Name: Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer live-cel beeldvorming van bloedplaatjes onder stroming voor trombose- en hemostaseonderzoek. Deze methode volgt degranulatie en afscheiding in real-time op subcellulair niveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CM erkent financiële steun van de International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht en de Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).

Het lokale medisch ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht heeft de tekening van bloed voor ex vivo onderzoeksdoeleinden, waaronder die van deze studie, goedgekeurd. 1. Oplossingsvoorbereiding <ol><li> Bereid een buffer van 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) Tyrode op door 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2 HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 en 5,55 mM D- Glucose in gedistilleerd water. <ol><li> Maak twee varianten van de buffer: stel de pH niveaus op respectievelijk 6,5 en 7,4 respectievelijk. Maak elke dag een nieuwe buffer voor experimenten. Supplement met 10 ng / mL prostacyclin waar aangegeven. </li></ol></li><li> Berei TRIS-gebufferde zoutoplossing (TBS) op door 50 mM Tris en 150 mM NaCl in gedestilleerd water op te lossen en de pH aan te passen op 9,0. </li><li> Bereiding van zuurcitraatdextrose (ACD) door het oplossen van 85 mM tri-natriumcitraat, 71 mM citroenzuur en 111 mM D-glucose in disBewerkte water. </li><li> Bereid een fixatieve oplossing door 2% (v / v) paraformaldehyde (PFA) toe te voegen aan de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4. Verhit om te oplossen (50 - 70 ° C) en zet de pH op 7.4. Aliquot en opslaan bij -20 ° C. Ontdooien bij 37 ° C voor gebruik. </li><li> Bereid blokkerende buffer door 1% (m / v) humaan serumalbumine (HSA) in HEPES Tyrode&#39;s buffer op te lossen, pH 7,4 </li><li> Maak een polyvinylalcoholoplossing door 4,8 g polyvinylalcohol toe te voegen aan 12 g glycerol en meng goed. Voeg 12 ml gedestilleerd water toe en laat het gedurende een nacht op een rotator staan ​​bij kamertemperatuur. <ol><li> Voeg 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5 toe. Verhit tot 50 ° C tijdens 30 minuten mengen. Voeg 1,25 g 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) toe en meng goed. Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 5 minuten. Aliquot het supernatant (1 ml is voldoende voor 15-20 glijbanen) en opslaan bij -20 ° C. Gebruik de porties een keer. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de glasplaat <ol><li> Ontvetten dekselGlazen (25 x 50 mm 2 ) door in de nacht in onverdund chromosulfurzuur te incuberen. Spoel de dekselglazen af ​​met gedistilleerd water en droog ze nachtelijk bij 60 ° C in een oven. </li><li> Plak een strip van een paraffine film (10 x 15 cm 2 ) boven op een laboratoriumbank met een druppel water en verwijder de lucht door de paraffinefilm te gladden. Pipet 80 μL druppels 10 μg / ml VWF of 100 μg / ml fibrinogeen op de paraffine film. Breng de bril op de druppels; De eiwitoplossing zal zich verspreiden tussen de twee oppervlakken om de hele achterkant van het glas te bedekken. Incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Verwijder de paraffinefilm en sluit de afdekbril door ze te plaatsen, met de gecoate zijde in een 4-putjesplaat met blokkerende buffer. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of &#39;s nachts bij 4 ° C. Als een controle blokkeren u een afdekglas dat niet is bekleed met VWF of fibrinogeen. </li></ol> 3. Bereiding van bloedplaatjesrijk plasma (PRP) </p&gt; <ol><li> Verzamel gehit citroen (eindconcentratie: 0,32% natriumcitraat (M / V)) door venipunctuur. </li><li> Centrifugeer het bloed gedurende 15 minuten bij 160 xg en RT zonder rem. Verzamel de supernatant ( dwz de PRP) met een plastic Pasteur pipette. OPMERKING: Na centrifugatie kunnen drie lagen waargenomen worden (van boven naar beneden): PRP, witte bloedcellen en rode bloedcellen. Zorg ervoor dat de witte en rode cellen niet worden opgenomen. Typisch kan 3 ml PRP worden verzameld na centrifugeren van een 9 ml bloedbuis. </li><li> Ga verder naar sectie 4 als het experiment met gewassen bloedplaatjes wordt uitgevoerd. Als PRP gewenst is, ga door met de volgende stap. </li><li> Na de PRP-collectie centrifugeer de rest van het bloed (met rode celpelletjes) nog 10 minuten bij 2.000 xg zonder rem. Verzamel het supernatant dat het bloedplaatjesarm plasma bevat (PPP). OPMERKING: Typisch kan 2 ml na deze tweede centrifugeringsstap worden verzameld. </li><li> Tel het nummer van de pLateletten in de PRP op een celanalysator en verdunnen met de PPP (stap 3.4) naar een concentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL. OPMERKING: Het totale volume verdund PRP hangt af van de bloedplaatjesgetal van de donor. De bloedplaatjescijfers variëren sterk tussen donoren, en PRP verdunning vereist individueel evaluatie. De bloedplaatjes tellen worden normaal beschouwd als binnen 150.000 en 450.000 bloedplaatjes / μL. </li><li> Ga verder naar sectie 5. </li></ol> 4. Bereiding van gewassen bloedplaatjes <ol><li> Bepaal het gemiddelde bloedplaatvolume (MPV) in de PRP met behulp van een celanalysator. OPMERKING: Dit is een indicator voor bloedplaatjesvooractivering 11 . Een normale MPV voor rustende bloedplaatjes is 7,5-11,5 fL 11 . De MPV moet niet met meer dan 1,5 fL toenemen tijdens de bloedplaatjeswasprocedure. </li><li> Voeg een 1/10 volume ACD toe aan PRP om te voorkomen dat bloedplaatjes vooractiveren en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. Verwijder de suPernatant en zorgvuldig opnieuw pelletten in de buffer van HEPES Tyrode, pH 6,5, op het oorspronkelijke volume PRP. </li><li> Doe een aliquot van prostacyclin op door TBS toe te voegen aan een concentratie van 10 μg / ml; Hou het op ijs. </li><li> Om bloedplaatjesactivering te voorkomen, voeg prostacyclin bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml toe aan de opnieuw gesuspendeerde