in de VS.

1. Celbereiding <ol><li> Voeg autoklaafde deklagen toe aan 12 putjes van een 24-putjesplaat, zoals aangegeven in figuur 1A ; Dit kan gedaan worden met behulp van een steriele Pasteur pipette die aan een vacuüm is bevestigd om elke deksel op te halen. Trek de deksel aan de zijkant van de put voorzichtig aan om de zuiging los te laten, zodat de deklaag in de put kan vallen. </li><li> Plaat 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarcomacellen per put bij een eindvolume van 500 μl medium. Verplaats de plaat zijkant naar zijkant en omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn. </li><li> Druk voorzichtig op de deklaagjes met een schone P1000-tip om ervoor te zorgen dat de deklaag op de bodem van de put staat en dat er geen bellen onder de deklaag liggen. </li></ol> 2. Stressende cellen <ol><li> De volgende dag, controleer het bord visueel om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verspreid zijn en gelijkmatig samenvloeien over de deklaag, aangezien variaties tussen saMples kan de reproduceerbaarheid van de resultaten nadelig beïnvloeden. Gebruik een 10X-doelstelling op een omgekeerde weefselkweekmicroscoop. </li><li> Voorverhit het medium tot 37 ° C. Vermijd koude of hete media op de cellen, aangezien deze respectievelijk koude schok of warmte schokken veroorzaken. </li><li> Verdun drugs in voorverwarmde media. Voor elke verschillende geneesmiddelconcentratie bereiden 2 putjes die 500 μl medium bevatten. Bereid nog eens 500 μL voor verlies tijdens pipettering. Aliquot 4 buizen, die elk 1,5 ml bevatten. <ol><li> Voor natriumarseniet: Voeg bij elke bron die 500 μL bevat 1,5 μL 100 mM natriumarseniet (eindconcentratie: 100 μM) toe of voeg 0,75 μl 100 mM natriumarseniet (eindconcentratie: 50 μM) toe. </li><li> Voor vinorelbine: voeg bij elke bron die 500 μL bevat 22,5 μL 10 mM vinorelbine (uiteindelijke concentratie: 150 μM) toe of voeg 18,75 μl 10 mM vinorelbine (eindconcentratie: 100 μM) toe. OPMERKING: Natriumarseniet<html> Is een goed gekenmerkt en veelgebruikte stressgranulaatinducer en wordt daarom klassiek gebruikt als een positieve controle. </li></ol></li><li> Verwijder en verwijder het medium uit de putten B1 - 4 en C1 - 4. Voeg de media met drugs en wacht ongeveer 60 minuten (Figuur 1A). <ol><li> Voeg 500 μl medium met 100 μM natriumarseniet toe aan putten B1 en B2. Voeg 500 μl medium met 50 μM natriumarseniet toe aan putjes B3 en B4. </li><li> Voeg 500 μl medium met 150 μM vinorelbine toe aan putten C1 en C2. Voeg 500 μl medium met 125 μM vinorelbine toe aan putjes C3 en C4. </li></ol></li><li> 30 minuten voor fixatie, behandel de putjes in kolom 2 met 5 μl cycloheximide (1 mg / ml voorraad) en de putten in kolom 4 met 2 μl puromycine (1,25 mg / ml voorraad). Steek de plaat voorzichtig om te mengen voordat u de plaat terug in de 37 ° C-incubator plaatst. </li></ol> 3. Cel Fixatie en Immunofluorescentie Nt &quot;&gt; OPMERKING: Controleer vóór het experiment dat de methanol tot -20 ° C is gekoeld. Maak buffers, inclusief fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 5% normaal paardserum (NHS) in PBS en 4% paraformaldehyde (PFA ) In PBS. <ol><li> Gooi de media weg en doe de putjes af met dekbedjes met PBS. Afhankelijk van de gebruikte medicijnen, kan het belangrijk zijn om de media die medicijnen bevatten, goed te verwijderen; Neem contact op met het lokale veiligheidsbureau voor specifieke instructies. Om efficiënt te wassen, vul een squeeze fles met PBS, snij de tip om een ​​zachte stroom in plaats van een strakke stroom toe te staan ​​en gebruik dit om PBS toe te voegen aan elke put na het aspireren van de originele PBS. </li><li> Bevestig de cellen met ~ 250 μl 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie. Dek de bovenkant van de deklaag volledig af met PFA; 250 μL moet voldoende zijn, maar indien niet, voeg nog meer toe. Vermijd altijd pipettering direct op de dekglazen, aangezien sommige cellen (of stressbehandelingen van cellen) de bijlage kunnen wijzigen en tHij dwingen van pipettering kan de cellen loslaten. </li><li> Verwijder de PFA en verwijder het goed. Neem contact op met het lokale milieucontrole kantoor voor details over het correct verwijderen van paraformaldehyde. </li><li> Voeg ~ 250 μL methanol (-20 ° C) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder zacht grijpen; Dit permeabiliseert en platt de cellen. </li><li> Verwijder en verwijder de methanol en blokkeer de cellen door ~ 250 μl 5% NHS gedurende 1 uur bij RT O / N bij 4 ° C aan te brengen. Neem contact op met het lokale veiligheidsbureau voor milieubescherming voor meer informatie over het correct verwijderen van methanol. </li><li> Voor primaire antilichamen verdund de antilichamen in 5% NHS. OPMERKING: Het gebruik van meerdere SG markers is de sleutel om te bevestigen of de waargenomen granules bona fide SG&#39;s zijn. Het aantal SG markers dat kan worden gebruikt hangt af van de filters die beschikbaar zijn in de microscoop. Als standaard groene, rode en verre rode filtersets beschikbaar zijn, gebruik G3BP1, eIF4G en eIF3b bij een 1/250 verdunning. <ol><lI&gt; Voor dit experiment (12 deklips bij 250 μL elk-Totaal: 3 ml 5% NHS), voeg 12 μL van elk van de volgende: anti-G3BP1, anti-eIF3b en anti-eIF4G toe. Incubeer de primaire antilichamen door middel van een zachte agitatie gedurende ten minste 1 uur bij RT of O / N bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Was de putjes 3x met PBS en incubeer elke was gedurende 5 minuten. </li><li> Voor secundaire antilichamen verdund alle secundaire antilichamen (1/250 verdunning) en Hoechst-kleurstof (1 / 1.000 verdunning) in 5% NHS. <ol><li> Voeg bij dit experiment (12 deklips bij 250 μL elk-Totaal: 3 ml 5% NHS) 12 μL van elk van de volgende: Cy2-Muis, Cy3-Konijn en Cy5-Geit (een 1/250 verdunning van elk ) En voeg 3 μL Hoechst-kleurstof toe. </li><li> Incubeer de dekglazen met de secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij RT. Tijdens deze en de volgende stappen beschermt u de monsters van het licht door de plaat te bedekken met een doos of door het plaatsen van folie boven de weefselkweekschotel. </li></ol></li><li> Was de weDriemaal met PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Monteer de dekglazen op gelabelde glazen glijbanen met montagemedium. Verhit het montagemedium in een