bloedplaatjes en centrifugeer onmiddellijk gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. Verwijder de supernatant en verwijder de pellet zorgvuldig in de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4. </li><li> Tel het aantal bloedplaatjes (stap 3.5) en bepaal de verandering in MPV (stap 4.1) (de MPV mag niet meer dan 1,5 fL veranderen). </li><li> Pas het aantal bloedplaatjes aan met de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, tot een concentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL. Laat de bloedplaatjes voor 30 minuten bij RT voor de experimenten herstellen. Gebruik gewassen bloedplaatjes voor experimenten binnen 4 uur na isolatie. </li></ol> 5. Samenstelling van de vloerkamer 12 . Een verscheidenheid van in de handel geproduceerde stroomkamers kunnen gebruikt worden, zolang ze een afdekglas kunnen bevatten, welke bij voorkeur verwijderbaar is voor verdere analyses. De stroomkamer die wordt gebruikt voor de beschreven experimenten is gemaakt van poly (methylmethacrylaat) om precies te passen bij een microscoop-invoegtrap. Het bevat een inlaat en uitlaat ( Figuur 1A - C ; 1, 2), evenals een vacuümverbinding ( Figuur 1A en C ; 3). Een op maat gemaakte siliconenplaat ( Figuur 1A en D ; 4) wordt bovenop geplaatst. Twee uitsnijdingen vormen vacuümkanalen ( Figuur 1A en D ; 5) om het afdekglas ( figuur 1A ; 6) stevig aan de kamer te bevestigen. Een centrale uitsnijding vormt het stroomkanaal ( Figuur 1A </strong&gt; En D ; 7; 2,0 mm breedte en 0,125 mm hoogte). De inlaat en de uitlaat zijn aangesloten op het stroomkanaal en het vacuüm is verbonden met het vacuümkanaal. <ol><li> Bedek de bovenkant van de stroomkamer met gedestilleerd water en plaats de aangepaste siliconenplaat met de gladde kant naar beneden op het water. Vloeien het vel in de positie door het overtollige water te verwijderen, terwijl het vel op zijn plaats blijft. OPMERKING: Deze siliconenplaat is opnieuw bruikbaar (siliconen staat bekend om zijn inerte eigenschappen); Over het algemeen zijn bloedplaatjes niet waargenomen om eraan te hechten. De lakens kunnen met reinigingsmiddel worden gereinigd en opnieuw gebruikt worden totdat het materiaal beschadigd raakt ( dwz scheuren, vooral in het gebied tussen kanalen). Over het algemeen kan een vel 20 dagen worden gebruikt met meerdere experimenten per dag. </li><li> Incubeer de stromingskamer gedurende 1 uur bij 60 ° C om het restwater te verdampen om het siliconenplaat stevig vast te houden aan de stromingskamer. </li><li> Met een plastic Pasteur pipette, voeg een druppel vanHEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4, op het stroomkanaal. Plaats het afdekglas (zie sectie 2) met de bedekte zijde naar beneden, op de stroomkanaal. Bevestig de vacuümpomp aan de vacuümaansluiting ( figuren 1A en C ; 3). Dien ~ 10 kPa druk toe. </li></ol> 6. Pre-kleuring van de bloedplaatjes en bereiding van de antilichamen <ol><li> Bloedplaatjes kleuring <ol><li> Incubeer de gewassen bloedplaatjes met 10 μg / ml DAPI gedurende 30 min bij 37 ° C in het donker. Om onbound DAPI te wassen en om bloedplaatjesactivering te voorkomen, voeg prostacyclin toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / mL en onmiddellijk centrifugeer gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. </li><li> Herstel de bloedplaatjespelletjes in de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, tot een bloedplaatjesconcentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL. </li></ol></li><li> Bereiding van antilichamen <ol><li> Meng biotine-gemerkt antilichaam met Alexa-gelabelde strepTavidin bij een molverhouding van 1: 1. Incubeer gedurende minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik (stap 7.6). OPMERKING: De efficiëntie van biotine-etiketten kan variëren tussen verschillende partijen. Mochten er problemen zijn met de visualisatie van doelmoleculen, zouden controle experimenten moeten worden uitgevoerd om succesvolle biotinylatie te bevestigen, evenals de doelbindende eigenschappen van het specifieke biotinyleerde antilichaam. </li></ol></li></ol> 7. Perfusie <ol><li> Start de fluorescentiemicroscoop, evenals de microscoopsoftware. Gebruik de microscoopinstellingen die in tabel 1 zijn vermeld . OPMERKING: Start de microscoop- en opname-instellingen voor de live-cel visualisatie en opname van de bloedplaatjes en de gekozen fluorescent gelabelde antilichamen en / of kleurstoffen door een passend experiment in de microscoopsoftware te laden. Voer flow experimenten uit bij RT. </li><li> Blok de inlaatbuizen door een 10 ml spuit aan de buis te koppelen en 1% HSA bloeien te aspirerenBuffer in de inlaatbuizen. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Spoel de inlaatbuizen door HEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4, in de inlaatbuis te suggen. </li><li> Verbind de geblokkeerde inlaatbuizen en de onbehandelde uitlaatpijp, beide met een diameter van 1,02 mm en een lengte van ~ 20-30 cm naar de inlaat en uitlaat van de kamer. Sluit een 10 ml spuit (of lager volume voor meer nauwkeurigheid) aan op de uitlaatpijp. Zet de spuitpomp aan. OPMERKING: De diameter van de injectiespuit in combinatie met de door de pomp ingestelde stroomsnelheid bepaalt de volumetrische stromingssnelheid. Samen met het oppervlak van het stromingskanaal kan de schuifsnelheid berekend worden volgens de formule 13 hieronder. Het is dus mogelijk om de schuifsnelheid te manipuleren door de stromingssnelheid van de spuitpomp te veranderen of de afmetingen van het stromingskanaal te wijzigen. Een schuifsnelheid van 800-1,600 s -1 typisch modellen voor arteriële bloedstroom, terwijl 25-100 s-1 modellen voor veneuze bloedstroom. Voor deze opstelling resulteert een stromingssnelheid van 7,5 μl / min in een schuifsnelheid van 25 s -1 . Schuifsnelheid = 6Q / h 2 w in s -1 Waarin: Q = volumetrische stroming (ml / s), h = hoogte kanaal (cm) (0,0125 cm, dit is de dikte van het siliconenblad), w = breedte kanaal (cm) (0,2 cm in deze