warmteblok van 37 ° C gedurende 10 minuten; Dit vermindert de viscositeit en maakt het makkelijker om te pipetten. Met een snij P200 tip, pipet 25 μL montagemedium per deklaag op een glazen glijbaan; 4-8 deksels kunnen op één glazen glijbaan passen, mits de microscoopfase dit toelaat. Gebruik de fijne tang om de deklaag van de put naar de glijbaan over te brengen, zorg ervoor dat u de celzijde op het montagemedium plaatst. Met een schone P200-tip drukt u op de deklaag omlaag. </li><li> Zodra alle deklagen zijn gemonteerd, gebruik gevouwen laboratoriumweefsel om het overmatige montagemedium op te ruimen door het laboratoriumweefsel zeer stevig op de dia te drukken. Gebruik een squeeze-fles met H 2 O om het overmatige montagemedium af te spoelen en herhaal dan de blotting met gevouwen laboratoriumweefsel om het water te verwijderen. </li></ol> 4. Fluorescentie in situ &lt;/ Em&gt; Hybridisatie (FISH) <ol><li> Plate en behandel de cellen met behulp van stappen 1 en 2.1-4 als een gids; Het is alleen nodig om de cellen in kolom 1 te platen, omdat er in het volgende experiment slechts 3 deklips nodig zijn. </li><li> Zorg ervoor dat alle buffers bereid zijn ( dat wil zeggen 4% PFA in PBS, 70% ethanol in water, 2x Zout-Natrium-Citraat (SSC) en 5% NHS), dat de methanol afgekoeld wordt tot -20 ° C en dat De hybridisatieoven wordt opgewarmd tot de juiste temperatuur. </li><li> Voer stappen 3.1-3.3 uit om de cellen te wassen en te repareren. </li><li> Permeabiliseer cellen gedurende 10 minuten bij -20 ° C methanol. </li><li> Verwijder de methanol en incubeer de dekglazen in 70% ethanol. Plaats de plaat bij 4 ° C overnacht. Afdicht de plaat met parafilm om verdamping te voorkomen. </li><li> De volgende dag verwijder de ethanol en rehydrateer de cellen door 500 μL 2x SSC toe te voegen. Incubeer de dekglazen gedurende 5 minuten met zachte agitatie bij RT. </li><li> Verwijder de 2x SSC en voeg 500 toeΜL 2X SSC. Incubeer gedurende 5 minuten onder zachte agitatie. </li><li> Plaats een stuk parafilm plat op de bodem van de hybridisatieoven. Pipetteer 25 μl hybridisatiebuffer op de parafilm voor elke deklaag. Verwijder de deksel van de 24-putjes schotel (op dit punt zijn de dekglazen aan de zijde van de cel) en plaats de deklaagzijde op de hybridisatiebuffer. Doe dit bij 42 ° C of optioneel bij 65 ° C gedurende 15 minuten. OPMERKING: het voltooien van deze stap bij 65 ° C zal cellulaire RNA&#39;s denatureren; Dit kan het signaal verbeteren als het polyA gemaskeerd wordt door interacties met eiwitten. </li><li> Verdun de Biotin-Oligo (dT) sonde (100 ng / μl) in hybridisatiebuffer tot een concentratie van 2 ng / μL; 25 μL per deklaag is voldoende. </li><li> Voor elke deklaag, pipetteer 25 μL hybridisatiebuffer die Biotin-Oligo (dT) op het parafilm bevat. Pak de deklap met tang en pak de rand van de deklap voorzichtig aan op een laboratoriumweefsel om overmaat te verwijderenHybridisatiebuffer. Breng de deklaag over naar de hybridisatiebuffer met Biotin-Oligo (dT); Onthoud de celzijde omlaag te houden. </li><li> Plaats de dekglazen in een hybridisatiebox om de verdamping te beperken. Incubeer de deklagen met Biotin-Oligo (dT) in hybridisatiebuffer gedurende 60 minuten bij 42 ° C. </li><li> Plaats 2x SSC in de hybridiseringsoven om deze toe te staan ​​tot 42 ° C. </li><li> Voeg ~ 500 μL warmte 2x SSC toe aan de putjes in de 24-putschotel en gebruik de pincet om de dekglazen over te brengen naar de put. Incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Herhaal de bovenstaande wasstap twee keer bij 42 ° C en daarna tweemaal bij RT. </li><li> Voltooi stappen 3.5-3.10, zorg ervoor dat u een streptavidine fluorochroom gebruikt om de Biotin-Oligo (dT) in plaats van een conventioneel antilichaam te detecteren. </li></ol> 5. Ribopuromycylatie Assay om de translatiele status te beoordelen <ol><li> Plaat U2OS-cellen op de deklijsten, zoals aangegeven in stap 1, maar alleen een deklip per voorwaarde (hierinGeval, 3 deklagen: niet-behandeld, 100 μM natriumarseniet en 150 μM vinorelbine) ( Figuur 1 A). </li><li> Strescellen die het protocol gebruiken in stap 2, voltooien stappen 2.1-2.4. </li><li> 5 min voor fixatie, voeg 2 μL puromycine (voorraad: 1,25 mg / ml, verdun 2 μL in 500 μl om een ​​uiteindelijke puromycinconcentratie van 5 μg / ml) en 2,9 μl emetine (voorraad: 20 μg / ml; 2,9 μL aan dezelfde oplossing die al het puromycine bevat) aan elke put die 0,5 ml bevat. </li><li> Voltooi stap 3.1-3.10 zoals hierboven aangegeven, met behulp van een anti-puromycine antilichaam (1/1000 verdunning) om puromycine te detecteren. Gebruik ideaal twee andere SG markers in de overige kanalen. </li><li> Bij het kwantificeren van het puromycinesignaal, neem alle afbeeldingen met dezelfde belichting. Kies deze belichting met behulp van het helderste (onbelaste) voorbeeld en neem een ​​zo helder mogelijk beeld zonder verzadiging. OPMERKING: De intensiteit van het anti-puromycine fluorescerende signaal representeertBevat lopende vertaling, als puromycinesubstituten voor een aminozuur, omvat het neusproteïne, en handhaaft de voortijdige beëindiging van het eiwit. </li></ol> 6. Image Acquisition and Analysis <ol><li> Kwantificering van stress granules <ol><li> Om SG&#39;s te kwantificeren, verwerven 3 tot 5 beelden in totaal&gt; 100 cellen per monster met een 40X-doelstelling. Als alternatief kunt u afbeeldingen verkrijgen met andere doelen, maar zorg ervoor dat&gt; 100 cellen per deklaag worden geteld en dat de vergroting groot genoeg is om de korrels duidelijk te visualiseren. Doe dit door de deklip in vijf ruw gelijke gebieden te verdelen en willekeurig een veld uit elke regio te selecteren ( figuur 1B ); Afbeeldingen van hetzelfde veld moeten alle kanalen bevatten om de colocalisatie van markers te beoordelen. </li><li> Zodra alle afbeeldingen zijn verworven, voeg de kanalen samen. Sommige camera software zal dit automatisch doen, terwijl anderen handmatig samenvoegen; Dit kan gedaan worden metImageJ door alle afbeeldingen te openen en vervolgens [Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen]. </li><li> Tel het totale aantal cellen handmatig door het aantal kernen te tellen, met behulp van Hoechst als de kernmarkering. Tel handmatig het aantal cellen dat meer dan twee SG&#39;s per cel bevat. OPMERKING: Als u bijvoorbeeld een samengevoegde driekanaalbeeld met G3BP1 (groen), eIF4G (rood) en Hoechst (blauw) gebruikt, telt u de kernen (of het aantal cellen) met behulp van het blauwe kanaal. Tel dan SG-positieve cellen als die met twee of meer gele foci per cel. De korrels zullen geel verschijnen, zoals groen van G3BP1 en rood van eIF4G verschijnen geel als colocalized. </li><li> Bepaal het percentage cellen die SG positief zijn door de gegevens uit de 3-5 onafhankelijke gebieden te combineren en bereken vervolgens: Aantal SG positief / aantal kernen) * 100 = procent van de SG-positieve cellen </li></ol></li><li> Colocalisatie beoordelen via Line Scan Analysis - Handmatige methode <ol><li> OpenImageJ. Download het gratis van () </li><li> Open de ROI-manager: [Analyseer | Tools | ROI manager ...]