kamer). </li><li> Leg een druppel onderdompelingsolie op een 100x objectief (totale versterking van 1.000X) en plaats de kamer op de microscoop met het glazen oppervlak naar beneden. </li><li> Plaats de toevoerslang in een buis die de buffer van HEPES Tyrode bevat, pH 7,4. Haal de zuiger van de spuit die met de uitlaatpijp is aangesloten, handmatig door en trek de oplossing door de kamer om de lucht van het systeem te verwijderen. Plaats de spuit in de spuitpomp ( Figuur 1B en C ; 8) en draai de pomp kort om de plunjer vast te zetten en stabiliteit te waarborgen. </li><li> Antilichamen en / of kleurstoffen toevoegen aan de bloedplaatjesuspensie of PRP zorgvuldigMeng met een plastic pipet en laat het mengsel overbrengen naar een 1,5 ml buis. OPMERKING: Voor een typische perfusie van 30 minuten bij schuifsnelheid 25 s-1 (7,5 μl / min) is een minimum van 225 μl bloedplaatjesuspensie nodig. De antilichamen die gebruikt worden voor de representatieve resultaten worden getoond in Tabel 2 . </li><li> Verplaats de inlaatbuis, terwijl u uit de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, drukt, naar een 1,5 ml buis die PRP of de gewassen bloedplaatjes en de antilichamen en / of kleurstoffen bevat ( Figuur 1B en C ; 9). OPMERKING: Het is belangrijk dat bij het overbrengen van de buis de buis wordt geperst (druk uit de lucht) om te voorkomen dat lucht in de buis komt. Het is mogelijk om hechtende bloedplaatjes te behandelen met een verscheidenheid van reagentia in een volgende stap door de inlaatbuis op een andere buis op een soortgelijke wijze te verplaatsen. Een lijst van potentieel nuttige reagentia is verschaft in tabel 3 . </li><li> Selecteer de &quot;live visualizatioN &quot;optie in de software, focus de microscoop op het oppervlak van het gecoate dekselglas en start de pomp met een schuifsnelheid van 1.600 s-1 (484 μL / min) tot de bloedplaatjes de stroomkamer bereiken. Op dit moment, Verminder de afschuifsnelheid tot 25 s-1 door de instellingen van de spuitpomp te veranderen tot een stromingssnelheid van 7,5 μL / min. </li><li> Controleer het oppervlak van de gecoate zijde van het afdekglas, wacht tot het eerste plaatje begint te kleven, focus de microscoop op dit plaatje en start met opname door het experiment in de software te starten. Zie tabel 1 voor de opname instellingen die hier worden gebruikt. </li><li> Volg de live opname visueel. Stop na 30 minuten de spuitpomp. OPMERKING: Zorg ervoor dat de bloedplaatjes in de loop van het experiment in focus blijven. Typisch bevestigen 20-30 bloedplaatjes in het zichtveld bij een vergroting van 1000X; Dit is ongeveer 2.000-3.000 bloedplaatjes in het hele stroomkanaal. </li><li> Fixatie met behulp vanDe stroomkamer (optioneel). <ol><li> Wanneer de stroom is gestopt na het stoppen van de spuitpomp, moet u de inlaatleiding (luchtvrij) overbrengen naar de fixatieoplossing. Start de pomp opnieuw op en voer de fixatiebuffer door het kanaal gedurende tenminste 10 minuten bij dezelfde doorvoersnelheid als vermeld in stap 7.8. </li></ol></li><li> Verwijder de kamer uit de microscoop, reinig de onderdompelingsolie uit het glas, ontkoppel het vacuüm en verwijder het dekselglas zorgvuldig uit de kamer met een 18 G-naald. OPMERKING: Voorkom dat het afdekglas het siliconenplaat breekt en beschadigt. </li><li> Plaats de afdekplaat (met de cellen naar boven gericht) in een 4-putjesplaat boven op een weefsel, vooraf bevochtigd met gedestilleerd water. OPMERKING: dit voorkomt dat het afdekglas zich vasthoudt aan het putoppervlak en dat het drogen voorkomt. </li><li> Pipetteer 750 μL fixatieve oplossing bovenop het afdekglas en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Indien de monsters niet direct kunnen worden geanalyseerd,Bewaar ze in 0,5% PFA (verdund met HEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4) bij 4 ° C om stabiele fixatie te waarborgen. Ga verder naar sectie 8 om het afdekglas te verwerken voor beeldvorming. </li><li> Na gebruik, spoel de kamer, buizen en vel met gedestilleerd water en incubeer de nacht in een wasmiddeloplossing. Vóór het opnieuw gebruiken van de kamer en andere onderdelen, spoelen met gedestilleerd water. </li><li> Bewaar de microscoop ruwe gegevensbestanden die alle metagegevens bevatten. Indien nodig, exporteer de films naar .MOV, h.264 gecomprimeerd of .AVI ongecomprimeerd. Sla afzonderlijke frames op als JPEG- of TIF-bestanden. </li></ol> 8. Voorbeeld Bereiding voor Confocal Fluorescentie Microscopie <ol><li> Breng de dekselglazen over naar nieuwe 4-putjesplaten en spoel 5 keer met 3 ml HEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4. Voeg 3 ml / putje blokkerende buffer toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT. </li><li> Verwijder de blokkerende buffer; Voeg 3 ml / putje van 0,15% glycine (M / V) in HEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4; En incubeer gedurende 15 minuten bij RT. </li><li> Verwijder glycineoplossing en was 5 keer in 3 ml / putje blokkerende buffer. Optioneel voeg fluorofore-geconjugeerde antilichamen toe die verdund zijn in blokkerende buffer voor extra kleuring. Incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker. </li><li> Was 5 keer met blokkeerbuffer en 2 keer met gedestilleerd water. Droog het glas door overtollige vloeistof te verwijderen met een weefsel (vanaf de randen naar binnen), zonder de cellen aan te raken. </li><li> Pipet 60 μL polyvinylalcoholoplossing op een microscoopschuif. Leg het dekselglas, met de cellen naar boven, op de druppel en laat de polyvinylalcohol tussen de twee oppervlakken verspreiden. Incubeer &#39;s nachts bij RT in het donker. </li><li> Analyseer de cellen door middel van confocale microscopie 14 . </li><li> Sla de ruwe gegevensbestanden op van de opgenomen stapelgegevens die alle metagegevens bevatten. Indien nodig, verwerk de ruwe gegevensbestanden naar MOV, H.264 gecomprimeerde of .AVI gecomprimeerde bestanden. Sla aparte stapels op als JPEG- of TIF-bestanden. </li></ol>

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+granule+exocytosis%3A+a+comparison+with+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).</li>
<li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li>
<li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li>
<li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules%3A+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li>
<li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+%CE%B1-granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells%2C+their+extracellular+matrix%2C+and+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li>
<li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation%3A+methodological+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li>
<li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li>
<li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules%2C+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome%2C+and+appears+identical+to+granulophysin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li>
<li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li>
<li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control%3A+Alternatives+for+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wereldwijd is trombose een belangrijke doodsoorzaak en morbiditeit, en bloedplaatjes spelen een centrale rol bij de ontwikkeling ervan. Dit werk beschrijft een methode voor de live-celafbeelding van bloedplaatjes degranulatie onder stroming. Over het algemeen wordt aangenomen dat wanneer de bloedplaatjes geactiveerd worden alle korrelvormige inhoud direct in oplossing worden gebracht. De bijbehorende resultaten suggereren dat dit niet noodzakelijkerwijs het geval is. Tijdens adhesie en degranulatie behouden bloedplaatje...

Plateletten zijn anucleate cellen die in de bloedstroom circuleren. Hun belangrijkste functie is om vaatbreuken op plaatsen van letsel te verzegelen en om bloedverlies te voorkomen. Op deze plaatsen van letsel worden subendotheliale collageenvezels blootgesteld en worden ze daarna gedekt door het multimere eiwit, von Willebrand factor (VWF). VWF interactieert met de bloedplaatjes in omloop in een mechanisme dat afhankelijk is van het glycoproteïne Ibα-IX-V complex op het celoppervlak 1 , waardoor de snelheid van de bloedplaatjes wordt vertraagd. Dit is vooral belangrijk bij hoge schuifsnelheden. De bloedplaatjes ondergaan vervolgens morfologische veranderingen terwijl ze activerende impulsen ontvangen van collageen. Dit leidt tot onomkeerbare verspreiding en uiteindelijk tot aggregatie van bloedplaatjes. Beide processen zijn afhankelijk van de afscheiding van de korrelinhoud om transplantatie van bloedplaatjes-bloedplaatjes te vergemakkelijken. Bl.a. bevat plaatjes a-granules fibrinogeen en VWF om de hechting van de bloedplaatjes te ondersteunen en te overbruggenBloedplaatjes samen op integrin-afhankelijke wijze. De bloedplaatjes dichte korrels bevatten anorganische verbindingen 2 , waaronder calcium en adenosine difosfaat (ADP), die bijdragen tot het versterken van de bloedplaatjesactivering. Bovendien bevatten bloedplaatjes mediators van (allergische) ontsteking 3 , complement-controlerende eiwitten 4 en angiogenese factoren 5 , 6 , die de vragen verhogen over of en hoe deze inhoud onder verschillende omstandigheden vrijkomen. Sinds de jaren tachtig is de studie van bloedplaatjesfunctie in stromingsmodellen waardevol geweest voor het onderzoek van trombotische mechanismen 7 . Sindsdien is veel technische vooruitgang geboekt en stromingsmodellen die fibrinvorming bevatten, worden momenteel ontwikkeld om het hemostatische potentieel van therapeutische bloedplaatjesconcentraten ex vivo 8 te bepalen of omOnderzoek de invloed van verstoringen in schuifsnelheden op trombusmorfologie 9 . De verschillen in de moleculaire en celbiologische mechanismen die stabiele hechting en fysiologische trombusvorming (hemostase) vormen tegen de pathologische trombusvorming (trombose) kunnen zeer subtiel zijn en motiveren de ontwikkeling van stromingsmodellen die de real-time visualisatie van deze subcellulaire processen. Een voorbeeld van een proces waarvoor een dergelijke opstelling waardevol zou zijn, is de (her) verdeling van intracellulair polyfosfaat en de aanwerving van stollingsfactoren om de tijdsafhankelijke invloed op dit op fibrine-ultrastructuur 10 te ontdekken. Studies zijn vaak beperkt tot eindpuntanalyses. Het hoofddoel van de beschreven methode is het real-time visuele onderzoek mogelijk maken van dynamische subcellulaire processen die plaatsvinden tijdens de bloedplaatjesactivering onder stroming.