. </li><li> Open de samengevoegde afbeelding in ImageJ: [File | Open]. </li><li> Gebruik het regelgereedschap dat in de toolbar ImageJ staat, voeg een regel toe die door een SG gaat, zorg ervoor dat u voor en na de SG opneemt. Voeg deze regel toe aan de ROI manager door op [Add] in het ROI manager venster te klikken. </li><li> Verdeel het samengevoegde beeld in afzonderlijke kanalen om de lokalisatie van elke marker aan de korrel te beoordelen: [Afbeelding | Kleur | Split Channel]; Dit zal het samengevoegde beeld splitsen in drie zwart-wit beelden. </li><li> Zorg ervoor dat de lijn in het zwart-witbeeld is geselecteerd; De lijn is geselecteerd als het in de afbeelding verschijnt. Zo niet, klik in het venster ROI Manager op de regel in het paneel; Dit zal de lijn in blauw in het ROI-beheervenster markeren en de lijn zichtbaar maken op het zwart-witbeeld. Als de lijn nog steeds niet verschijnt, moet u ervoor zorgen dat &quot;alles weergeven&quot; ch isEcked in de ROI manager en klik vervolgens op de lijn in de afbeelding. </li><li> Analyseer de intensiteit van de lijn: [Analyseer | Plot Profiel]; Dit brengt het venster &#39;Plotprofiel&#39; op, die de intensiteit van het signaal over de lijn afbeeldt. </li><li> Klik in het venster &#39;Plotprofiel&#39; op [Lijst], waarin een venster wordt weergegeven dat de ruwe gegevens van de grafiek bevat. Kopieer alle gegevens in dit venster en plak het in een spreadsheet bestand. Hiertoe selecteert u alle gegevens in het venster: [Bewerken | Selecteer alles]. Kopieer de datum: [Bewerken | Kopiëren]. Open een spreadsheet bestand en plak de gegevens: [Edit | Plakken]. </li><li> Voltooi stap 6.2.6 - 6.2.8 voor elk kanaal afzonderlijk. Zorg ervoor dat u het kanaal dat wordt beoordeeld, bijhouden. </li><li> In een spreadsheet genereren u een lijngrafiek van de resultaten. Selecteer de kolommen die gegevens bevatten door op [control] te drukken en op de letter bovenaan elke kolom te klikken. Selecteer dan de lijngrafiek: [Insert | Lijn grafiek]. </li><li> Herhaal deze analyse voor multIple stress granules over meerdere onafhankelijke experimenten. </li></ol></li><li> Colocalisatie beoordelen via Line Scan Analysis - ImageJ Plugin <ol><li> Download en installeer het RGB-profielhulpmiddel van de ImageJ-website (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Als het correct is geïnstalleerd, moet er een rood, groen en blauw (RGB) -pictogram verschijnen in de werkbalk. </li><li> Open de afbeelding ( bijv. Tiff, JPG) in ImageJ: [File | Open]. </li><li> Klik op het RGB-pictogram in de ImageJ-werkbalk. </li><li> Klik en sleep om een ​​lijn toe te voegen die zich uitstrekt via een SG, en zorg ervoor dat u aangrenzende gebieden bevat; Een afbeelding van het histogram verschijnt in een pop-upvenster. </li><li> Sla de gegevens op als een afbeelding: [Bestand | Opslaan als | Tiff]. Als alternatief exporteer en grafeer dan de gegevens in een ander grafisch programma met stap 6.2.8 hierboven. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mRNA+translation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li>
<li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNP+granules%3A+Assembly%2C+function%2C+and+connections+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li>
<li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li>
<li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%2C+P-bodies+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li>
<li>Aulas, A., Van de Velde,, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS%3A+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?</a> Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).</li>
<li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li>
<li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+protein+aggregation+run+amuck%3A+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li>
<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12(2010).</li>
<li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li>
<li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors%3A+role+of+reoxygenation%2C+free+radicals%2C+and+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li>
<li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li>
<li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li>
<li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+%28RPM%29+applied+to+inert+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li>
<li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li>
<li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li>
<li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li>
<li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+binding+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li>
<li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+%28TDP-43%29+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li>
<li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li>
<li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation%2Fdissolution+to+mTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals blijkt uit immunohistologische studies in meerdere ziekten, leidt chronische stress tot de vorming van verschillende intracellulaire foci. Bijvoorbeeld, de meeste neurodegeneratieve ziekten worden gekenmerkt door intracellulaire aggregaten van onoplosbare eiwitten. De aanwezigheid van SG-geassocieerde eiwitten in dergelijke aggregaten is vaak de basis om te concluderen dat dergelijke foci SG&#39;s zijn. Een soortgelijke conclusie wordt ook getekend wanneer SG-markering-positieve cytoplasmatische foci waargenomen w...