<table><tbody><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostacyclin&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Menzel-Gläser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm dikte.</td></tr><tr><td>Chromosulfuric acid (2% CrO3)</td><td>Riedel de Haën</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Von Willebrand factor (VWF)</td><td>in-house gezuiverd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4 well dish, non-treated</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin Fraction V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td>823022</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser&nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN hematology analyzer</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe met 14,5 mm diameter</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Luer-Lok spuit</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin&nbsp;</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB134331</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62P-biotin&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-Diamidino-2-fenylindoldihydrochloride (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488-conjugaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Detergent solution</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Sheep Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn film</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 inch x 125 ft. Rol.</td></tr><tr><td>Silicone sheet niet-versterkt</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0.125 mm.</td></tr><tr><td>Aangepaste gesneden siliconen sheet met perfusie- en vacuümkanalen</td><td>in-house gemaakt</td><td></td><td>Gemaakt van Silicone sheet niet-versterkt (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>1,5 mL buisjes</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>Uitgerust met LED-excitatieverlichting.</td></tr><tr><td>Microscoop software</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G naald (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haën</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof pasteur pipet</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp;7 mL niet steriel, ingerold tot 3 mL.</td></tr><tr><td>Silicone buis</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Binnendiameter. x Buitendiameter x Wanddikte = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, gemalen randen 45 &deg;, ontdooid eind.</td></tr></tbody></table>