Cellen hebben veel mechanismen om te reageren op stress. Sommige reacties vinden plaats op het post-transcriptie niveau en betreffen het reguleren van mRNA translatie en / of stabiliteit 1 , 2 . Stress-gemoduleerde mRNA translatie-arrestatie en afbraak worden geassocieerd met de vorming van specifieke niet-membraancellulaire foci, de meest goed gekenmerkte Stress Granules (SGs) 3 . SG&#39;s zijn cytoplasmatische foci die nontranslaterende mRNP&#39;s concentreren op translationally-arrested cellen die reageren op stress ( bijv. Oxidatie, warmtechok, voedingshongersnood en virale infectie) 4 . Naast niet-translaterende mRNA&#39;s bevatten SG&#39;s vertaalinitiatieffactoren, RNA-bindende eiwitten en verschillende signalering eiwitten 5 . SG&#39;s zijn biomarkers van geremd eiwitvertaling en veranderd RNA-metabolisme en zijn gekoppeld aan celoverleving en apoptose, signaalwegS en nucleaire processen 5 . SG&#39;s zijn dynamische entiteiten, en hun vorming is nauw verbonden met de status van cellulaire vertaling 6 . Ondanks hun schijnbaar solide verschijning, schuiven de meeste SG-eiwitcomponenten snel in en uit, met een verblijftijd van seconden. Terwijl de SG&#39;s enkele minuten tot uren volhouden, zijn de meeste componenten in snelle flux. De remming van translatie-initiatie en de daaruit voortvloeiende demontage van translateerbare polysomen bevorderen de vorming van SG&#39;s; Dus, SG&#39;s zijn in evenwicht met het vertalen van polysomen. Dit polysoom / SG-evenwicht is de sleutel tot het onderscheiden van bona fide SG&#39;s van andere stress-geïnduceerde foci 6 , 7 . Het in stand houden van translatie-initiatie houdt in dat de omzetting van vertaalvaardige pre-initiatiecomplexen die mRNA, translatie-initiatieffactoren (eIF) en 40S ribosomale subeenheden bevatten (s<html> O-genaamde 48S complexen) in translationally stalled complexes (zogenaamde 48S * complexen) die kunnen samenvoegen in SGs 4 , 6 . SG&#39;s worden bevorderd door translatoire arrestatie in twee verschillende stappen stroomopwaarts van 48S complexe vorming: interferentie met de functies van het cap-binding eIF4F-complex ( bijv. Gericht op de eIF4A-subeenheid) of fosforylering van de a-subeenheid van translatie-initiatieffactor eIF2, gemedieerd door één Of meer van de vier eIF2 kinasen. De aanwezigheid van opgezette 48S complexen ( dwz 40S ribosomale subeenheden en geselecteerde translation initiatie factoren) is een kenmerk van SGs 8 , 9 . SG&#39;s zijn gekoppeld aan verschillende pathologische toestanden, zoals virale infecties, neurodegeneratie, auto-immuniteit en kanker 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Gemuteerde vormen van verscheidene SG-componenten zijn geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten ( bijv. Amyotrofische laterale sclerose) waarin neuronen intracellulaire pathologische inclusies laten zien die actieve rollen kunnen spelen bij de neuronale dood 13 . Sommige virussen kapen SG-componenten om SG-vorming te remmen en virale replicatie te verbeteren 14 . Recente studies koppelen ook SG&#39;s aan kanker 15 en het overleven van kankercel onder chemotherapie en radiotherapiebehandelingen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Hoewel dergelijke bevindingen grote belangstelling hebben voor de SG-biologie, ontbreken veel van de gepubliceerde rapporten belangrijke controles om de vorming van bona fide SG&#39;s van andere stress-geïnduceerde foci te onderscheiden. SG&#39;s werden aanvankelijk beschreven als niet-membraan cytoplasmatische foci samengesteld uit geselecteerde mRNA-bindende eiwitten (RBP&#39;s), waaronder T-cel ntracellulaire antigeen 1 (TIA-1) en poly-A-bindend eiwit (PABP); Vertaling initiatief factoren; Polyadenyleerde mRNA; En kleine ribosomale subeenheden 4 , 6 , 21 , 22 . Traditioneel is hun samenstelling bepaald door technieken zoals immunostaining en de ectopische expressie van fluorescent gelabelde eiwitten 23 , 24 . Vanwege hun zeer dynamische aard blijft de immunolocalisatie van SG-eiwitten en / of mRNA&#39;s de bepalende methodologie voor het detecteren van SG&#39;s 23 , 24 . Tot op heden worden veel RBP&#39;s en andere eiwitten (meer dan 120 afzonderlijke eiwitten) beschreven als SG-componenten 11 . Zoveel SG-gelokaliseerde eiwitten veranderen hun lokalisatie op zowel stressafhankelijke als onafhankelijke wijze en kunnen zich ophopen bij andere intracellulaire compartimenten en foci. Het is belangrijk om juiste SG-markers te kiezen en functionele criteria te gebruiken om SG&#39;s te onderscheiden van andere soorten stress-geïnduceerde brandpunten. Bona fide SG&#39;s bevatten mRNA, translatie initiatief factoren en kleine ribosomale subeenheden en zijn in dynamisch evenwicht met vertaling. Deze eenvoudige workflow is ontworpen om te bepalen of stress-geïnduceerde foci bona fide SG&#39;s zijn. Deze workflow bevat verschillende experimentele benaderingen met behulp van U2OS-cellen, cellen die vaak gebruikt worden om SG&#39;s te studeren. Deze cellen zijn ideaal, omdat ze een groot cytoplasma hebben, zijn relatief vlak en hechten sterk aan glazen deklagen. Andere celtypen kunnen gebruikt worden om SG&#39;s te studeren, maar het is belangrijk om zich ervan bewust te zijn dat verschillen in timing, drugconcentratie en overvloed van SG-nucleerende eiwitten de kinetiek en het compo kunnen veranderensitie. Daarnaast reageren sommige cellen op paraformaldehydefixatie door het vormen van celoppervlakken te vormen, waardoor er een ruche verschijning is die de punctale lokalisatie van sommige SG markers veroorzaakt; Zonder zorgvuldige analyse kunnen deze worden gemeld als SG&#39;s. Dit wijst op de noodzaak om alle criteria die nodig zijn om stress-geïnduceerde foci te identificeren als bona fide SG&#39;s te beoordelen. Vinorelbine (VRB), een kankertherapeutisch die SGS 20 bevordert, alsmede Sodium Arsenite (SA), een robuuste en goed gekenmerkte SG-inducer, worden gebruikt als stress voor de experimenten in dit protocol. Canonische SG&#39;s bevatten meerdere SG markers (zowel eiwitten als mRNA&#39;s) die zich in cytoplasmatische foci colocaliseren. Dit protocol gebruikt zowel immunofluorescentie als fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de lokalisatie van eiwitmarkers en polyadenyleerde mRNA 22 te detecteren. In het kort gebruikt indirecte immunofluorescentie antilichamen ( i.e. Primaire antilichamen) die specifiek zijn voor een bepaald eiwit om het in de cel te detecteren. Daarna herkennen secundaire antilichamen (meestal speciesspecifieke) die aan fluorochromen zijn gehecht het primaire antilichaam en onthullen de lokalisatie van de target eiwit. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om het gelokaliseerde signaal binnen de cel te detecteren. Door gebruik te maken van antilichamen die in verschillende soorten worden geproduceerd en ze te detecteren met anders gekleurde secundaire antilichamen, kan de detectie van de colocalisatie van meerdere antilichamen worden aangetoond, aangeeft dat hun eiwitdoelstellingen op dezelfde locatie gevonden worden 23 . Het is belangrijk om markers te selecteren die zijn geverifieerd om te colocaliseren bij bona fide SG&#39;s. FISH maakt gebruik van een gelabelde sonde die baseert op een specifieke RNA- of DNA-sequentie 25 . Om mRNA te detecteren, gebruikt dit protocol een biotinyleerde oligo (dT) 40 probe die hybridiseert (of basisparen) aan de polyA-staart van mRNA ( dat wil zeggen polyA FISH). De biotinyleerde probe wordt dan gedetecteerd met behulp van fluorescent geconjugeerde streptavidine, aangezien streptavidine een hoge affiniteit voor biotine heeft. Bij het beoordelen van SG&#39;s is het belangrijk om polyA FISH te koppelen aan immunofluorescentie die een SG-marker detecteert, zoals bij bona fide SG&#39;s, de twee signalen moeten colocaliseren. Met behulp van dit protocol wordt colocalisatie op meerdere manieren beoordeeld. In een multi-kanaal ( dwz RGB: rood, groen en blauw), zal colocalisatie de kleur van het overlappende signaal wijzigen ( bijv. Gekolokaliseerd rood en groen verschijnen geel) 23 . Daarnaast wordt colocalisatie grafisch gekwantificeerd met behulp van line scan analyse, waarbij de intensiteit van elke kleur wordt gemeten over een bepaalde lijn 8 , 20 . Dit protocol beschrijft twee line scan analyse procedures met behulp van ImageJ 26 . Eén procedure is handmatig en gaat door het hele procesDe andere maakt gebruik van een macro, of een eenvoudig programma dat de handmatige stappen automatiseert. Het is belangrijk om door de handleiding te gaan om de macroprocedure te begrijpen. SG&#39;s vormen in cellen waar de vertaling wordt onderdrukt; Daarom moeten cellen met SG&#39;s verlaagde niveaus van globale vertaling vertonen in vergelijking met onbehandelde cellen. Experimenteel wordt ribopuromycylering gebruikt. Puromycine en emetine worden gedurende een korte duur voorafgaand aan fixatie aan cellen toegevoegd, waardoor de puromycine in actieve vormende polypeptiden kan worden opgenomen, waardoor terminatie 27 , 28 wordt veroorzaakt. Behandeling met emetine is nodig om herinitatie te voorkomen 29 . Puromycine kan dan worden gedetecteerd met anti-puromycine antilichaam, waardoor een momentopname van actieve vertaling wordt gegeven. Deze methode wordt gebruikt omdat het snel is, hoeft niet te verhongeren met een medium dat geen bepaald aminozuur heeft (en mogelijk de cellen voorspannen) en onthult deSubcellulaire lokalisatie van eiwitvertaling. Andere methoden, met name door gebruik te maken van gemodificeerde aminozuuranaloga, zoals het methionine-analoog L-azidohomoalaïne (AHA), gekoppeld aan &quot;click-it&quot; chemie 30 , zijn gebruikt om aan te tonen dat cellen die SG&#39;s bevatten, veel lagere vertaling vertonen dan naburige cellen 31 . Deze techniek vereist echter methionine-hongersnood gevolgd door puls-etikettering gedurende 15-30 minuten. Methionine-hongersnood vormt een extra stress, terwijl de lange etiketteringstijd ( dwz 15-30 minuten) resulteert in de meting van cumulatieve in plaats van lopende vertaling, en laat ook de nieuw gesynthetiseerde eiwitten van hun syntheseplaats verplaatsen naar hun uiteindelijke bestemming binnen de cel. Daarentegen is ribopuromycylering veel sneller en is verenigbaar met elk medium, zoals het glucosevrije medium dat wordt gebruikt om SG&#39;s te induceren via glucosestoornis. Canonische SG&#39;s zijn in dynamisch evenwichtMet het actief vertalen van polysomen. Dit kan experimenteel worden beoordeeld door monsters te behandelen met de geneesmiddelen die polysomen stabiliseren of destabiliseren, waardoor het evenwicht tussen SG en polysomen 23 wordt afgebroken. Cycloheximide (of emetine, die zich op dezelfde manier gedraagt) blokkeert verlenging door &quot;bevriezing&quot; van ribosomen op mRNA, waardoor het pool van beschikbare niet-polysomale mRNP&#39;s die SG&#39;s kunnen vormen, verminderen. Experimenteel kan dit op twee manieren worden gebruikt: door het toevoegen van cycloheximide (of emetine) vóór stress om SG-vorming te voorkomen of door cycloheximide (of emetine) toe te voegen nadat de SG&#39;s hebben gevormd, zelfs zonder het stressmiddel te verwijderen, waardoor SG-demontage wordt veroorzaakt Preinitiatie complexen worden langzaam toegelaten in de polysoomfractie. In tegenstelling hiermee veroorzaakt puromycine vroegtijdige beëindiging en bevordert polysoom demontage, waardoor het pool van initiërende mRNA&#39;s die in staat zijn om in SG&#39;s te assembleren, verhogen. Experimenteel verhoogt de behandeling met puromycine het aantal SG&#39;s of verlaagt de thresolD waarbij ze vormen in reactie op gegradeerde stress of drugs dosering. Bij het beoordelen van het effect van puromycine is het belangrijk om een ​​submaximaal niveau van het geneesmiddel van belang te gebruiken, aangezien puromycine naar verwachting het effect van het geneesmiddel verhoogt en het percentage cellen dat SG&#39;s toont, verhoogt - dit kan niet optreden als het geneesmiddel / Stress veroorzaakt in eerste instantie SG&#39;s in 100% van de cellen. Dit komt in tegenstelling tot cycloheximide behandeling, die SG&#39;s demontert en het beste werkt wanneer ~ 95% van de cellen SG&#39;s eerst laat zien, zodat de grootste mogelijke daling waargenomen en nauwkeurig gekwantificeerd kan worden. Dit protocol biedt een kader om SG&#39;s in zoogdiercellen te bestuderen. Methoden omvatten: (1) immunofluorescente kleuring en ImageJ analyse om de colocalisatie van de klassieke SG-geassocieerde markers eIF4G, eIF3b en Ras GTPase-activerend eiwitbindend eiwit 1 (G3BP1) in vermoedelijke SG&#39;s te beoordelen; (2) oligo (dT) fluorescentie in situ hybridisatie (polyA FISH) om polyadenyleerde mRNA te detecteren; (3) cycloheximide en puromycine behandeling om te bepalen of stress-geïnduceerde foci in dynamisch evenwicht met polysomen zijn; En (4) ribopuromycylering om de translatorische status van cellen die putatieve SG&#39;s bevatten te beoordelen. Samen kunnen deze analyses bepalen of stress-geïnduceerde foci kan worden ingedeeld als bona fide SG&#39;s.

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg;HTB-96&trade;</td><td>Vaak geschreven als "U2OS" Cultuur bij 37 &deg;C onder 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Bevat 4,5 g/L glucose, pyruvaat en fenolrood Aangevuld met 10% FBS, 10 mM HEPES en penicilline/streptomycine Warm vooraf de drug(s) op</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Wordt gebruikt om media aan te vullen</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Wordt gebruikt om media aan te vullen</td></tr><tr><td>penicilline streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Wordt gebruikt om media aan te vullen</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>lab tissues (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoclaved voor gebruik Houd steriel in de weefselkweekkap</td></tr><tr><td>Sodium (meta)arsenite &ge;90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Los op in water tot 1 M concentratie, verdun vervolgens tot 100 &micro;M als werkstock</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Los op in water tot 10 mM</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Wordt gebruikt om translatieniveau te beoordelen (ribopuromycylatie) -Wordt gebruikt om SG-verbinding met actieve translatie te beoordelen Verdun in water tot 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Emetine dihydrochloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Wordt gebruikt in combinatie met puromycine om het algemene translatieniveau te beoordelen Wordt gebruikt om SG-verbinding met actieve translatie te beoordelen -Verdun in water tot 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Wordt gebruikt om SG-verbinding met actieve translatie te beoordelen Verdun in water tot 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Wasbuffer voor immunofluorescentie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Maak een 4% oplossing in heet PBS in een afzuigkap, roer tot opgelost Deeltjes kunnen gedurende enkele maanden bij -20 &deg;C worden bewaard Gevaarlijk, gebruik ventilatie Gooi weg in speciaal afval</td></tr><tr><td>Methanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Koel vooraf tot -20 &deg;C voor gebruik Gooi weg in speciaal afval</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Verdun tot 5% in PBS Voeg natriumazid toe voor opslag bij 4 &deg;C Blocking oplossing voor immunofluorescentie</td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Verdun tot 70% met water</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C 1/100 verdunning</td></tr><tr><td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C 1/250 verdunning</td></tr><tr><td>goat anti eIF3&eta; (N-20) antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; is ook bekend als eIF3b Bewaar bij 4 &deg;C 1/250 verdunning</td></tr><tr><td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C 1/1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstitueer in water volgens de instructies van de fabrikant en bewaar vervolgens bij 4 &deg;C 1/250 verdunning</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstitueer in water volgens de instructies van de fabrikant en bewaar vervolgens bij 4&deg;C 1/2.500 verdunning</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstitueer in water volgens de instructies van de fabrikant en bewaar vervolgens bij 4&deg;C 1/250 verdunning</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 oplossing</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incubeer met secundaire antilichamen Stockoplossing 0,5 mg/mL in dH20, bescherm tegen licht -Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstitueer in water volgens de instructies van de fabrikant, bewaar vervolgens bij 4 &deg;C 1/250 verdunning</td></tr><tr><td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstitueer in water tot 100 ng/mL, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 &deg;C Verdun in hybridisatie buffer 1/50 voor gebruik Aangepast orderen</td></tr><tr><td>hybridisatiebox</td><td>/</td><td>/</td><td>Maak een vochtkamer met een opslagschuiflade door vochtig papier op de bodem toe te voegen - Verwarm de box voor gebruik vooraf</td></tr><tr><td>20x SSC buffer</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Verdun tot 2x SSC met RNase Vrij water (DEPC behandeld) Bewaar bij RT Was buffer voor FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Hybridisatie Buffer</td><td>Sigma</td><td>