live-cel beeldvorming van bloedplaatjes degranulatie en afscheiding onder stroming

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Bloedplaatjes zijn essentiële spelers in hemostase, de vorming van trombi om vasculaire breuken te verzegelen. Zij zijn ook betrokken bij trombose, de vorming van trombi die de vasculatuur en de verwondende organen afsluiten, met levensbedreigende gevolgen. Dit motivert wetenschappelijk onderzoek naar bloedplaatjesfunctie en de ontwikkeling van methoden om celbiologische processen te volgen als ze zich voordoen onder stromingsomstandigheden. Er zijn verschillende stromingsmodellen beschikbaar voor het bestuderen van bloedplaatjeshechting en aggregatie, twee belangrijke verschijnselen in de bloedplaatjesbiologie. Dit werk beschrijft een methode om real-time bloedplaatjes degranulatie te bestuderen tijdens de stroom tijdens de activatie. De methode maakt gebruik van een stroomkamer gekoppeld aan een spuitpompinstallatie die onder een brede veld, omgekeerde, LED-gebaseerde fluorescentiemicroscoop wordt geplaatst. De hier beschreven beschrijving zorgt voor de gelijktijdige excitatie van meerdere fluoroforen die worden afgeleverd door fluorescent gelabelde antilichamen of fluorescerenEnt kleurstoffen. Na live-cell imaging experimenten kunnen de dekselglazen verder worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van statische microscopie ( dwz confocale microscopie of scan elektronenmicroscopie).

Figuur 1 toont afbeeldingen van de stroomkamer en experimentele opstelling; De positie en afmetingen van het siliciumplaat; En buizenverbindingen. Figuur 2 geeft details over de afmetingen van de stroomkamer. Figuur 3 en Film 1 tonen een tijdsreeks beelden van plaatjeshechting en verspreiden op geïmmobiliseerde VWF. CD63 is een transmembraneiwit dat in het membraan van intracellulai...

Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Het algemene doel van dit experiment is om de degranulatie en secretie van bloedplaatjes onder stroming te volgen met behulp van live-cell imaging. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de bloedplaatjesbiologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een veelzijdige analyse van de inhoud van bloedplaatjes op subcellulair niveau in levende cellen mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de plaatjesfunctie, kan ze ook worden toegepast op andere celtypen, zoals mestcellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren door complicaties bij de isolatie van bloedplaatjes in de vorm van preactivering. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we beseften dat plaatjessecretie alleen in eindstadia kon worden geëvalueerd.Real-time beelden geven informatie over de afgiftekinetiek van de granulaire afgifte van bloedplaatjes. De procedure voor de isolatie van bloedplaatjes wordt gedemonstreerd door Silvia Pignatelli, een student aan ons instituut. Vervolgens zal Arjan Barendrecht de real-time imaging-experimenten demonstreren.Begin met het ontvetten van de dekglasjes door deze een nacht lang te incuberen in onverdund chromosulfurzuur. Spoel ze de volgende dag af met gedestilleerd water. Plaats ze vervolgens een nacht lang in een oven bij 60 °C om ze te laten drogen.Plaats vervolgens een druppel water op een laboratoriumbank en breng een strook paraffinefolie van 10 centimeter bij 15 centimeter aan bovenop de druppel door de lucht tussen de bank en de folie te verwijderen. Pipetteer daarna druppels van 80 µL von Willebrand factor (10 µg/mL) of fibrinogeen (100 µg/mL) op de paraffinefolie. Plaats de droge dekglasjes op de druppels en incubeer deze gedurende anderhalve uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens drie milliliter blokkeringsbuffer toe aan elke put van een plaat met vier putten. Verplaats de dekglasjes met de gecoate zijde naar boven naar individuele putten van de plaat. Incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius.Centrifugeer negen milliliter gecitrateerd volbloed gedurende 15 minuten bij 160 ×g zonder remming. Gebruik vervolgens een plastic Pasteurpipet om het supernatant dat het bloedplaatjesrijk plasma bevat op te vangen. Voeg naar volume één deel zuur citraat-dextrose toe aan negen delen bloedplaatjes om preactivatie van de bloedplaatjes te voorkomen.Centrifuge de bloedplaatjes vervolgens gedurende 15 minuten bij 400 ×g zonder rem. Verwijder daarna het supernatant, zodat een pellet van bloedplaatjes overblijft. Resuspendeer de pellet vervolgens voorzichtig in HEPES Tyrode-buffer bij een pH van 6,5 tot het oorspronkelijke volume van het bloedplaatjesmonster.Voeg vervolgens Prostacycline toe aan de geresuspendeerde bloedplaatjes. Centrifugeer het monster onmiddellijk en verwijder daarna het supernatant. Resuspendeer het pellet voorzichtig in HEPES Tyrode-buffer bij een pH van 7,4.Plaats vervolgens de gewassen bloedplaatjes in een celanalysator en tel het aantal bloedplaatjes. Pas het aantal bloedplaatjes in het monster aan naar een concentratie van 150 000 bloedplaatjes per microliter met HEPES Tyrode-buffer bij een pH van 7,4. Laat de bloedplaatjes na resuspensie 30 minuten herstellen bij kamertemperatuur voorafgaand aan het experiment.Bedek de bovenkant van de flowkamer met gedestilleerd water en plaats een op maat gemaakte siliconenvel met de gladde zijde naar beneden op het water. Laat het vel naar de juiste positie drijven door overtollig water te verwijderen terwijl het vel op zijn plaats wordt gehouden. Incubeer de flowkamer gedurende één uur bij 60 °C om het resterende water te laten verdampen en het siliconenvel stevig aan de flowkamer te laten hechten.Voeg met de plastic Pasteurpipet een druppel HEPES Tyrode-buffer met een pH van 7,4 toe aan het stroomkanaal. Plaats vervolgens het voorbereide dekglas met de gecoate zijde naar beneden op het stroomkanaal. Zet de vacuümpomp aan op een druk van ongeveer 10 kilopascals en sluit de vacuümpomp aan op de vacuümaansluiting van de stroomkamer.Voeg 10 µg/ml DAPI-kleurstof toe aan de gewassen bloedplaatjes en wikkel de buis met de bloedplaatjes in aluminiumfolie. Incubeer deze vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg, om activatie van de bloedplaatjes te voorkomen, prostacycline toe tot een eindconcentratie van 10 ng/ml en centrifugeer de bloedplaatjes onmiddellijk 15 minuten bij 400 ×g zonder gebruik van de rem om ongebonden DAPI te verwijderen.Resuspendeer het bloedplaatjespellet en de HEPES Tyrode-buffer bij een pH van 7,4 tot het oorspronkelijke volume met een concentratie van 150.000 bloedplaatjes per microliter. Zet vervolgens de fluorescentiemicroscoop aan en start de software van de microscoop. Stel de beeldparameters in zoals beschreven in tabel één van het bijbehorende tekstprotocol.Blokkeer de inlaatslang door een spuit van 10 milliliter aan te sluiten en blokkeerbuffer in de inlaatslang op te zuigen. Blokkeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en spoel de inlaatslang vervolgens door HEPES Tyrode buffer 7.4 in de inlaatslang op te zuigen. Sluit de geblokkeerde inlaatslang en de onbehandelde uitlaatslang aan op de inlaat en uitlaat van de kamer.Sluit vervolgens de spuit van 10 milliliter aan op de uitlaatslang. Breng een druppel immersie-olie aan op een 100 keer objectief en monteer de kamer op de microscoop met het glazen oppervlak naar beneden gericht. Plaats daarna de inlaatslang in een buis met HEPES Tyrode-buffer bij een pH van 7.4.Trek handmatig de zuiger van de spuit die aan de uitlaatslang is verbonden, om de oplossing door de kamer te trekken en de lucht uit het systeem te verwijderen. Plaats de spuit vervolgens in de spuitpomp en laat de pomp kort lopen om de zuiger aan te trekken en een stabiele flow te garanderen. Nu het flowsysteem gereed is, worden de antilichamen en/of kleurstoffen aan de plaatjessuspensie toegevoegd en zorgvuldig gemengd.Knijp vervolgens in de toevoerslang en verplaats deze van de buffer naar de buis met de gelabelde bloedplaatjes. Selecteer live-visualisatie in de software. Stel de microscoop scherp op het oppervlak van het dekglas en start de pomp bij 484 microliters per minuut.Zet de pomp aan totdat de bloedplaatjes de stroomkamer bereiken. Verlaag vervolgens de stroomsnelheid naar 7,5 microliters per minuut. Controleer het oppervlak van het dekglas.Zodra de eerste bloedplaatje begint te hechten, richt u de microscoop op dit plaatje en start u de opname door het experiment in de software te initiëren. Neem gedurende 30 minuten op en stop daarna de spuitpomp. Sla de ruwe databestanden van de microscoop op, inclusief alle metadata.Exporteer indien nodig de video's naar MOV H 264 gecomprimeerd of AVI ongecomprimeerd. Sla afzonderlijke frames op als JPEG- of TIF-bestanden. Verwijder na afloop van de beeldvorming de kamer uit de microscoop, maak de immersieolie van het glas schoon, ontkoppel het vacuüm en verwijder voorzichtig het dekglas uit de kamer met een naald van 18 gauge.Plaats het dekglas met de cellen naar boven gericht in een nieuwe plaat met vier putjes, bovenop een weefsel dat vooraf is bevochtigd met gedestilleerd water. Pipetteer vervolgens 750 µL van een fixeeroplossing op het dekglas en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Indien de monsters niet direct geanalyseerd kunnen worden, bewaar deze dan in 0,5% paraformaldehyde bij vier graden Celsius om een stabiele fixatie te garanderen.Dit toont de tijdreeks van plaatjesadhesie en -spreiding op glazen slides gecoat met geïmmobiliseerd von Willebrand-factor. In het groen wordt CD63 getoond, een transmembraaneiwit dat op een tijdsafhankelijke manier naar het plaatjesoppervlak wordt gemobiliseerd. Evenzo wordt in het oranje P-selectine getoond, eveneens een transmembraaneiwit dat in het membraan van intracellulaire alfa-granules is ingebed die plaatjes vasthouden.Na een flow-experiment kan confocale fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om een tilt-serie van de plaatjesadhesie te maken. Hier is te zien dat CD63 zich hoofdzakelijk bevindt bij het centrale granulomeer, terwijl P-selectine over het gehele cellichaam is verdeeld en geconcentreerd lijkt bij de randen. In deze experimenten werden bloedplaatjes, die geen nucleair DNA hebben, gepreïncubeerd met DAPI, wat blauw verschijnt.In dit geval kleurt DAPI de polyfosfaten en dichte korrels. De tijdgebaseerde mobilisatie van CD63 naar het oppervlak van de bloedplaatjes verschijnt later als groene kleuring. Ondanks duidelijke tekenen van de afgifte van dichte korrels, laat analyse van individuele cellen zien dat polyfosfaat behouden blijft in of op de buitenkant van deze bloedplaatjes.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zes uur voor vier individuele flow-experimenten worden uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het essentieel om preactivatie van bloedplaatjes te voorkomen. Dit kan worden bereikt door zorgvuldige manipulatie van de celsuspensie.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale microscopie, worden gebruikt om aanvullend inzicht te verkrijgen in de driedimensionale distributie van doelmoleculen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de bloedplaatjesfunctie onder stroming op enkelcelniveau kan worden bestudeerd.

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen.

Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

We beschrijven een in-oplossing methode om uniforme shear toe te passen op bloedplaatjes oppervlak receptoren met behulp van Cone-plate viscosimeter. Deze methode kan ook breder worden gebruikt om shear toe te passen op andere cel types en cel-fragmenten en hoeft niet te richten op een specifieke ligand-receptor paar.

Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

De vorming van procoagulerende bloedplaatjes is gecorreleerd met een verhoogd risico op trombose. Hier wordt een nauwkeurig protocol gepresenteerd voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, bedoeld om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels te kwantificeren, die onderscheidende kenmerken zijn van procoagulerende bloedplaatjes.

Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes door meting van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes uit menselijke gezuiverde bloedplaatjes

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Meerkleurige flowcytometrie voor bloedplaatjes kan nieuwe subtypes van bloedplaatjes identificeren binnen klassieke subpopulaties van bloedplaatjes, zoals rust-, aggregatoire, procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes. Dit maakt het mogelijk om verschillende subpopulatiepatronen te vergelijken die worden geïnduceerd door verschillende bloedplaatjestagonisten. Hier wordt een procedure voor het opstellen van een meerkleurig flowcytometriepaneel in detail beschreven.

Analyse van subpopulaties van bloedplaatjes door middel van meerkleurige flowcytometrie

Leer live-cel beeldvorming van bloedplaatjes onder stroming voor trombose- en hemostaseonderzoek. Deze methode volgt degranulatie en afscheiding in real-time op subcellulair niveau.

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Meer video's verkennen