methoden om cytoplasmatische foci te classificeren als mammalian stress granules

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cellen worden vaak uitgedaagd door plotselinge omgevingsveranderingen. Stress Granules (SG&#39;s), cytoplasmatische ribonucleoproteïne complexen die zich vormen in cellen blootgesteld aan stressomstandigheden, zijn betrokken bij diverse aspecten van celmetabolisme en overleving. SG&#39;s moduleren cellulaire signalering pathways, post-transcriptie gene expressie en stress response programma&#39;s. De vorming van deze mRNA bevattende korrels is direct verbonden met cellulaire vertaling. SG-montage wordt geactiveerd door geïnhibeerde translatie-initiatie, en SG-demontage wordt bevorderd door translatieactivering of door geïnhibeerde translatieverlenging. Deze relatie wordt verder onderstreept door de SG-samenstelling. Core SG componenten zijn vertraagde translation pre-initiation complexes, mRNA en geselecteerde RNA-bindende eiwitten (RBP&#39;s). Het doel van SG-assemblage is om cellulaire energie te behouden door translationally stalled housekeeping mRNAs te sequesteren, waardoor de versterkt translatie van stress-responsieve eiwitten mogelijk is. In additiOp de kerncomponenten, zoals vertraagde translation preinitiation complexes, bevatten SG&#39;s een overvloed aan andere eiwitten en signaalmoleculen. Defecten in de SG-vorming kunnen de cellulaire aanpassing aan stress verminderen en kunnen dus de celsterfte bevorderen. SG&#39;s en soortgelijke RNA bevattende granules zijn gekoppeld aan een aantal humane ziekten, waaronder neurodegeneratieve stoornissen en kanker, wat leidt tot de recente interesse in het classificeren en definiëren van RNA-granulatubtypen. Dit protocol beschrijft analyses om zoogdieren SG&#39;s te karakteriseren en te kwantificeren.

Stress-geïnduceerde foci zijn niet noodzakelijkerwijs SG&#39;s. SG&#39;s zijn geclassificeerd als cytoplasmatische foci die mRNAs, translatie-initiatieffactoren en RNA-bindende eiwitten bevatten en in evenwicht zijn met actieve vertaling. Bovenstaande protocol kan gebruikt worden als een sjabloon om te karakteriseren of een bepaalde spanning bona fide SG&#39;s induceert. SG&#39;s colocaliseren met andere bekende SG ma...

Stress Granules (SG&#39;s) zijn niet-membraan cytoplasmatische structuren die in cellen vormen die blootstaan ​​aan een verscheidenheid aan stressen. SG&#39;s bevatten mRNA&#39;s, RNA-bindende eiwitten, kleine ribosomale subeenheden, vertaalgerelateerde factoren en diverse cel signalerende eiwitten. Dit protocol beschrijft een workflow die gebruik maakt van verschillende experimentele benaderingen om bona fide SG&#39;s te detecteren, karakteriseren en kwantificeren.

Methoden om Cytoplasmatische Foci te classificeren als Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Het algemene doel van deze workflow is om vast te stellen of foci die in het cytoplasma zijn geïdentificeerd, bona fide stressgranules zijn; dit zijn RNA-granules die een belangrijke rol spelen in de celphysiologie. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat deze alle fundamentele eigenschappen van stressgranules test. Hoewel deze workflow wordt gepresenteerd voor menselijke osteosarcoom U-2 OS-cellen, kan deze ook worden toegepast op andere typen cellijnen en primaire cellen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode er moeite mee hebben, omdat niet alle stress-geïnduceerde foci stressgranules zijn. Onze workflow omvat alle experimenten die nodig zijn om deze van elkaar te onderscheiden. Ik zal deze procedure demonstreren met Anais Aulus.Wij zijn postdoctoraal onderzoekers in het laboratorium van Paul Anderson en Pavel Ivanov. Begin met het uitplaten van cellen op dekglasplaatjes in 24-wells platen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Na een incubatie van een nacht wordt het kweekmedium uit wells B1 tot B4 en van C1 tot C4 van de 24-wells plaat afgezogen.Voeg 500 µL van het medium aangevuld met 100 µM natriumarseniet toe aan wells B1 en B2, en voeg vervolgens 500 µL van het medium aangevuld met 50 µM natriumarseniet toe aan wells B3 en B4. Voeg daarna 500 µL van het medium met 150 µM vinorelbin toe aan wells C1 en C2. Voeg tot slot 500 µL van het medium aangevuld met 125 µM vinorelbin toe aan wells C3 en C4. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg na 30 minuten incubatie aan de cellen in kolom twee 5 µL van een 1 mg/mL cycloheximide-oplossing toe en aan de cellen in kolom vier 2 µL puromycine van 1,25 mg/mL. Schud de plaat voorzichtig om de oplossingen te mengen en plaats de plaat voor nog eens 30 minuten incubatie terug in de incubator.Om de cellen te fixeren, verwijdert u het medium uit de wells en wast u de cellen met ongeveer 250 microliters PBS. Voeg ongeveer 250 microliters van een gebufferde 4%paraformaldehyde-oplossing toe om de cellen te fixeren, waarbij u ervoor zorgt dat de bovenkant van het dekglas volledig bedekt is. Laat de plaat vervolgens 15 minuten op een bench rocker bij kamertemperatuur staan.Verwijder vervolgens het paraformaldehyde en voer dit op de juiste wijze af. Voeg ongeveer 250 µL ijskoud methanol toe om de cellen te permeabiliseren en af te vlakken. Incubeer de plaat nog vijf minuten bij kamertemperatuur op een schudplaat.Zodra de permeabilisatie is voltooid, wordt de methanol afgegoten en worden de cellen geblokkeerd door ongeveer 250 microliters blokkeringsbuffer gedurende één uur bij kamertemperatuur toe te voegen. Bereid vervolgens de primaire antilichaamoplossing door 12 microliters van de antilichamen tegen G3BP1 eIF4G en eIF3B toe te voegen aan drie milliliters blokkeringsbuffer. Voeg 250 microliters van de antilichaamoplossing toe aan elke put van de 24-wells plaat.Incubeer de plaat op een schudplatform gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Verwijder na één uur incubatie de antilichaamoplossing en was de cellen gedurende vijf minuten met ongeveer 250 µL PBS. Voeg vervolgens 12 µL Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 en Anti-Goat Cy5 antilichamen samen met drie µL hooks dye toe aan drie mL blokkeringsbuffer om de secundaire antilichaamoplossing te bereiden.Voeg 250 µL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elke well en dek de plaat af om de monsters tegen licht te beschermen. Incubeer de plaat op een schudplatform bij kamertemperatuur gedurende één uur. Wanneer de incubatie is voltooid, wordt de antilichaamoplossing verwijderd en worden de cellen gedurende vijf minuten gewassen met PBS.Verwarm het montagemedium in een warmteblok van 37 °C gedurende 10 minuten om de viscositeit te verlagen. Plaats vervolgens met een vooraf afgesneden 200 µL pipetpunt 25 µL van het montagemedium op een gelabelde glazen objectglas. Verplaats met een fijne pincet het dekglas van de put naar het objectglas, waarbij de bovenkant wordt omgekeerd zodat de cellen naar het montagemedium zijn gericht.Gebruik een schone P200-tip om het dekglas aan te drukken. Zodra alle dekglazen zijn gemonteerd, verwijdert u het overtollige monteermedium door een laboratoriumdoekje stevig tegen het preparaatglas te drukken. Spoel het preparaatglas daarna af met water.Dep de cellen onmiddellijk opnieuw met laboratoriumpapier. Permeabiliseer de gefixeerde cellen door ze 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 250 µL ijskoud methanol. Voeg vervolgens ongeveer 250 µL 70% ethanol toe aan de lege putjes van de plaat en verzegel de plaat met parafilm om verdamping te voorkomen.Incubeer de plaat een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder na de nachtelijke incubatie de ethanol en rehydrateer de cellen door 500 microliters 2XSSC toe te voegen. Incubeer de dekglasjes vijf minuten op een schudplaat bij kamertemperatuur.Gooi vervolgens de oplossing weg en voeg opnieuw 500 µL SSC toe. Incubeer de plaat nog eens vijf minuten onder zachte agitatie. Leg daarna een laag parafilm op de bodem van een hybridisatieoven en pipetteer 25 µL hybridisatiebuffer daarop.Breng het dekglas over vanuit de 24-well plaat, waarbij de bovenkant wordt omgekeerd zodat de cellen naar de hybridisatiebuffer zijn gericht. Incubeer de dekglazen gedurende 15 minuten bij 42 °C. Pipetteer 25 µL van een biotinyl-oligo dT-oplossing op de Parafilm in de hybridisatieoven.Pak vervolgens met een pincet het dekglas op en dep de rand tegen een laboratoriumdoekje om overtollige hybridisatiebuffer te verwijderen. Breng het dekglas over naar de biotin-oligo dT-oplossing, waarbij u erop let dat de cellen naar beneden zijn gericht, en incubeer dit gedurende 60 minuten bij 42 °C. Zodra de hybridisatie is voltooid, voegt u ongeveer 500 µL voorverwarmde 2XSSC toe aan de putjes van de 24-well plaat.Breng vervolgens met een pincet het dekglas over naar de well en incubeer dit 10 minuten bij 42 degrees Celsius. Nadat de cellen verder zijn gekleurd met de antilichaamoplossing, worden de monsters bekeken met een fluorescentiemicroscoop. Hier worden beelden getoond van de onbehandelde U-2 OS-cellen die geen granula of foci bevatten die zijn gekleurd met de stress-granule-markers G3BP1, eIF4G en eIF3B.In U-2 OS-cellen die behandeld waren met natriumarseniet of vinorelbine werd de vorming van cytoplasmatische foci geïnduceerd die G3BP1, eIF4G en eIF3B bevatten. De co-lokalisatie van deze markers werd bevestigd door line-scananalyse per kanaal bij een vergroting, gevolgd door superpositie van de verkregen grafieken. Daarnaast bevatten de cytoplasmatische foci die in de behandelde cellen werden geïdentificeerd mRNA, zoals aangetoond door poly A FISH.Het oligo dT-signaal colokaliseerde met het G3BP1-signaal, wat de identiteit van de stressgranules bevestigde. Zodra de methode onder de knie is, kan deze volledige workflow in drie dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u immunofluorescentie en fluorescente hybridisatie uitvoert.Stappen die cruciaal zijn voor de correcte karakterisering en identificatie van stressgranules. Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde uiterst gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van PBM en adequate ventilatie, moeten altijd worden toegepast bij het uitvoeren van deze procedure.

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Vonaesch, P. et. al., Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the infection of epithelial cells with the pathogenic bacterium Shigella flexneri and the resulting host cellular response. Bacterial effector proteins disrupt host translation, triggering the formation of membrane-less organelles called stress granules, which reflect the cell's adaptive response to infection.

Stress Granule Formation During Shigella Infection of Cancerous Epithelial Cells

This video demonstrates an assay for characterizing and quantifying mammalian stress granules, which consist of mRNAs, RNA-binding proteins (RBPs), and various other proteins.

An Immunofluorescence Assay to Characterize and Quantify Mammalian Stress Granules

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Stress korrels (SG) zijn cytoplasmatische RNA korrels die geïnstalleerd ribonucleoproteïnepartikels (RNP), en belangrijk in cellulaire reactie op diverse spanningen. Dynamiek van SG's kunnen in levende cellen worden gevolgd door het visualiseren van de lokalisatie van een gelabeld onderdeel van SG in getransfecteerde primaire cellen na stress.

Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

Het doel van het huidige protocol was om een ​​methode die functioneel genomische analyses van mestcel secretie zal ontwikkelen. Het protocol is gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en real-time analyses van de morfologie van de secretoire korrel's.

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

De sociale amoeben Dictyostelium discoideum is onlangs vastgesteld als een systeem om eiwitmisvouwen en proteostase te bestuderen. Hier beschrijven we een nieuwe op beeldvorming gebaseerde methodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en de cellulaire stressrespons in D. discoideum te bestuderen.

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

We beschrijven een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van stresskorrelvorming in zoogdiercellen nadat de cellen zijn uitgedaagd met bacteriën en een aantal verschillende stressen. Dit protocol kan toegepast worden om de cellulaire stress granule respons te onderzoeken in een breed scala van gastro-bacteriële interacties.

Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen

Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca2 + concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.

Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Leer stressgranula identificeren in zoogdiercellen met immunofluorescentie en FISH. Deze methode onderscheidt echte stressgranula van andere cytoplasmatische foci in U-2 OS cellen.

Methoden om Cytoplasmatische Foci te classificeren als Mammalian Stress Granules

Meer video's verkennen